Method Article

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין שיטה יעילה decellularize, decalcify cochleae העכבר עבור ניצול כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אצל יונקים, תאים שיער mechanosensory המאפשרים שמיעה חוסר היכולת להתחדש, אשר מוגבל טיפולים עבור אובדן שמיעה. אסטרטגיות רפואה רגנרטיבית הנוכחי התמקדו משתילים בתאי גזע או מניפולציה גנטית של סביב תמיכה התאים באוזן הפנימית כדי לעודד החלפה של תאים פגומים גזע כדי לתקן אובדן שמיעה. ובכל זאת, מטריצות (ECM) עשוי לשחק תפקיד חיוני גרימת ושמירה על תפקוד של תאים שיער, לא נבדקה היטב. באמצעות את שבלולי ECM בדומה לפיגום לגדל תאי גזע בוגרים עשויים לספק תובנות ייחודיות איך הרכב ואת הארכיטקטורה של הסביבה חוץ-תאית מסייע תאים הסדירה פונקציה השמיעה. כאן אנו מציגים שיטה אנליטית, decellularizing cochleae של עכברים להשתמש פיגומים מקבל תאי גזע בוגרים perfused. בפרוטוקול הנוכחי, cochleae הם בודדו אותנו מהמתרחש עכברים לאללה, decellularized, decalcified. לאחר מכן, תאים ג'לי האנושי וורטון (hWJCs) הם בודדו אותנו מהמתרחש הטבור היו perfused בזהירות לתוך כל שבלול. Cochleae שימשו ריאקטורים, התאים היו תרבותי עבור 30 ימים לפני שעברו עיבוד לניתוח. Decellularized cochleae נשמרות לזיהוי מבנים חוץ-תאית, אך אינו חושף את הנוכחות של תאים או מורגש שברי DNA. התאים perfused לתוך שבלול פלשו רוב הפנים והחוץ של שבלול, גדלה ללא תקלות משך זמן של 30 ימים. לכן, השיטה הנוכחית ניתן ללמוד איך שבלולי ECM משפיע על התא התפתחות והתנהגות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבלול הוא מבנה לולייני המורכב נמצאו הרקה. הוא מורכב של המבוך הגרמי החיצוני ואת המבוך membranous קונצנטריים, פנימית1. המבוך membranous מורכב 3 משבצות נוזלים: סקאלה vestibuli, סקאלה מדיה, ו טימפני סקאלה1. התקשורת סקאלה בתים האפיתל חושית, המורכב משילוב של מספר רב של סוגי תאים, אך התאים שיער חושית (HC), אשר מגלי אנרגיה מכנית של גלי קול דחפים עצביים2, הם מעניינים במיוחד. חשיפה טראומה אקוסטית3,4,5, תרופות6,7,המחלה8והזדקנות9 כל יכול לגרום תפקוד לקוי השמיעה דרך המוות HC. איבוד תאים שיער אצל יונקים הוא קבע, בניגוד HCs העופות, אשר יכול להתחדש לאחר פציעה10.

מגוון רחב של מאמצי מחקר עכשווי ביקשו לשחזר HCs אבוד, אף הגישות ניסיוני ספציפיים משתנים. מניפולציה של ביטוי גנים בתוך האפיתל חושית, השתלה של תאי גזע הבדיל מחוץ לגוף הם גישות דומיננטי בתחום, למרות שיטות אינדוקציה שואפים להבדיל תאי גזע לתוך שבלולי organoids היה ניסיון11,12,13. כל הגישות הללו הוא גם מסתמך ישירות על תאי גזע, או התפתחותית הותאם בשימוש בתאי גזע; עם זאת, רגע משותף, שעשוי להיות קריטי, אלמנט זה ה-ECM של שבלול עצמו14,15.

