מאמר שיטה

גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56455

⸱

9 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne

במאמר זה

סיכום

דו ח זה מתווה גישה פשוטה לזירוז בהצלחה ניסוי חיסון לדלקת בעצה (EAN) באמצעות חלבון המיאלין אפס פפטיד180-199 (P0) בשילוב עם אדג'וונט מלאה של פרוינד, הרעלן שעלת. אנו מציגים פרדיגמה מתוחכם המסוגל להעריך במדויק את היקף הגירעונות פונקציונלי, neuropathology המתרחשים EAN הזה.

תקציר

לדלקת בעצה חיסון ניסיוני (EAN) הוא מודל ניסיוני היטב להערכה של מחלות אוטואימוניות של המיאלין היקפיים. EAN מחלה הנגרמת על ידי immunizing עכברים עם פפטידים neurogenic לביים מתקפה דלקתיות כלפי מרכיבי מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). התפתחויות אחרונות אפשרו את אינדוקציה של EAN בקו עמיד יחסית C57BL/6 העכבר באמצעות חלבון המיאלין אפס (P0)106-125 או פפטידים180-199 P0 יועבר. בתוך אדג'וונט בשילוב עם ההזרקה של הרעלן שעלת. היכולת לגרום EAN בנימה זו C57BL/6 מאפשר השימוש בכלים גנטיים רבים הקיימים על רקע זה העכבר, ובכך מאפשר חקר המחלה פתוגנזה מתוחכמים והחקירה של הפעולה מכניסטית של הרומן הרפוי ב בשילוב עם גישות מהונדס. במחקר זה, נדגים בגישה פשוטה לזירוז בהצלחה EAN באמצעות פפטיד180-199 P0 בעכברים C57BL/6. אנחנו גם חלוקה לרמות פרוטוקול להערכה של גירעונות פונקציונלי המתרחשות במודל זה, בליווי מגוון רחב של תכונות neuropathological. לפיכך, המודל הזה הוא מודל ניסיוני עוצמה ללמוד בפתוגנזה של האנושי מחלות עצבים היקפיים המיאלין, וכדי לקבוע את היעילות של טיפולים פוטנציאליים שואפים לקדם את תיקון המיאלין ולהגן מפני נזק עצבי אוטואימוניות לדלקת בעצה.

מבוא

מחלות עצבים היקפיים יכול להיות גנטי במקורם או הנרכש, עם נזקי רכשה שיש גם מטבולית, ischaemic, precipitants דלקתיות או רעילים. מחלות אלו מסווגים גם מועיל או עצב, או demyelinative במקורם. הנפוצות ביותר רכשה demyelinating מחלות עצבים היקפיים הם חריפה דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (AIDP, הידוע גם בשם תסמונת גיליאן, GBS) כרונית דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (CIDP)1, 2 , 3 , 4; שניהם מאופיינים שאינן קשורות pathogenetically תגובה אוטואימונית נגד למעטפת מיאלין, גורם demyelination של העצבים ההיקפיים. במחלות אלה, תאי T מופעל לחצות את מחסום הדם העצבים וליצור תגובה חיסונית בתוך מערכת העצבים ההיקפית. הפעלה של מקרופאגים בתוך העצב ואז גורם demyelination או ישירות באמצעות התקפה phagocytic או בעקיפין באמצעות מופרשים מתווכים דלקתיים, והתוצאה היא מגבלה קליניים כגון שיתוק ובעיות תפקוד חושי5. ואילו האקסונים demyelinated לשמור על היכולת להיות remyelinated בעקבות demyelination, remyelination מתעכבת לעיתים קרובות או שלם, וכתוצאה מכך הרגישות של האקסונים עירום כדי נזק בלתי הפיך, שהיא הגורם הקבוע קליני נכות. כיום, הטיפולים היעילים ביותר הם immunomodulatory, אבל למרות היעילות שלהם, במקרים רבים ההתאוששות הוא לרוב איטי, ~ 25% מהחולים יחוו שיורית גירעונות פונקציונלי זה להפחית באופן משמעותי את איכות החיים שלהם6, 7.

