מאמר שיטה

שיטה פשוטה ויעילה להקים NK וקווים תא T של חולים עם דלקת כרונית פעילה וירוס אפשטיין בר

DOI:

10.3791/56515

⸱

30 במרץ 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה פשוטה להשגת שיבוטים NK ו T תאים מחולים CAEBV פותחה עם יעילות גבוהה, כמות קטנה של דם היקפיים במינון נמוך של il-2.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר שיטות כבר מתואר להקים NK/T שורות תאים מחולים עם תסמונת לימפומה או lymphoproliferative. שיטות אלה המועסקים מזין תאים, תאי NK או T מזוכך ככל 10 מ"ל של דם או של מינון גבוה של il-2. מחקר זה מציג שיטה חדשה עם אסטרטגיה חזק ופשוט להקים קווי NK ו- T cell מאת culturing ההיקפית של דם תאי תאים (PBMC) עם התוספת של recombinant il-2 בני אדם (rhIL-2), ומשתמש רק 2 מ"ל של דם מלא. התאים יכולים להתרבות במהירות בעוד שבועיים, להישמר במשך יותר מ 3 חודשים. בשיטה זו, הוקמו 7 קווים NK או תא T עם אחוזי הצלחה גבוהים. שיטה זו היא פשוטה, אמינה, החלים על הקמת שורות תאים של מקרים נוספים של לימפומה תא CAEBV או NK/T.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס אפשטיין בר (EBV) נמצא בכל מקום והוא מדביק לא רק בתאי B, אבל גם T ותאי טבעי רוצח (NK), הגורמת מספר מחלות lymphoproliferative EBV-הקשורים NK/T (LPD), לימפומה/לוקמיה, כגון EBV-הקשורים hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme כמו לימפומה, extranodal NK/T-cell לימפומה, האף סוג, NK אגרסיבי תא לוקמיה1,2,3. בין אלה הוא חמור פעיל EBV (SCAEBV) מחלה כרונית, אשר הוא האירוע בעיקר בדרום מזרח אסיה, אשר כעת נחשב LPD הנגרמת על ידי משובט הרחבה של זיהום ב- EBV T או NK תאים4,5,6, 7, אבל בלי הכשל החיסוני לכאורה נוכח מונונוקלאוזיס זיהומי (IM)-כמו הסימפטומים לרבות קדחת, hepatosplenomegaly, לימפדנופתיה בתפקוד הכבד בהתמדה או שהדו-שיח, וכן EBV גבוהים-DNA לטעון דם היקפיים8,9. חולים עם CAEBV יש10,פרוגנוזה11, ו פתוגנזה שלה, התפקיד של EBV אינה ברורה. לכן, תא קווים נגזר EBV-הקשורים NK/T lymphoproliferative מחלות, לימפומות הם מאוד מועיל כמודלים תא עבור ולהבהיר את המנגנון של EBV המושרה NK או תא T התפשטות ועל מערכת היחסים שלה עם שכיחות גבוהה של לוקמיה או לימפומה.

עד היום הוקמו מספר שורות תאים עם טכניקות שונות12,13,14,15,16. קו NK תא אנושי, NK-YS, הוקמה של לימפומה התא NK/לוקמיה, על ידי שיתוף culturing עם קו תא סטרומה העכבר מזין, וגם בנוכחות rhIL-2-ריכוז 20U לכל mL15. KAI3 היה עוד שורה התא NK הוקמה מטופלים עם אלרגיה חמורה נגד יתושים או SCAEBV עם שורת התאים lymphoblastoid עצמיים (LCL), תאים B מומר על-ידי EBV, מזין תאים, תוספת של rhIL-2-100U/mL16. SNK6, SNT8 היו נגזר גידול רקמות האף חולי לימפומה של תאי NK/T על-ידי הוספת מינון גבוה של rhIL-2 (700U/mL)12. בטכניקה דומה, התא SNK-1 היה מחולים CAEBV, תרבותי של PBMC על ידי הסרת תאי T והוספת 700U/mL של rhIL-213,17. SNT13 SNT15 הוקמו על-ידי הסרת CD4 + ותאי CD8 +18. עד כה, שורות תאים אחרים תא T ו NK מחולים EBV-NK/T LPD התפתחו עם שיטה זו19.

