הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם השומנים bilayer שלפוחית מופרש על ידי תאי, גודלם נע בין 30 עד 300 ננומטר. EVs דווחו לראשונה בשנת 1978 עם עדויות שלפוחית של חולים עם מחלת הודג'קין¹. שלפוחית אלה דווחו להיות 40 עד 120 ננומטר בגודלם. בשנת 1980, נמסר EVs מעורבים פקקת, היווצרות קריש דם בתוך כלי דם סרטן המטופלים²ומערכת קרישת הדם. אחרי 30 שנה, EVs דווחו להיות גורם חשוב לקדם את הגידול הפלישה, הבריחה מחוסן ואנגיוגנזה³. בנוסף, הפונקציות של EVs נחקרו כמבקרי באינטראקציה תאית בתחומים של דלקת, הפרעות המערכת החיסונית, מחלות נוירולוגיות סרטן⁴. EVs מכילות מולקולות ספציפיות כגון חלבון, mRNA microRNA⁵, שלהם פוטנציאל היישום אבחון ו הרפוי מאז שנותחה^6,7. EVs הם קטגוריה מורכבת של קבוצות כולל exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ו exosome דמויי שלפוחית, בהתאם מקור הסלולר שלהם פונקציה ביולוגית³. בנוסף, על סמך להן שלהם, EVs אלה ניתן לחלק שלפוחיות זעירות (שלפוחיות זעירות לסככה, nm 100-1000) ו- exosomes (30-300 ננומטר)^8,9. בין אלה, exosome דווחה מתקשרת תא התגובה החיסונית¹⁰,^11,סרטן¹²של מחלה זיהומית¹³.

עניין exosomes כמו סמן לאבחון מוקדם גדלה במהירות, לטיהור ודה -אפיון של exosomes חייב להיות מלווה עם טכניקות הדמיה מולקולרית. גדלים מורפולוגיות של exosomes, בהתאם שלהם מוצא ותפקוד¹⁴, ניתן להבחין על ידי טכניקות במיקרוסקופ עם רזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. רוב exosomes היו דמיינו ידי שלילי מוכתם הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)^15,16,17, תוצאות אלה שאושרו על-ידי immunolabeling של חלבון ספציפי ב הר כל שלפוחית ¹⁸. מספר קבוצות המחקר דיווחו על המבנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מיקרוסקופ כוח אטומי^19,20, הקפאה-TEM^21,22. עם זאת, ואילו טכניקות אלה שימושיים עבור לימוד מבנה exosome, הם אינם מספיקים להתבוננות המיקום של חלבונים ספציפיים הממוקם בתוך exosome. לכן, הצגנו פרוטוקול הדמיה exosomes עם תוויות של חלבון ספציפי. אנחנו מוחלים בלוק הכנה, חלוקתה ודק במיוחד ו immunostaining עבור ברור מיקום מפורט של החלבון exosome. זה היה לעומת מכתים שלילי ואת כל הר immunostaining, המשמש באופן מסורתי אפיון exosome.

1. גוש הכנה, חלוקתה, צביעת והדמיה של Exosome

1. גלולה את exosomes של תגובת שיקוע התרבות של תאים HCT116 על ידי צנטריפוגה-g 100,000 x עבור 1.5 h²³. להסיר את התרבות supernatant ולתקן בזהירות בגדר מטוהרים exosome עם 1 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד בפתרון 0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.0) עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. עבור 0.1 M נתרן cacodylate, להמיס חומצה cacodylic 4.28 g 160 מ ל מים מזוקקים (DW). להתאים את ה-pH ל 7.4 עם 0.1 M HCl ואז להפוך עד 200 מ ל מים מזוקקים.
2. הסרת מקבע את ולשטוף את כדורי עם 1 מ ל 0.1 M נתרן cacodylate מאגר בטמפרטורת החדר. אני חוזר שלוש פעמים עם כל שינוי שנמשך 10 דקות.
3. פוסט-לתקן את הדגימות עם 1 מ"ל של 2% אוסמיום ארבע-חמצני עבור 1 h-4 מעלות צלזיוס.
4. הסר את מקבע ולאחר שטיפה שלוש פעמים עם 0.1 M נתרן cacodylate מאגר כל 10 דקות.
5. תקופת דגירה של 10 דקות עם סדרה מדורגת אצטון (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, בהתאמה) על ניעור.
6. הסר אצטון, דגירה הפתרון של תערובת ההטבעה צמיגות אצטון 3:1: נמוך למשך 30 דקות. בגדר exosome יש במבחנה.
7. להסיר את המדיום, להוסיף 1:1 אצטון: נמוך צמיגות בינונית תערובת ההטבעה ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות.
8. להסיר את המדיום, להוסיף 1:3 אצטון: נמוך צמיגות בינונית תערובת ההטבעה ולאחר מכן תקופת דגירה של 30 דקות.
9. להסיר את המדיום ולהוסיף 100% נמוך צמיגות הטבעה תערובת דגירה ללילה בטמפרטורת החדר.
10. להטביע את הדגימה טהור צמיגות נמוכה הטבעה תערובת שימוש ההטבעה כייר ואופים במשך 24 שעות ביממה ב- 65 מעלות צלזיוס.
11. להכין סעיפים 60 ננומטר בעובי דרך אולטרה-מיקרוטום.
12. זוגיות-הכתם עם 2% אצטט uranyl עבור 20 דקות ולהוביל ציטראט למשך 10 דקות.
    הפתרון המוביל ריינולדס, להוסיף 1.33 גרם של חנקת עופרת ו- g 1.76 של סודיום ציטרט סך של 50 mL מזוקקים מים.
13. לבחון את הרשת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 80 kV.
14. לחץ על לחצן "ייבוא" ולאחר מכן לחץ על "קובץ", "שמור כמו" במערכת מצלמת CCD תחת המיקרוסקופ אלקטרון 80 kV. עקבו אחר הגדרות אוטומטית זמן החשיפה.

2. חיסונית מכתים סעיפים ו הדמיה (איור 1)

1. חתך 60 ננומטר ודק במיוחד סעיפים באמצעות של אולטרה-מיקרוטום, ולאסוף ברשת ניקל.
2. דגירה רשתות ב 50 טיפות µL של גליצין מ' 0.02 נקודות 10 דקות להרוות קבוצות אלדהיד חופשית.
3. שוטפים ב- 100 μL של DW שלוש פעמים כל אחד עבור 10 דקות Incubate בטמפרטורת החדר במשך 1 h ב- PBS המכיל 1% BSA.
4. תקופת דגירה רשתות ב 50-100 µL טיפות אנטי KRS נוגדן²⁴ (בטחונות ב- PBS המכיל 0.1% BSA) של h 1 (אם יש צורך, שלב זה צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.)
5. רחץ רשתות עם 5 טיפות נפרד (50 µL) ל- PBS המכיל BSA 0.1% למשך 10 דקות.
6. העברה רשתות טיפות של נוגדן 2^nd לשעה (ארנב אנטי איג מצומדת כדי 10 ננומטר זהב חלקיקים (1: 100) ב- PBS המכיל 0.1% BSA).
7. רשתות לשטוף עם חמישה להפריד טיפות PBS המכיל BSA 0.1% (50 µL) כל 10 דקות.
8. חדר זוגי-הכתם עם 2% uranyl אצטט כעשרים דקות בתנאים כהה ועם עופרת ציטראט של וריינולד למשך 10 דקות, בהתאמה.
9. לחץ על לחצן "ייבוא" ולאחר מכן לחץ על "קובץ" ו "שמור כמו" במערכת מצלמת CCD תחת TEM 80 kV. זמן החשיפה עקב הגדרות אוטומטית.

איור 1: תהליך של הכנת הדוגמא immunostaining. (א) exosome קבוע זוגי מיובשת, הסתננו עם צמיגות נמוכה הטבעה תערובת שרף. (B) שרף הטבעה. (ג) סעיף דקים עם סכין יהלום. תוכנית ההתקנה עבור תוויות חיסונית-זהב (D) . הרשתות עם הסעיפים ודק במיוחד הם לשים את טיפות נוזל על מצלמות-מיקרוסקופים, אשר ממוקם עם מגבת נייר רטובה. כל מקטע הוא מתפשט עם טיפות של נוגדן µL 50-100, ואז לרחוץ עם מאגר. (ה) כפול מכתים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט. המכסה מכוסה ברדיד אלומיניום עבור צביעת מתכות כבדות. (נ) צביעת פתרון יוסר על ידי נייר סינון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. שלילי מכתים