ECM לא רק מספק תמיכה פיזית תאים ורקמות, אשר כולל משטח אדהזיה תא, התפשטות, הישרדות של ההעברה, אך גם ממלא תפקידים חיוניים להתפתחות HCs ומן ספירלה גנגליון15,16 ,17. באופן טבעי ECM המתרחשים מספק אותות אינדוקטיבית להנחות תא בנחישות פנוטיפ ו/או תא אדהזיה התפשטות, הישרדות18. כתוצאה מכך, השימוש של שבלול decellularized בשילוב עם hWJCs בתרבית מציעים הזדמנות ייחודית לגלות את התפקיד של התחדשות ECM ו- HC. HWJCs הם סוג זמינים, נתינת תא מבודד מן האדם חוטי חבל הטבור המתנהגים כמו גזע mesenchymal19. HWJCs הראו את היכולת להבחין תא neurosensory שושלות20,21. לפיכך, בפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד, decellularization ו זלוף של cochleae מ- C57BL הגוויות עכבר עם hWJCs עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים, לרבות בעלי חיים המתת חסד, נערכו לפי שאושרו אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) הפרוטוקול (תגיד #2014-2234) במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס (KUMC).

הערה: HWJCs הם בודדו אותנו מהמתרחש חוטי חבל הטבור אנושי זה נתרמו על ידי מטופלים סיפק מדעת, דגימות שימשו לפי הפרוטוקולים שאושרו על-ידי אוניברסיטת קנזס הוועדה בנושאים אנושיים (KU-IRB #15402).

