שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

Mohammed A. Amin; Dileep Varma

doi:10.3791/56513

Method Article

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

DOI:

10.3791/56513

⸱

December 5th, 2017

Mohammed A. Amin¹ , Dileep Varma¹

¹Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לסינכרון תימידין כפול של תאים הלה ואחריו ניתוח באמצעות קונפוקלית ברזולוציה גבוהה. שיטה זו היא המפתח להשגת מספר גדול של תאים, כי המשך באופן סינכרוני שלב S מיטוזה, המאפשר לימודים mitotic התפקידים של חלבונים רב תכליתי אשר גם בעלי פונקציות לאטמוספרה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר האירועים הרגולציה השונים של מחזור התא באופן תלוי-שלב מספק הבנה ברורה לגבי צמיחת תאים וחלוקה. הסינכרון של אוכלוסיות תאים בשלבים מסוימים של מחזור התא כבר מצאו להיות מאוד שימושי לנסיונות ניסיוני כאלה. סינכרון של תאים על ידי טיפול בכימיקלים רעילים יחסית פחות יכול להיות יתרון על השימוש בתרופות מעכבות תרופתי לחקר אירועי מחזור התא הסוגר וכדי להשיג העשרה ספציפי של שלבים mitotic שנבחרו. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור סינכרון תאים אנושיים בשלבים שונים של התא מחזור, כולל שני ב S שלב ושלב מ' עם בלוק תימידין זוגי ולשחרר את נוהל לומד את הפונקציונליות של חלבונים mitotic במערך כרומוזום סגרגציה. פרוטוקול זה היה שימושי ביותר ללמוד את התפקידים mitotic של חלבונים רב תכליתי אשר בעלי פונקציות הוקמה לאטמוספרה. במקרה שלנו, התפקיד mitotic של Cdt1, חלבון קריטי עבור שכפול מקור רישוי בשלב G1, ניתן יהיה ללמוד בצורה יעילה רק כאשר Cdt1 G2/M-ספציפי יכול להיות מרוקנים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור דלדול של Cdt1 G2/M-ספציפי באמצעות סינכרון תימידין כפול. אנחנו גם להסביר את הפרוטוקול של קיבוע תא, ולחיות תא הדמיה באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר שחרורו תימידין. השיטה היא שימושית גם עבור ניתוח תפקידו של חלבונים mitotic בתנאים פיסיולוגיים והן מודאג כגון עבור Hec1, מרכיב Ndc80 מורכבים, כמו זה, המאפשר לקבל גודל מדגם גדול של תאים mitotic תא קבוע ולחיות ניתוח כפי שנראה כאן.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחזור התא, התאים עוברים סדרה של אירועים מאוד מוסדר ומבוקר חנותם עבור שכפול מדויק הגנום שלהם והתפשטות. ביונקים, מחזור התא מורכב לאטמוספרה, M-פאזי. ב. לאטמוספרה, אשר כוללת שלושה שלבים - G1, S, ו G2, התא משכפלת את הגנום שלו עובר הצמיחה כי הוא הכרחי עבור מחזור תא נורמלי התקדמות¹^,². בשלב ז-, אשר מורכב של מיטוזה (prophase prometaphase, מפה של, "אנאפאזה", אשהה) וציטוקינזה, תא הורים מייצרת שני תאים זהים גנטית בת. ב מיטוזה, אחותי chromatids של הגנום המשוכפלת מרוכז (prophase) הינם בשבי ב שלהם kinetochores על ידי microtubules בכישור mitotic שהורכב (prometaphase), שמניע את היישור שלהן למשטח מפה של (כל) ואחריו שלהם שווה ס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כפול תימידין בלוק ושחרור: ריאגנט ההכנות

להפוך 500 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 10% FBS פניצילין, סטרפטומיצין.
להכין מלאי 100 מ מ של תימידין במים סטריליים, בחנות aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול עבור תא קבוע הדמיה של התקדמות Mitotic (איור 1 א')