EAN הוא מודל בעלי חיים בשימוש נרחב של demyelinating נוירופתיה אשר סיפקה תובנות לתוך פתוגנזה ואת אמצעי כדי להעריך את הרומן סוכני טיפולית4. מודל זה יכול להיגרם מינים שונים כגון ארנבות, חולדות, עכברים, שרקנים, הנגרמת על ידי חיסון עם אנטיגנים neurogenic. עם זאת, בסופו של דבר אינדוקציה EAN מוצלח תלוי תגובה חיסונית המתאים למחלה להתרחש. בהתחשב הווריאציות מינים (וגם בין-species/זן) בתפקוד המערכת החיסונית, צירופים מרובים של אנטיגנים וחיסונים adjuvants פותחו לזירוז בהצלחה EAN. מבחינת כלים גנטיים מאתר, C57BL/6 היא הנפוצה ביותר; עם זאת, פפטיד חלבון P2 מסורתי 57-81 (P257-81) זה גורם למחלה רגישים SJL העכבר זן8 אין אפשרות פתוגנזה איליקיט שמוביל לגירעונות פונקציונלי המתח C57BL/6. למרבה המזל, פרדיגמות רגישות עולה באמצעות P0106-125 או פפטידים180-199 P0, יועבר. בתוך אדג'וונט בשילוב עם ההזרקה של שעלת ניתן הרעלן להתגבר על מכשול זה הפעלת כלים גנטיים מתוחכמים להיות מנוצל מודל EAN מאתר.

כאן מוצגת שיטה פשוטה עבור אינדוקציה של EAN בעכברים C57BL/6. בנוסף, מסופק בגישה מפורט מקיף מאת בו יש להעריך את גירעונות neuropathological פונקציונלי הקשורים במחלה. פפטיד9 199 180–P0 נבחר העדפה P057-81 חלופי10. המודל199 P0180–שתיארנו לייצר סימנים קליניים חמורים פחות בהשוואה P057-81 אלטרנטיבית10ולכן נוטים לספוג את ההקדמה של פוטנציאל לפליטת גנטי ברישול, להתאושש הליכים כירורגיים (כגון משאבת osmotic השרשה), והוא נוטה הליכון בהליכה פונקציית בדיקת4. עם זאת, ההליכון הילוך תפקודי והפרוטוקולים היסטולוגית המתוארים כאן יכול בקלות להיות מיושם כשלמדתי המחלה ב- variant57-81 המושרה P0.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים כאן ואושרו על ידי מכון Florey Neuroscience, ועדת האתיקה של בריאות הנפש (מרכז המוח מלבורן) חיה ופעל קוד האוסטרלי של התרגול עבור שימוש של בעלי החיים עבור מדעי מטרות.

1. EAN אינדוקציה

הערה: EAN יכולה להיגרם בהצלחה בעכברים C57BL/6 גברים בגילאי 6-8 שבועות. פרוטוקול אינדוקציה לוקח 9 ימים בסך הכל. יום 0 מתייחס ביום התחסנות הראשון. עבור פרוטוקול זה, נערכו זריקות תחת הרדמה (ראה שלב 1.1.2 להלן).

  1. על יום-1:
    1. להכין את הרעלן שעלת (ראה טבלה של חומרים) פתרון של 1.6 µg/mL באמצעות פוספט העכבר-מול סטרילי של 0.1 M buffered תמיסת מלח (MT-PBS).
    2. ההרדמה עם איזופלוריין:
      1. הנח את העכבר (C57BL/6, זכר, 6-8 שבועות) בבית הבליעה ההרדמה ולהתאים את זרימת החמצן 1 ליטר לדקה
      2. להדליק את מכשיר אידוי איזופלוריין, להתאים אותו ל- 2.5% עבור ההרדמה, והצג נושם, לחכות 2 דקות, או עד ראשי רפלקסים (האיבר הקרנית, האחוריות) הם כבר לא מגיבה
    3. להסיר את העכבר מן החדר ההרדמה ולפקח 250 µL של הפתרון שעלת הרעלן לעיל באמצעות הזרקה בקרום הבטן (i.p.) בעזרת מזרק 0.5 mL עם מחט 30 1/2 G.
    4. להכין את inoculum בזריקות חיסון:
      1. להכין פתרון A באמצעות 2 מ"ג/מ"ל תמיסת פפטיד 180-199 P0 (עם > טוהר 98%, רצף S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) ב- saline 0.9%.
      2. הכן B פתרון באמצעות 20 מ"ג/מ"ל תמיסת שחפת Mycobacterium (ראה טבלה של חומרים) בפרוינד ' s אדג'וונט מלאה (FCA, הכוללת: monoolate mannide 15% + 85% שמן פרפין, 0.5 מ"ג/מ"ל של שבבי נהרג ויבשים מ' Mycobacterium butyricum).
      3. לעשות את inoculum הסופית על הזרקת, לשלב חלקים שווים נפח של פתרונות A ו- B מכה חרוז ומערבבים אותם במהירות מקסימלית עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: פתרונות A ו- B יכול להיות שמר בתור מניות ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר חודש אבל inoculum הסופית משולב חייב להיות מוכן טרי ביום של הזריקה העכבר.
  2. ביום 0, לנהל µL 50 של inoculum (הכנה המתוארים שלב 1.1.4) לתוך עכבר באמצעות זריקה תת עורית באמצעות מחט 23 גרם-
    הערה: הזרקת וניתן לשים בין השכמות, או בין הגפיים האחוריות הזנב סימטרית dorsum.
  3. -1 יום, להפוך את הפתרון שעלת הרעלן של 1.2 µg/mL (ב- MT-PBS) ולפקח 250 µL לתוך עכבר באמצעות הזרקת i.p. באמצעות מזרק 0.5 mL עם מחט 30 1/2 G.
  4. על יום 3, חזור על שלב 1.3 לעיל.
    הערה: פתרונות מניות A ו- B יכול להיות מורכב ומאוחסנים ב 4 הלעפה תרוטרפמט לתקופה מקסימלית של חודש אחד. עם זאת, inoculum להזרקה הסופי, המיוצר על ידי שילוב של פתרונות מניות A ו- B, חייב להיעשות ביום של הזריקה.
  5. ביום 8, לנהל µL 50 של inoculum (הכנה המתוארים שלב 1.1.4) לתוך עכבר באמצעות זריקה תת עורית (ראה שלב 1.2 לעיל), באותו אתר הזרקת כמו שלב 1.2 (עבור כל חיה)