1. עצם הרקה הקציר ובידוד שבלול

  1. לערוף כראוי לאללה, בת שבוע 15 עכבר על ידי חיתוך בין הגולגולת לבין חוליות הראשון עם זוג מספריים כירורגיים חדים, ואז לרסס את הראש עם 70% אתנול לחטא (איור 1 א').
  2. קטיעות הגולגולת במטוס מאמצע-הווריד באמצעות אותו זוג מספריים כירורגיים (איור 1B-C, קווים מקווקווים) חדה.
  3. הסר את רקמת המוח לגולגולת באמצעות זוג מלקחיים (איור 1D, ראש חץ).
  4. לזהות העצם הטמפורלית דרך נוכחות של השמיעה העצב vestibular שורשים (איור 1E-F, ראשי חץ) על החלק הפנימי של הגולגולת, תעלת האוזן מבחוץ (איור 1F, חץ). לחתוך בזהירות דרך הגולגולת כדי לבודד את עצם הרקה מהשארית של הגולגולת (איור 1 ג'י).
    הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שתהיה אפשרות לחטט בעדינות את עצמות הגולגולת מן העצם הטמפורלית שמסביב ללא צורך חיתוך.
  5. הכנס המלקחיים בסדר פתיחת תעלת האוזן כ 5 מ מ (איור 1 H), אז הטיפים לא לסכן את ניקב שבלול. בעדינות שבירת העצם של בולה (איור 1 H, האזור המוצלל אדום) אז זה שברים (קואיור 1I, אדום מנוקד).
    הערה: אם יש צורך, מיקרוסקופ לנתיחה עשויים לסייע בתהליך זה כדי להבטיח מיקום מדויק ומניפולציה של כלי נגינה.
  6. בעזרת מלקחיים בסדר, לחטט משם את שארית בולה מן העצם הטמפורלית, חשיפת המבוך הגרמי של שבלול (איור 1J, מרובעים אדום).
  7. מניחים צלחת פטרי גדולה מספיק כדי להכיל הרקה (לדוגמה, 30 מ מ ומעלה) מתחת לנתח היקף שדה ראייה, למלא אותו עם מספיק פוספט Buffered מלוחים (PBS) כדי לכסות את העצם הטמפורלית (למשל, 0.5-1 מ ל).
  8. להטביע הרקה עם בולה להסיר את PBS עם החלונות עגולה, סגלגל של שבלול פונה כלפי מעלה.
    הערה: הסרת שיווי המשקל של שבלול הוא לא הכרחי, כפי שיווי המשקל משמש גם נקודת אחיזה עבור מניפולציה המכוונת תכונות של שבלול (איור 1I ו איור 2B).
  9. באמצעות זוג מלקחיים ultra-בסדר, להסיר את העורק stapedial, אשר עובר דרך באוזן.
  10. הוסף עצה אחת של המלקחיים ultra-בסדר דרך הקשת של באוזן שבו העורק עברו, והרם בעדינות באוזן כלפי מעלה. באוזן disarticulated צריך להרים את החלון הסגלגל.
  11. משתמש קצה אחד של המלקחיים ultra-בסדר, לנקב את האליפסה, בחלונות העגולים.
  12. שימוש של PBS 1 x מלא 28.5-מד מזרק עם אבובים (הקוטר הפנימי 0.28 מ מ, הקוטר החיצוני 0.61 מ"מ) מצורפים, מקם את הצנרור מעל החלון הסגלגל (איור 2A -B).
    הערה: הפתיחה של הצינור ניתן לטפל באמצעות מלקחיים ultra-בסדר לסייע להבטיח מיקום מדויק.
    1. השתמש מזרק טריים ואת צינורות עבור כל שבלול.
  13. Perfuse 2 מיליליטר 10% אנטיביוטיקה-antimycotic (אנטי-נגד) ו- 10% פניצילין-סטרפטומיצין (עט-דלקת) ב- PBS דרך שבלול מעל 5 דקות כדי להסיר את perilymph. מה קורה מהר מדי עם לחץ רב מדי יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול.
    הערה: נהיגה באופן ידני את המזרק ביד כדי perfuse את הנוזל דרך שבלול הוא יעיל, למרות משאבה זלוף יכול לשמש אלטרנטיבה.
    1. אם פרפוזיה באופן ידני, השתמש זוג הקנס, עצמי סגירת מלקחיים לייצב שבלול (איור 2 א) במהלך זלוף על ידי האוחז בחלק שיווי המשקל של העצם הטמפורלית.
      הערה: למרות שאינך נדרש, זה משאיר שתי ידיים חופשיות להתמודד עם מכשירים; יד אחת יכול להסיע את המזרק (איור 2 א) ואילו השני ניתן למקם את הצנרור כראוי (איור 2B).
    2. שלב זה קדימה, לטפל כדי למנוע חשיפת שבלול שלא לצורך לשידור. היכרות עם בועות אוויר לתוך שטחים נוזלים יחסום זרימת נוזל ולאחר ייבוש נוסף יגרום נזק המבנים הקנס בתוך שבלול.
  14. להסיר ולמחוק כל שריר רקמות ועצמות והשריד באמצעות מלקחיים משובחים.
  15. במידת הצורך, אחסן cochleae מבודדים ב 4 ° C אנטי-אנטי 10%, 10% הפתרון עט-דלקת ב- PBS עד שבעה ימים בשינויים קבועים של פתרון אנטיביוטי כל 48 שעות.