החסרונות של השיטות הקיימות שהוזכרו לעיל כוללים את העסקתם של תאים מזין, הדרישה של מינון גבוה של il-2, הניצול של כל 10 מ"ל דם או הטיהור של תאי NK/T, אשר הוא מאוד מאתגר במרפאה עקב נחיצות מאמת אילו סוגי תאים EBV הזה לחשוף מדביק לפני שאתם מתחילים תרבות. כפי CAEBV מתרחשת בעיקר אצל ילדים באסיה, 10 מ ל דם הוא לא קל לרכוש בכל האזורים. במחקר זה, פיתחנו שיטה פשוטה חדש עם אחוזי הצלחה גבוהים להקים קווי NK ו/או תא T על ידי culturing PBMC מחולים CAEBV באמצעות מינון נמוך של rhIL2 ונפח של 2 מ של דם מלא ללא מזין תאים. התוצאות של שיטה זו הוכיחו את יעילות גבוהה, חיסכון בזמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה של המכון לגנטיקה, ביולוגיה התפתחותית, האקדמיה הסינית למדעים, הפרוטוקול של מנחים המוסדית לרווחת האדם.

הערה: ראה איור 1 סכימטי של זרימת העבודה.

1. בידוד של PBMC מחולים CAEBV

  1. לטהר PBMC ראשי מ- 2 מ של דם מלא של חולים CAEBV על ידי מעבר צבע (למשל, Ficoll-פלאק) צנטריפוגה ההוראות של היצרן. לחלופין, הפשרה cryopreserved PBMC של חנקן נוזלי RPMI 1640 בינונית.
  2. להוסיף 2 µL של trypan blue (0.4%) 18 µL תא ההשעיה, לחכות 3 דקות כתם תאים, העברת התליה תא מונה לצלחת למדוד ריכוז של התאים לבין הכדאיות עם מונה הניתן תא אוטומטית.
  3. להכין התליה תא-צפיפות של 2-3 × 106 תאים למ"ל בתוספת מלאה RPMI 1640 תרבות בינוני המכיל 20% בנסיוב אדם (חום לא פעיל ב 56 ° C), 2 מ מגלוטמין, ואנטיביוטיקה (סטרפטומיצין µg/mL 100, 100 פניצילין U/mL). זרע 1 מ"ל של השעיה PBMC לכל טוב לוחות התרבות התא 24-. טוב.
  4. להוסיף 150 U rhIL-2 לכל טוב.
  5. הכנס את הצלחות תרבות חממה2 CO 5% ב 37 º C.
  6. יום 2, להתבונן על מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ (200 X הגדלה); תאים הם במצב טוב כאשר הם עגולים ובהירים.

2. התפשטות תאים ומספור התאים קיימא

  1. להתבונן המורפולוגיה תא תחת מיקרוסקופ (200 X הגדלה), ולעקוב אחר מצבו של צמיחת תאים על-ידי מספור התאים לפני שינוי בינוני: להוסיף 2 µL של trypan blue (0.4%) השעיה תא µL 18, וכן לחשב ריכוז התאים (ראה 1.2, איור 2).
  2. התעלם µL 500 של המדיום לתוך צלחת 24-ובכן, וכן להוסיף 500 µL טרי שלם תרבות בינוני. הוסף 150U rhIL-2 לכל טוב.
  3. לשנות את המדיום פעמיים בשבוע כמו שלב 2.2.
  4. שרטט את עקומת גדילה של תא (איור 3).
  5. כאשר ריכוז התאים קיימא עולה 5 /mL6× 10, לחלק תאים בארות חדשות-ריכוז של 1-2 × 106 תאים למ"ל כל היטב. תהליך זה לוקח 2-4 שבועות.