2. הניקוד קלינית

  1. לבצע קליניים ניקוד יומי החל ביום 0-
  2. לתת את העכבר כל ציון של 0, 1, 2, 3 או 4 לפי הקריטריונים שפורסמו 4. ראה טבלה 1 עבור ניקוד קליניים EAN.
    הערה: עקביות, מאמץ כדי להבקיע עכברים באותו זמן מדי יום על ידי החוקר אותו.

3. מנוע הערכת פונקציה

הערה: ביצועי המנוע שקובעת במקביל הבקיע קליניים עבור אותה קבוצה של בעלי חיים. מנגנון הערכה המוטורית חייב להיות מחובר למחשב כי מערכת הדמיה של הפונקציה הילוך (ראה טבלה של חומרים) התקין. מומלץ גם כי עכברים כל לפנות לבדיקה צריך להיות בלתי לפעילות פועל לפני EAN אינדוקציה. כדי לעשות זאת, תרגולים (2 הרצפים מבחן לכל עכבר) מבוצעים שלושה ימים לפני המחלה אינדוקציה (יום-3)-

  1. להפעיל מנגנון הערכה המוטורית ולעבור על כפתור קלה.
  2. עורפה העכבר בחוזקה, דיו רגליה על ידי הורדתו לתוך מיכל מלא דיו אדום תוך החזקת זנבו.
    הערה: שלב זה נדרש עבור המתח C57BL/6, אך ניתן לדלג אם זן עכבר עם צבע החלוק הלבן משמש.
  3. הנח את העכבר לתוך תא הליכה ו להגדיר את מהירות הליכון-15 ס מ/s.
  4. להפעיל את ההליכון ולחץ " שיא " כפתור כדי ללכוד את התנועה המצטבר של העכבר באמצעות הפונקציה הילוך מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים).
  5. השתמש טיימר ולמדוד כל ריצה ל-36 s. לאחר 36 s, הקלטת עצור, עצור ההליכון.
    הערה: עכברים אין אפשרות להשלים בהצלחה המשימה הפועלת עבור מרווח זמן 36 זה s נחשבים נכשלו.
  6. לשמור את קובץ הווידאו בתיקיה המיועדת.
  7. חזור על השלבים שלעיל עבור כל עכבר לפנות לבדיקה. מבחן העכברים עם המשימה הפועלת באותו כל 3 ימים.
  8. לנתח את קבצי הווידאו הערוכות באמצעות תוכנה עבור פרמטרי הפונקציה הילוך (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: הפרטים של כיצד לנתח פרמטרים מוטוריים שונים להשתנות בין תוכנה אז נא לפנות ליצרן ' s הדרכה לפני ניתוח. כדי לקבל עדות היסטולוגית של עצב נזק המיאלין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיה רקמות ניתן לקחת על כל שלב פוסט המוטורית ההערכה בהתאם מטרות ספציפיות של מחקר או אימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

P0180-199 פפטיד המושרה EAN ב- C57BL/6 הפניות עכברים במחלה monophasic עם הציון הקליני תחילת ממוצב 6 ימים חומרת הציון הראשונה של חיסון (dpi), מרבי נצפית של 25 dpi ואחריו את הציון הקליני כמה שיפור של 40 dpi משך (איור 1)4,9. מבחינת תפקוד ההליכה, עכב?...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דו ח זה מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום EAN באמצעות פפטיד180-199 P0 בעכברים C57BL/6, המאפשר כימות של גירעונות neuropathological ופונקציונליים מפתח בעכברים המושרה עם EAN. ברורים בפרוטוקול אינדוקציה EAN המתוארים כאן הוא השימוש של הרדמה תוך כדי ביצוע זריקות חיסון. השימוש איזופלוריין הרדמה משפר באופן משמעותי את ?...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים בנוגע לזה לעבוד.

