מאמר שיטה

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 בנובמבר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הכנת כרומטין של שריר השלד העכבר למבוגרים, טישו פיזית עמיד עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי הגפיים ביתור של עכברים בוגרים הן משובשות פיזית על ידי מכני homogenisation, או שילוב של הא ו douncing, במאגר היפוטוניק לפני פורמלדהיד קיבוע של התא lysate. גרעינים קבוע כבר טהור לפי מחזורים נוספים homogenisation מכני, סינון רציפים כדי להסיר שאריות תאים או douncing. גרעינים מטוהרים יכול להיות sonicated באופן מיידי או בשלב מאוחר יותר לאחר הקפאה. יכול להיות sonicated ביעילות כרומטין, הוא השיג מתאימה לניסויים immunoprecipitation כרומטין, כפי שהודגמה בעזרת הפרופילים עבור גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות. האירועים איגוד זוהה באמצעות כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה הם בעיקר אלה מתרחשים גרעינים סיבי השריר למרות נוכחותם של כרומטין של הלווין האחר הקשורים סיבים ותאי אנדותל. פרוטוקול זה לכן מותאם ללמוד הכונה בשריר השלד העכבר למבוגרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מצמידים תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), רצף תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) הפכו את השיטות של הבחירה ללמוד שעתוק ו epigenetic בקרת גנים ברקמות שונות סוגי תאים1. טכניקה זו מאפשרת הגנום כולו פרופיל של שינויים כרומטין קוולנטיות, תפוסת variant היסטון שעתוק מקדם האיגוד2,3.

בזמן ביצוע שבב של תאים בתרבית וותיקה, השבב של רקמות יונקים נשאר יותר מאתגר. הכנת כרומטין שבב כרוך במספר שלבים קריטיים צריך להיות מותאם לכל סוג הרקמה והתא. כרומטין ניתן להכין את lysates הסלולר של תאים בתרבית או טיהור הבאים בגרעין. במקרה של רקמות יונקים, פירוק יעיל קיבוע פורמלדהיד, טיהור של גרעינים הם קריטיים כדי להבטיח התאוששות אופטימלי של כרומטין. יתר על כן, לבחור לתקן הגרעינים לפני או אחרי טיהור שלהם צריך להיקבע השפעול. למרות משוכות אלה, שבב בוצעה בהצלחה רקמות כמו הכבד, testis, או המוח4,5,6. במקרה של שריר השלד, שיבוש כזה עמיד פיזית טישו, אשר מוצגים תכולה גבוהה של חלבונים מבניים, ובידוד של הגרעינים שלה הוא מאתגר במיוחד. בהתחשב סגוליות זה, פרוטוקולים ממוטב בשביל לרקמות אחרות לא נותנים תוצאות משביעות רצון לשרירי השלד.

כאן נתאר פרוטוקול לבודד את השבב-כיתה כרומטין של רקמת שריר השלד העכבר המערבת פיזית לשבש את הרקמה, קיבוע פורמלדהיד, ולאחר מכן הבידוד של גרעינים, sonication. היעילות של שיטה זו להכין כרומטין מתאים שבב מרקמות זה הודגם על-ידי ביצוע שבב-qPCR וצ'יפ-seq עבור שונים גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות7.

טכניקה חדשה זו הרבה יותר מהר מאשר פרוטוקול שדווחה בעבר8 הכוללת זמן collagenase עיכול צעדים אשר במהלכו, שינויים לוקליזציה גנומית של גורמי שעתוק, שינויים בביטוי הגנים יכול להתרחש. מהירות שבה הם הגרעינים מבודד ו קבוע הופך את השיטה המתוארת כאן אטרקטיביים במיוחד להכין כרומטין הלוכד יותר בנאמנות את המדינה יליד תפוסת גנומית. יתר על כן, למרות שיש שיטות נוספות כרומטין בידוד חלבון או חילוץ של רקמת שריר יש כבר מתואר8,9,10 ומשמש לניסויים שבב-qPCR את הגנים הנבחר, אין שבב-seq נתונים דווחה השימוש בהם. שיטת דיווח כאן מתאים שעתוק מקדם, היסטון השינוי שבב-seq, ולכן צריכה להיות גם מתאים 3 / 4C או היק כרומטין קונפורמציה ללכוד יישומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים הוחזקו בהתאם להנחיות מוסדיים לגבי טיפול ו שימוש של חיות מעבדה ועל פי הנחיות טיפול החיה הלאומית (הנציבות האירופית הוראת 86/609/CEE; צרפתית פוסק no.87-848). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה הארצית צרפתי.