יום 1, זרע ~ 2 x 10 תאים הלה⁵ לתוך הבארות של צלחת 6-ובכן עם מכסה (עיקור עם 70% אתנול וביו -הקרנת UV) ו- 2 מ של DMEM בינונית. לצמוח התאים חממה humidified במשך 24 שעות ביממה-CO 37 ° C ו-5%₂.
רחוב אחד של תימידין^st : ביום 2, ביסודיות מערבבים את אמצעי האחסון הדרושי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר של התקדמות mitotic ויציבות microtubule בתאים קבוע לאחר שחרור כפול תימידין בלוק
Cdt1 מעורב רישוי ממוצא שכפול ה-DNA בשלב G1. זה יורד במהלך שלב S אבל מצטברת בשלב G2/M. כדי ללמוד תפקידה מיטוזה, Cdt1 אנדוגני צריכה להיות דלה במיוחד בשלב G/M בטכניקה המתאימה ביותר תא סינכרון, בלוק תימידין כפול¹⁵. התאים היו transfected עם siRNAs מיד לאחר שחרורו מן הרחוב תימידין 2^nd , כאשר התאים נמצאים ה-S תלת פאזי, שבו זמן רישוי של שכפול מקורו ב- G1, הדור.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היתרון הקריטי ביותר של תימידין זוגי הסינכרון הוא שהיא מספקת גודל המדגם מוגברת של תאים mitotic בחלון זמן קצר עם רבים של תאים אלו נכנסים מיטוזה שבסיר, ובכך מאפשר גם ניתוחים של כרומוזום יישור, הפרעה דו קוטבית ציר היווצרות, סגרגציה כרומוזום עם הרבה יעילות גבוהה יותר.

רבים מתחמי חלבון תקינה, איתות המסלולים מוקדשים להבטחת התקדמות נורמלי באמצעות מיטוזה והוביל ורשות של תהליך זה עשוי tumorigenesis. חיים תא הדמיה של תאים הלה stably לבטא mCherry-ויזת עבודה H2B ו- GFP-טובולין ושוחררה מהצגות בלוק תימידין ז.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם שום עניין פיננסי מתחרות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו אסירי תודה ד ר טנקה Kozo של אוניברסיטת Tohoku, יפן לשיתוף הלה תאים stably לבטא mCherry-היסטון ויזת עבודה H2B ו- GFP-α-טובולין. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NCI DV (R00CA178188) ועל ידי ראשונית מאוניברסיטת נורת'ווסטרן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1x)	Life Technologies	11965-092	חנות ב-4 מעלות; C
DPBS (1x)	Life Technologies	14190-144	חנות ב-4 מעלות;
סי לייבוביץ' s (1x) L-15 בינוני	Life Technologies	21083-027	חנות ב-4 מעלות;
C סרום מופחת בינוני (Opti-MEM)	Life Technologies	319-85-070	חנות ב-4 מעלות; C
פניצילין וסטרפטומיצין	Life Technologies	15070-063 (Pen Strep)	1:1,000 דילול
Dharmafect2	GE Dharmacon	T-2002-02	חנות ב-4 מעלות; C
Thymidine	MP Biomedicals LLC	103056	מומס במים מזויפים סטריליים
Cdt1 siRNA	Life Technologies		Ref 10
Hec1 siRNA	Life Technologies		Ref 13
תאי HeLa המבטאים תאי GFP-H2B
HeLa המבטאים GFP-α-tubulin ו-mCherry H2B	מתנה נדיבה מד"ר קוזו טנאקה מטוהוקו אוניברסיטה, יפן
תמיסת פורמלדהיד	Sigma-Aldrich Corporation	F8775	רעיל, זקוק לזהירות
DAPI	Sigma-Aldrich Corporation	D9542	רעיל, זקוק לזהירות
עכבר אנטי-אלפא;-טובולין	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	Sc32293	1:1,000 דילול
ארנב ant-Zwint1	Bethyl	A300-781A	1:400 דילול
עכבר אנטי-פוספו-גמא; H2AX (Ser139)	Upstate Biotechnology	05-626, שיבוט JBW301	1:300 דילול
Alexa 488	Jackson ImmunoResearch		1:250 דילול
רודמין Red-X	Jackson ImmunoResearch		1:250 דילול
BioLite 6 באר רב צלחת	Thermo Fisher Scientific	130184
35 מ"מ צלחת תחתית זכוכית	MatTek Corporation	P35GCOL-1.5-14-C
Nikon Eclipse TiE מיקרוסקופ הפוך	ניקון מכשירים
מסתובב דיסק עבור קונפוקלי	Yokagawa	CSU-X1
Ultra 888 EM-CCD מצלמה	Andor	iXon Ultra EMCCD
4 אורך גל לייזר	Agilent טכנולוגיות
דגירה מערכת למיקרוסקופים	Tokai Hit	TIZB
תוכנת NIS-elements	Nikon Instruments

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
Puck, T. T., Steffen, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

שילוב תא Mitotic סינכרון ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית ללמוד את התפקיד של מחזור התא רב תכליתיים חלבונים במהלך מיטוזה

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles