שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
נזק לדנ א היא תופעה נפוצה עבור כל תא במהלך תוחלת החיים שלה, מוגדר שינוי של המבנה הכימי של הדנ א. טיפולים בסרטן, כגון רדיו, כימותרפיה, להציג כמות עצומה של נזק לדנ א נוסף, המוביל אפופטוזיס של מחזור התא מעצר כדי להגביל את התקדמות סרטן. הערכה כמותית של נזק לדנ א במהלך טיפול ניסיוני בסרטן היא צעד המפתח כדי להצדיק את האפקטיביות של סוכן genotoxic. במחקר זה, אנו מתמקדים assay אלקטרופורזה תא בודד, ידוע גם בשם השביט וזמינותו, אשר יכולים לכמת יחיד, כפול-גדיל DNA שובר במבחנה. וזמינותו שביט היא שיטה כימות של ה-DNA נזק יעיל, קל לביצוע, ויש לו דרישות הזמן/תקציב נמוך ו הפארמצבטית גבוהה. כאן, אנחנו להדגיש את התועלת של שביט וזמינותו למחקר פרה על ידי הערכת אפקט genotoxic של טיפול משולב olaparib/temozolomide לתאים glioma U251.
מבוא
וזמינותו שביט פותחה לראשונה על ידי Ostling ג'והנסון בשנת 1984 על ידי הפגנת שההעברה של ה-DNA שברים הגרעינים תחת מצב ניטראלי1. הטכניקה פותחה מאוחר יותר על ידי סינג. et al., מראה כי תנאי בסיסי גדל באופן משמעותי את ירידה לפרטים ואת הפארמצבטית assay2. מאז, וזמינותו שביט ניטרלי משמש בעיקר כדי לזהות כפול גדילי DNA מעברי, בעוד וזמינותו שביט אלקליין רגיש יותר עבור כמויות קטנות יותר של ה-DNA נזק, לרבות יחיד כפול גדיל DNA שובר, אתרי אלקלי-יציב, DNA-DNA או חלבון-דנ א cross-linking, מעברי יחיד-גדיל DNA המשויך כריתה לא שלם תיקון אתרי3,4. שני מבחני לאפשר ויזואליזציה של....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. להכין ריאגנטים
- 1 x PBS
- לדלל PBS 10 x 100 מ עם 900 מל dH 2 O ולהתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות מד pH. חנות בטמפרטורת החדר.
- פירוק פתרון (LS)
- להכין 2.5 M NaCl, EDTA ניתרן 100 מ מ, 10 מ מ טריס בסיס ו-200 מ מ NaOH 900 מל dH 2 O; זה בדרך כלל לוקח בערך 20 דקות כדי לאפשר את התערובת עד התמוססות מלאה. להתאים את ה-pH 10 באמצעות מד pH. להוסיף 1% נתרן לאוריל sarcosinate ו 1% X-100 טריטון, ולכוונן את העוצמה הסופי 1,000 מ ל. מגניב עד 4 ° C במשך לפחות 30 דקות לפני השימוש.
- הפתרון אלקטרופורזה אלקליין (AES), pH > 13
- להכין 200 מ"מ NaOH, 1 מ ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול הנוכחי מתאר צעד אחר צעד זרימת עבודה כדי להפוך את כוכב השביט וזמינותו של ביצוע ניתוח נתונים (איור 1). תוצאות מבחני שביט אלקליין ונייטרלי הראה כי זנב השביט של תאים U251 שטופלו דוקסורוביצין (1 מיקרומטר, 20 h) היה ארוך וכי היה בעוצמה גבוהה יותר דנ א, רומז הצטברות משמעותית של DNA מפוצלים עקב כימותרפיה (איור 2).
ניתוח כמותי עבור וזמינותו שביט אלקליין או נייטרלי או ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
וזמינותו שביט הוא כלי יעיל למדידת יחיד כפול-גדיל DNA ומעברי ברמה התאית. וזמינותו הוחל נרחב בתור "תקן הזהב" מחקרים בנוגע genotoxicity, אפידמיולוגיה סביבתית13, החל נגעים הבסיס, DNA crosslinks, פיתוח תרופות, ואתרים אלקליות רגיש. במחקר הנוכחי, הראנו שני פרוטוקולים ברורים צעד אחר צעד עבור מבחני שביט אלקליין ונייטרלי, בהתאמה. שילוב של תא בודד אלקטרופורזה מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פרשנות התמונה, בשני מבחני שביט אלקליין ונייטרלי מספקים גישות כמותיים כדי להעריך את מידת ה-DNA נזק במבחנה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, NCI, CCR. כל המחברים קיבל מענק מחקר מגזר NIH, NCI, CCR.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| בסיס Trizma | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| נתרן לאוריל סרקוזינאט | סיגמא | L7414 | |
| טריטון X-100 | סיגמא | 93443 | |
| נתרן אצטט | סיגמא | 32318 | |
| חומצה אצטית קרחונית | סיגמא | 695092 | |
| אמוניום אצטט | סיגמא | A1542 | |
| SYBR ירוק | Invitrogen | S33102 | |
| נמוך נקודת התכה אגרוז | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% אתנול | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | >Company | Catalog | Comments |
| ><חזק>חומרים מתכלים | |||
| זכוכית שקופיות רקמת | אלקטרונים | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | DENVILLE | ||
| טיפים לפיפטות | חד< | ||
| חזק>שם | חברה | מספר קטלוגי | הערות |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| תא אלקטרופורזה אופקי | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| ספק כוח | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | דגם 12-140E | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Zeiss | LSM700 | |
| מיקרופיפטור | Eppendorf |
מקורות
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