תודות

DGG הוא NHMRC פטר דוהרטי, אוסטרליה מחקר טרשת (MSRA) בתחילת הקריירה עמית. JLF נתמך על ידי הבתר MSRA. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומיים האוסטרלי, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) פרויקט הענק #APP1058647 ל- JX.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57BL/6, זכר, בן 6-8 שבועותAustralian Bioresources Cenre, WA, אוסטרליה
רעלני שעלתמעבדות ביולוגיות, בע"מ, קליפורניה, ארה"ב#181
0.1 M עכבר-איזוטוני פוספט חוצץ מלוח (MT-PBS)למעבדות יהיה פרוטוקול משלהן.
למעבדות IsofluranePharmachem, QLD, אוסטרליהיהיה פרוטוקול משלהן לניהול.
P0180– 199 פפטידWuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHNP0180– 199, רצף S– S– K– R– G– R– Q– T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R–
S חום הרג את Mycobacterium tuberculosis (זן H37RA)Difco, MI, USA#231141
האדג'ובנט המלא של פרוינד (FCA)Difco, MI, USA#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Services#15710יש לדלל ל-4% PFA ביום איסוף הרקמות.
25% glutaraldheydeProSciTech Pty Ltd, QLD, אוסטרליה#11-30-8לדלל ל-2.5% גלוטרלדהיד יום הקיבוע.
נתרן אזידChem-Supply Pty Ltd, SA, אוסטרליהSL189צור 10% (w/v) מלאי ב-0.1 מיליון MT-PBS. שימוש ב-0.03% (v/v).
סוכרוזChem-Supply Pty Ltd, SA, אוסטרליהSA030שימוש ב-30% (w/v).
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינוניתSakura Finetek, CA, USA#4583
סרום חמור רגילMerck Millipore, MA, USA#S30-100יש להשתמש כמדלל נוגדנים ב-10% (v/v) או בריכוז אחר שנקבע על ידי המעבדה הפרטית.
Triton-X 100Sigma Aldrich, MI, USA#90o2-31-1שימוש בדילול נוגדנים בריכוז של 0.3% (v/v) או ריכוז אחר שנקבע על ידי המעבדה הפרטית.
חלבון מבשר אנטי-עמילואיד של ארנב (APP)Invitrogen (Life Technologies), קליפורניה, ארה"S12700בשימוש בשעה 1:400 או טיטראט במעבדה שלו.
חלבון הקשור למגע-1 (Caspr)מתנת פרופ' אליאור פלס, מכון ויצמן למדע, ישראלבשימוש בשעה 1:500 או טיטראט במעבדה עצמית.
נוגדנים משניים מצומדים מתאימים של Alexa Fluorבדיקות מולקולריות (Life Technologies), OR, ארה"ב שימוש שונה בשעה 1:200 או טיטראט במעבדה משלו. בחירת המין בו גדל הנוגדן ואלקסה פלואור שנבחרה נתונה לשיקול דעתה של כל מעבדה.
פתרון הרכבה מימידאקו (אג'ילנט), קליפורניה, ארה"בלכל מעבדה תהיה העדפה משלה.
nameCompanyCatalog NumberComments
>Equipment
0.5 מ"ל מזרק עם 301/2 גרם מחטיםBD#326105
23 גרם מחטיםBD#305143
כריתכל כרית דיו אדומה או צבע מאכל אדום יכולה לשמש לסימון כפות הרגליים של בעלי החיים.
מכשיר DigiGate (כולל הליכון)eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging SystemeMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatchניתן להשתמש בכל טיימר.
DigiGait 8 תוכנהeMouse Specifics Inc. פרמינגהם, MA
מיקרוסקופ ניתוחZeissניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ ניתוח מתאים.
שקופיות טעונותSuperfrost Plus, Lomb Scientific Pty LtdSF41296SP
CyrostatLeicaניתן להשתמש בכל cyrostat מתאים.
ציוד זלוף ומכשירילמעבדות יהיו פרוטוקטולים משלהן.
לח אטוםמעבדות עשויות לייצר בעצמן באמצעות מיכל פלסטיק אטום.
PAP peneGeneTex (ארה"ב)עיפרון שעווה, או מתח פני השטח עשויים לשמש גם ליצירת באר סביב קטע הרקמה.
מיקרוסקופ קונפוקליZeis LSM780ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ קונפוקלי עם קווי לייזר מתאימים.
FIJI/Image Jהמוסדות הלאומיים לבריאותזמין ב-www.fiji.sc
רשימתב #S3023 דיו אדומה ניתוח תא

מקורות

  1. Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
  2. Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
  3. Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
  4. Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
  5. Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
  6. Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy--update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
  7. Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
  8. Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
  9. Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
  10. Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
  11. Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
  12. Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

129Ranvierdemyelination

מאמרים קשורים