3. תא Phenotyping על ידי Cytometry זרימה

  1. כאשר התאים הורחב, לאסוף 1 × 106 תאים כדי לקבוע על הפנוטיפים של שורות תאים. צנטריפוגה תאים ב x 240 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (תאי NK/T לזרז בתחתית הצינורית).
  2. למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את המשקעים על-ידי הוספת 7 מ ל PBS. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 240 גרם בטמפרטורת החדר. חזור על פעם אחת.
  3. להוסיף 200 µL בנסיוב אדם כל שפופרת, מערבבים היטב, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה תאים ב- g x 240 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים ב 1 × 106/mL עם PBSA קר (PBS+0.2%BSA). לחלק תאים צינורות 5, כל שפופרת המכילה 2 × 105 תאים.
  5. צנטריפוגה תאים ב g x 240 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע והשהה מחדש את התאים עם מאגר PBSA או PBSA המכיל 10 µL PE (או PE-Cy7) 10 µL FITC ומתויגים נוגדנים כתם קולטני התא של תאי T או NK על קרח, כפי שציין באיור 4. תאים מושעה עם מאגר PBSA משמשים פקד שלילי.
  6. דגירה התאים עם נוגדנים למשך 20-30 דקות על קרח בחושך.
  7. לשטוף את התאים פעמיים עם PBSA קר, מחדש להשעות את התאים עם 300 µL PBSA קר.
  8. ניתוח של פנוטיפ תא עם cytometer זרימה.
    1. להגדיר את Cytometer זרימה במצב "ליצור גליון עבודה". הגדר את תבנית ניסיוני עם מגרש נקודה המציג פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס).
    2. לטעון את הצינור שליטה isotype כדי למטב את המתחים FSC של האס, למטב את ערך הסף FSC לסלק פסולת ללא הפרעה עם האוכלוסייה תא עניין. מחק את כל הפרמטרים חוץ FSC, האס, FITC, PE ו- PE-Cy7.
    3. לבצע פיצוי באמצעות הפקד isotype פקד חיובי יחיד בכל קבוצה 2-צבע ניתוח.
    4. דוגמיות וליצור הלע-ד ר VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 לעומת CD16, CD16 נגד CD3 מתווה נקודה מציג אוכלוסייה שונות של תאים.
      הערה: PBMC שימשו כדי לבצע פיצוי באמצעות הפקד שלילי/isotype ואת הפקד חיובי יחיד. immunofluorescence 2-צבע עם זרימה cytometer נעשה שימוש באופן שגרתי כדי לנתח את הביטוי של סמני פני השטח. הנוגדנים הבאים כלולים: אנטי-הלע-ד ר, אנטי-CD4, anti-CD16 מצומדת עם fluorescein isothiocyanate (FITC), אנטי-CD8, אנטי-CD56, CD3 מצומדת עם phycoerythrin (PE) ו- anti-CD19 מצומדת עם PE-Cy7.