1. בידוד של רקמת שריר

  1. הקרבה 6 מבוגר אחד בן שבוע 8 העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. Sterlise האיבר על ידי שטיפה זה עם 70% אתנול ומנתחים את שרירי הגפיים האחוריות (הסובך, Anterior השוקה, הארבע ראשי) באמצעות מלקחיים ומספריים הצבע בסדר.
    הערה: עכבר אחד אמור להניב בסביבות 500 מ ג של רקמת.
  2. מינצ השרירים במבחנה 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר היפוטוניק קר כקרח כדי הכנה הומוגנית של קטן (< 2-3 מ מ 3) חתיכות באמצעות בסדר מספריים ולהשאיר את הצינור רועדת על מסית העליון הספסל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות

2. פירוק רקמת

הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.

  1. להעביר את homogenate צינור עגול-התחתון 14 מ"ל, resuspend מ ל מאגר היפוטוניק קר (ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטיילים ו- PMSF).
    1. Homogenise רקמת השריר טחון באמצעות של דאונס רופף (20-30 קווים בתוך 3 דקות) או מהמגן רקמה מכנית של 15-30 s ב- mL 14 סיבוב המדרגה צינורות.
      הערה: היעילות של פירוק יכול להידרש בשלב זה על ידי מיקרוסקופ אור, אם נדרש, ניתן לבצע שיבושים נוספים-
  2. להעביר את homogenate 15 mL צינורות ומלא עוצמה 10 מ ל באמצעות מאגר היפוטוניק קר. לתקן את homogenate, כפי שמתואר להלן לפני שתמשיך עם העכבר הבאה.

3. קיבוע

  1. להוסיף פורמלדהיד הריכוז הסופי של 1%, לנענע 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. להוסיף גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ' כל צינור כדי לעצור את קיבוע ו- shake למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.

4. הכנה גרעינים

הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.

  1. Homogenise קבוע lysate באמצעות של דאונס רופף (5-10 משיכות).
    1. העברת צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גרעינים ופסולת הסלולר.
  2. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר היפוטוניק מ ל טריים. לסנן את lysate דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור 50 מ. מחדש לסנן את פילטרט של דרך מסננת תא 40 µm.
  3. להעביר את פילטרט של שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג בגדר גרעינית.
    הערה: בשלב זה, הגרעינים יכול להיות sonicated מיד או תצמיד קפוא כמו גלולה יבש חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס

5. Sonication

  1. להעריך את עוצמת הקול של בגדר גרעינית (בסביבות 50 µL עבור homogenisation מכני וגם דאונס) resuspend זה במאגר sonication עד 3-4 פעמים נפח הגרעין ארוזה ואת sonicate למשך 10-15 דקות ב 4 ° C באמצעות sonicator .
    הערה: כרומטין יכול להיות מנותח מיד כמפורט להלן (6) או קפוא ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס

6. הערכת גודל המקטע כרומטין בעקבות Sonication

הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.

  1. כדי דה-crosslink, לקחת 30 µL של כרומטין במבחנה 1.5 מ"ל ולהוסיף 20 µL 5 מ' NaCl. להשלים את אמצעי האחסון 500 µL, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    1. למחרת לבצע טיפול עם 1 µL proteinase K (20 מ"ג/מ"ל מלאי), 10 µL 2 מ' טריס pH 6.8 ו- 10 µL של EDTA 0.5 M עבור h 1-42 מעלות צלזיוס בצע פנול-כלורופורם/כלורופורם החילוץ, לזרז את ה-DNA עם נפח 1 של נתרן acetat e (3 מ') ו- 2 כרכים של אתנול 100% עבור h אחד ב-80 מעלות צלזיוס או ללון ב-20 מעלות צלזיוס
  2. גלולה ה-DNA על ידי צנטריפוגה-13,500 g x עבור 15 דקות Decant תגובת שיקוע, לשטוף את צניפה ביסודיות עם אתנול 70% קר, צנטריפוגה שוב על 5 דק Decant תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
  3. Resuspend בגדר באמצעי האחסון המקורי (30 µL) טה המאגר. למדוד את ריכוז הדנ א בספקטרופוטומטר על ידי ספיגת-260 ננומטר/280 ננומטר. Pipette 500-1, 000 ng של ה-DNA יחד עם סולם גודל ה-DNA על מסלולים נפרדים של 1.5% agarose ג'ל ולבצע אלקטרופורזה כדי להעריך את גודל המקטע כרומטין.
    הערה: גודל המקטע צריך להיות בין 200-500 בסיסים, צריך להיות אין שברי משקל מולקולרי גבוה לזיהוי המתאימים כדי לא או גרוע-מפוצלים הדנ א. אם נדרש, הפתרון כרומטין (שלב 5) יכול להיות מחדש sonicated למשך זמן ארוך יותר ובדקתי אז מחדש כמתואר לעיל עד גודל אופטימלי מתקבל.

7. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP)

הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.

  1. Sepharose לחסום חלבון G חרוזים מאת aliquoting 1 מ"ל של slurry 50% אתנול. צניפה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב- benchtop צנטריפוגה, לשטוף עם 1 מ"ל של טה צנטריפוגה מאגר ב 400 x g וחזור לשטיפה של
    1. לאחר צנטריפוגה את השני, להשעות מחדש ב 1 מ"ל שבב מאגר דילול עם 25 µL של BSA (מניות 20 מ"ג/מ"ל), 20 µL שמרים tRNA (מניות 10 mg/mL). לחסום את החרוזים לפחות 2 שעות לפני השימוש על ידי סיבוב (40-60 rpm) ב-4 מעלות צלזיוס
    2. µG לדלל 50 של כרומטין (שלב 5) 8-10 פעמים באמצעות שבב דילול מאגר. להוסיף 50 µL של slurry חרוז חסומים ולאחר תקופת דגירה של 2 h סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x ב 4 ° C כדי להשיג כרומטין מאושר מראש ואת להעביר אותו צינור טריים.
  2. Immunoprecipitation, להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני (למשל, 1-2 µg לכל µg 10 של כרומטין), דגירה בין לילה עם סיבוב ב-4 מעלות צלזיוס
    הערה: הכמות האופטימלית של נוגדן המומלצים על ידי הספק או יכול להיקבע מדעית על ידי ביצוע שבב-qPCR עם כמויות שונות של נוגדן עד העשרה האופטימלי הוא ציין. גם חלבון G sepharose עשויים להיות מוחלפים על ידי חלבון א' sepharose בהתאם סוג המשנה של הנוגדן בשימוש.
  3. להוסיף את החרוזים חסומים ביום המחרת, תקופת דגירה של h 1 עם סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s הצניפה החרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, ולהתחיל את השבב שוטף.
  4. שבב שוטף: לבצע את מנקי הבאים עם המאגרים: פעם אחת עם מאגר מלח נמוכה, ואז פעמיים עם מאגר מלח גבוהה, פעמיים עם מאגר LiCl, ולבסוף פעמיים עם מאגר טה.
    1. לבצע כל כביסה 10 דקות עם סיבוב (40-60 rpm) ב 4 ° C, גלולה החרוזים בין כל כביסה על ידי צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s ומפרידה ספסל-top-
  5. , • תנאי להסיר בכביסה האחרונה, resuspend את החרוזים במאגר 250 µL • תנאי (הטרי) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.
  6. צנטריפוגה 400 x g ולאסוף eluate בשפופרת טריים. ביצוע זה צעד פעמיים ולאחר מכן דה-crosslink eluate בין לילה עם 20 µL M NaCl 5 ו- A RNase 1 µL (10 mg/mL), לטיפול עם proteinase K, פנול-כלורופורם/כלורופורם תכונות נוספלהתנהג כמו לשלב 6.
  7. Resuspend ב µL 50 טה המאגר ולעשות שימוש aliquots שבב-qPCR לפי פרוטוקולים סטנדרטיים 15 כדי לבדוק את האיכות של השבב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבודד גרעין האטום, ביצענו המגון מכני של רקמת שריר גזור, טחון לסופרן או 15 או 45, ב rpm 18,000, 22,000 (ראה טבלה של חומרים). בכל תנאי, יכול להיות מופרדים גרעיני רקמת הלבלב, אבל התשואה היה אופטימלי באמצעות המהירות נמוכה יותר (איור 1 א'-ב'). הגרעינים יכול גם להיות מוכנים על ידי douncing למשך 3-5 דקות (איור 1A, והנתונים לא מוצג), אבל המגון מכנית היא השיטה של בחירה, כמו תשואות אופטימלית של הגרעיני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן נתאר פרוטוקול הרומן להכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר הבוגרים ולהראות כי כרומטין הזה מתאים ניסוי שבב לזהות איגוד פקטור שעתוק והשינויים היסטון קוולנטיות גרעינים סיבי השריר. פרוטוקול זה כרוך במספר שלבים קריטיים. הראשונה היא הפרעה רקמות שניתן לבצע דאונס או באמצעות הטיית מכני. הטיית מכני יותר לשחזור ומהירה, ולכן הוא שיטת הבחירה. יחד עם זאת, אם אין מכשיר מתאים זמין, הפרעה יכול גם להתבצע על ידי douncing, שבו הערכת היעילות של פירוק תחת המיקרוסקופ מומלץ לפני שתמשיך לשלב קיבוע. קיבוע של כל רקמה lysates, יותר מאשר הקיבעון של ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים כל הסגל של המתקן רצף של תפוקה גבוהה IGBMC, חבר קונסורציום "צרפת Génomique" (ANR10-INBS-09-08), כל שירותי כללית IGBMC בפרט הצוות של המתקן בעלי חיים IGBMC. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של CNRS, INSERM של AFM, le חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן, הצרפתים המדינה קרן דרך ANR תחת התוכנית d'Avenir Investissements מתויג ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 ובפרמטר ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. S. J נתמך על ידי le חדר מרווח וחדיש של הליגה הלאומית לסרטן ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, ואת V.U על ידי l'Enseignement דה Ministère et de la Recherche. מזהה הוא "נבחרת labellisée" של לה חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
T 25 דיגיטלי אולטרה-טורקסT 18 אולטרה-טורקס0009022800
PMSFסיגמא-אולדריץ' צ'ימי SARLP7626-25G
מעכב פרוטאז קוקטייל-EDTA ללארוש אבחון11873580001
חלבון G חרוזי ספרוזSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
פרוטאינאז KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
מסנני תאים 70umCorning BV431751
מסנני תאים 40umCorning BV352340
פורמלדהיד EM כיתהEuromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific12091039
פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול 25: 24: 1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
שמרים tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
גליקוגן כחולAMIBIONAM9516
Pol II ChIP נוגדןסנטה קרוזSC-9001
H3K27ac ChIP נוגדןמוטיב פעיל39133
Tead4 ChIP נוגדןאביבה מערכות ביולוגיה(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 ממוקד אולטרה-סוניקטורCovaris E220
שםחברהמספר קטלוגיהערות
פריטים נוספים
מספריים
Loose Dounce
15 מ"ל ו-50 מ"ל שפופרות
14 מ"ל צינורות תחתונים עגולים
1.5 מ"ל ו -2 מ"ל צינורות אפנדורף
70 μ m ו-40 μ מסנני תאים m (קורנינג)
בז

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAChIP

מאמרים קשורים