1. זוהר-פריקה הסרט formvar דק/פחמן מצופה 200 רשתות EM רשת נחושת עבור 1 דקות על ידי זוהר פרירים.
2. לתקן מטוהרים exosomes עם 1 מ"ל של 2% Paraformaldehyde (PFA) במשך 5 דקות.
   התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים. כל העבודה צריכה להיעשות בשכונה fume מאוורר.
3. לטעון 5-7 µL exosome השעיית פתרון על הרשת, תקופת דגירה של 1 דקות. אם הריכוז של exosome הוא גבוה מדי, לדלל את ריכוז 1/2 - 1/5.
4. מיד להכתים ~ 20 טיפות של פתרון אצטט (UA) uranyl 1% מסונן על פני השטח של רשת אמ על ידי מזרק.
5. הסר את הפתרון UA עודף על הרשת על-ידי פנייה אל קצה הרשת עם נייר סינון.
6. מהר לשטוף הרשת עם טיפת מים. שלב זה יסיר את הפתרון מכתימים עודף.
7. מניחים את הרשת על השולחן על-ידי החזקת עם פינצטה, ו כיסוי הרשת חלקית לצלחת תרבות לייבוש למשך 10 דקות מתחת לטמפרטורת החדר.
8. חנות הרשת בתיבה רשת EM להסתכלות לעתיד על ידי TEM 80 kV.

4. כל הר עבור Immunostaining

1. זוהר-פריקה הסרט formvar דק/פחמן מצופה 200 רשתות EM רשת נחושת ל 30 s.
2. לתקן מטוהרים exosomes עם 1 מ"ל של 2% Paraformaldehyde (PFA) במשך 5 דקות.
   התראה: Paraformaldehyde אדים רעילים. כל העבודה צריכה להיעשות בשכונה fume מאוורר.
3. לטעון µL 5-7 קבוע פתרון exosome על הרשת, תקופת דגירה של 5 דק שטיפה עם 100 µL ל- PBS שלוש פעמים כל 10 דקות.
4. פנקו רשתות עם 50 µL של גליצין 0.05 M 10 דקות להרוות קבוצות אלדהיד חופשית.
5. העברה רשתות טיפה של מאגר חסימה (PBS המכיל 1% BSA) למשך 30 דקות.
6. תקופת דגירה רשתות עם 50-100 µL אנטי-PD-L1 נוגדנים (בטחונות ב- PBS המכיל 0.1% BSA) של 1 h (במקרה הצורך, שלב זה צריך להתבצע ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה).
7. רחץ רשת עם 5 טיפות נפרד (50 µL) ל- PBS המכיל BSA 0.1% למשך 10 דקות.
8. העבר הרשת טיפה של נוגדן 2^nd לשעה.

כיום, exosomes מסווגים לקטגוריות גודל וצורה על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. איור 2 מציג שלילי צבעונית exosome ו מתויג החיסון exosome במעמד הר שלמה. איור 3 מראה exosome משרטוטי exosomes שאותה ניתן להתאים חיסונית לאחר חלוקתה דק. חיסונית-זהב מכתים באמצעות נוגדנים של חלבונים ספציפיים משמש באופן חיובי לזהות את exosome ולסווג את סוגי חלבונים ב- exosome. פרוטוקול בעיתון הזה משתמש כל הר immunostaining immunostaining עם exosome משרטוטי פלסטיק.

איור 2: שלילי מוכתמים, שכל מכתים הר חיסונית. (א) Exosome מורפולוגיה נצפית על ידי צביעת שלילי. Exosomes מציגה את המורפולוגיה שלהם בצורת גביע. (B, C) מכתים כל חיסונית הר-זהב מראה את המיקום של חלבון ספציפי (אנטי-CD274 האנושי; PD-L1) ב- exosome. חיצים לבנים מציינים את המיקום של הזהב. חיצים שחורים מציינים את המיקום של האות רקע. (ד) שליליות שליטה על התוצאה immunostaining. שליטה Isotype שימשה נוגדן ראשוני בתהליך זה immunostaining. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר.

איור 3: אלקטרון micrograph של משרטוטי exosomes. (א) עגול מורפולוגיה Exosomes'. (B) Boxed exosome באמצעות הכלי "בוקסר" בתוכנית אימן. (C, D) חיסונית-זהב מתויג exosome עם צביעת מתכות כבדות. חיצים שחורים מציינים חלקיקי זהב (A-D) סולם בר = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.