4. הרחבת, הקפאה קריוגנית תאי NK/T

  1. לשנות את המדיום השלמת הניתוח פנוטיפ התא. בזהירות להסיר את מחצית תגובת שיקוע והימנע מלגעת התאים בתחתית הצלחת. להוסיף באותו אמצעי אחסון בינוני תרבות טריים המכילים 300 U/mL rhIL-2 אל צלחות התא.
  2. שנה וחצי של המדיום כל 3 ימים (כמו 2.2) עד התא אשכולות הם נראים בבירור תחת המיקרוסקופ (איור 2). בדרך כלל, תהליך זה לוקח 2-3 שבועות.
  3. העבר את התאים מ 24-ובכן צלחות T25 תרבות מבחנות לאחר ערבוב וולס שונים של אותה שושלת. כפול הנפח של תרבות בינוני מתברר צהוב עד הנפח של המדיום מתרחבת ל- 10-15 מ. הוסף rhIL-2 עם הריכוז של 150 U/mL.
  4. לשנות בינונית 24 שעות לפני הקפאת לאחר 2-3 שבועות גוברת, כאשר התא בנפח גדול יכול להיות שנצפו בעין בלתי מזוינת. למדוד ריכוז תא עם מונה התא.
  5. Centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב 240 x g, מחדש להשעות תא צניפה-צפיפות של 5-10 x 106 תאים למ"ל עם הפתרון מניות קפוא אשר מכיל סרום שור עוברית 90% ולא 10% dimethylsulfoxide (דימתיל סולפוקסיד). הקפאת בקצב של 1 ° C לכל דקות ל-80 מעלות ולאחר מכן להעביר ישירות לתוך חנקן נוזלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר 3 ימים תרבות במהלך הקמת שורות תאים, התאים רב-צורתיות מתחילים להופיע (איור 2). לאחר 7 ימים, תאים לגדול במהירות, כמו גם מספר וגם הכדאיות של תאים גדלו בקצב גבוה (איור 3). בקבוצות קטנות של תאים גלויים בבירור אחרי 10-14 ימים גוברת, כאשר הריכוז תא עולה על 3-6 × 106. בתקופה זו, תאים צריך ניתן להרחיב באמצעות חלוקת לתוך בארות שניים או שלושה לצלחת תרבות. כחודש לאחר מכן, פעם מגיע מספר תא ל 3-5 × 107, הרוזן הוא מספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב פרוטוקול זה, פותחה טכניקה הרומן להקמת NK/T שורות תאים מדם כל המטופלים CAEBV. לעומת השיטות הקיימות, היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הפשטות שלו ודרישת שלה רק נפח קטן של דם, בזמן זה מוצגים אחוזי הצלחה גבוהים ותנאים טובים של התא הכדאיות. יתר על כן, שורות תאים NK/T יכול להתבסס על culturing PBMC מבלי לקבוע סוגי תאים EBV לחשוף נגוע מראש, כמו קביעת תצרוך יותר זמן לפני culturing ודם. לחלופין, ניתן לנתח שורות תאים, אפשר לטהר פנוטיפים שונים של תאים עם cytometry זרימה לאחר הקמת קו תא. חוץ מזה, השיטה עושה שימוש במינון נמוך של rhIL-2 ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שסמית, X.Z. ו- X.C. הם ממציאים על ממתינים בקשות לפטנטים כיסוי שימושים פוטנציאליים של שיטה זו להקמת קווי התא NK/T והן לקווי תא הוקמה במחקר זה. שסמית ', ' X.Z., X.C. להכריז אין אינטרסים כלכליים מתחרים בעבודה זו. המחברים הנותרים להכריז שיש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה את מפתח פרוייקטים של סינית האקדמיה למדעים (KFZD-SW-205), אסטרטגי ביולוגי משאבי טכנולוגיית מערכת תמיכה של סינית האקדמיה למדעים (CZBZX-1 ו- ZSSB-004), ועל ידי מענקים של קרן המדע הלאומית של סין ( 81401640) שנגחאי קרן מדעי הטבע (14ZR1434800).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Hu HLA-DR FITCBDנוגדן 560944 ל-FACS
Hu CD4 FITCBDנוגדן 555346 ל-FACS
Hu/NHP CD8 PEBDנוגדן 557086 ל-FACS
Hu CD3 PEBD555340נוגדן ל-FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406 נוגדן ל-FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BDנוגדן 556647 לנוגדנים FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728ל-FACS
אנושי IL-2Roche11147528001
CO2 חממתSANYO
צנטריפוגהTechcompCT6Tצנטריפוגה
OLYMPUS CKX53CKX53
מונה תאים אוטומטיCountstarIC 1000לספירת תאים
24 באר אשכול תרביות תאיםCorning Incorporated3524לוחות פוליסטירן
25 ס"מ בקבוק תרבית תאיםקן707001פוליסטירן
FBSGibco10270רכיב של מדיום תא
RPMI בינוני 1640חיים22400089עבור מדיום תא
L-גלוטמיןאמרסקו374רכיב של מדיום תא
100 x תמיסת סטרפטומיצין פניצילין BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309רכיב של מדיום תא
Ficoll paque בתוספתGE Healthcare17-1440-03לבידוד חוץ גופי של לימפוציט
DMSOSigmaD2650להקפאת תאים
ציטומטר זרימהBDFACSAria II
תוכנה רכהBDBD FACSניתוח FACS של תוכנות רכות
חממת מיקרוסקופ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency? Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NK TEBVIL 2Gradient CentrifugationCryopreservation

מאמרים קשורים