2. עיבוד שבלול

  1. Decellularization
    1. עבור כל שבלול, מילוי בקבוקון נצנוץ 20-מ ל זכוכית עם dodecyl נתרן 1% חומצה גופרתית (מרחביות) פתרון במים מיוננים (DI) אשר משמש כדי decellularize שבלול.
    2. חותכים את העצה ממני פיפטה פלסטיק 7-mL העברה באמצעות סכין גילוח כך הפתח מספיק גדול עבור שבלול לעבור.
    3. באמצעות פיפטה של העברה, בעדינות צייר שבלול לתוך פיפטה כך עובר לקצה ניתוק על ידי כמה מילימטרים.
    4. לגרש שבלול לתוך המבחנה 1% פתרון מלא נצנוץ מרחביות.
    5. הפיצו 2 מ של 1% מרחביות במים מיוננים (DI) דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.
    6. למקם את המבחנה נצנוץ מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר.
      1. שנה 1% פתרון מרחביות כל 24 שעות ביממה במשך 72 h. . שמור על עצמך בעת שינוי מרחביות לחשוף לעולם לא שבלול לאוויר.
    7. רחץ שבלול שלוש פעמים במשך 30 דקות כל במים DI.
לבצע את מנקי בבקבוקון נצנוץ באותו המשמש את ההאשמות מרחביות; בשלב זה, שבלול הוא decellularized.
  • Decalcification
    1. הסר את יתרת כמות המים DI המבחנה נצנוץ, משאיר מספיק כדי להשאיר שבלול מתחת למים.
    2. כדי להתחיל decalcification, הוסף 5 מ של 10% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.02 נקודות ז) במים DI נצנוץ למבחנה המכילה שבלול.
    3. הפיצו 2 מיליליטר 10% EDTA במים DI דרך שבלול בבקבוקון נצנוץ באמצעות פיפטה של העברה.
    4. הכנס את המבחנה נצנוץ בחזרה מסובב, ולאפשר את המבחנה נצנוץ לסובב במהירות של סל ד 10 במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר. לשנות את הפתרון EDTA 10% בכל 24 שעות ביממה במשך 72 h. יש להיזהר בעת שינוי פתרונות כך שבלול ואינו חשוף לאוויר.
    5. לשטוף שבלול 3 פעמים עבור 2 h כל עם PBS 1 x; בשלב זה, שבלול הוא decalcified.
  • אחסון
    1. לאחסן את cochleae עבור עד 72 שעות ב- 10% אנטי-נגד, 10% עט-דלקת פתרון ב- PBS ב 4 º C.
      הערה: פרקי זמן ממושכים אחסון ייתכן שניתן בשינויים קבועים של פתרון לאנטיביוטיקה; עם זאת, אחסון מורחב של cochleae מעובד לא אומתה ב פרוטוקול זה.

    • 3. רכש והרחבה של hWJCs

    1. לבודד hWJCs על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר22. בקצרה, קטע חבל הטבור מיתרי למקטעים של 3 ס מ.
    2. בזהירות עושים חתך רדוד עם איזמל לאורכו על כל קטע הטבור לפרוש ולחשוף וורטון הטבור. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את כלי הדם.
    3. רחץ הטבור מקטעי פעמיים עם מספיק PBS (למשל, מ 40 ל 60 מ מ פטרי) ומטביעים את הרקמה. דק מינצ מקטעי רקמת עם אזמל. מעכלים רקמת ב- 100 מ מ צלחת פטרי עם 50 מ של עיכול בינוני (0.2% מסוג 2 collagenase, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, בגלוקוז נמוך בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco)).
    4. מקום רקמות לעכל בינוני על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד לילה ב- 5% CO2, חממה 37 º C. למחרת, לדלל עיכול בינוני ביחס של 1:16 % 2 אנטיביוטיקה-antimycotic ב- PBS, גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 10 דקות להשליך תגובת שיקוע.
    5. Resuspend כדורי ב Mesenchymal תא גזע הצמיחה בינונית (MSCGM) ולשלב מחדש תאים. צלחת תאים על צפיפות של 7 x 103 תאים/cm2 בתרבות רקמה מטופלים T-75 המבחנות. תרבות HWJCs ב MSCGM, להרחיב את המעבר 5 לניסויים.
      הערה: HWJCs עשוי להיות תת תרבותי לתוך T-מבחנות גדולות יותר (למשל, T-150, T-300) כאשר passaging להגדיל תשואה של hWJCs לניסויים.

    4. אינפוזיה של hWJCs אל Decellularized Cochleae

    1. להכין decellularized cochleae
      1. באמצעות הטכניקה aseptic, לשטוף cochleae מאוחסנת ב- PBS 1 x שלוש פעמים במשך 30 דקות כל אחד.
      2. להעביר את cochleae לתוך בארות נפרדים של צלחת 24-ובכן, ולהוסיף 1 מ"ל של 37 ° C מראש חימם MSCGM.
      3. דגירה cochleae ב 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה לקבוצות של h 1 לפני אינפוזיה של תאים.
    2. מביצועם hWJCs, resuspend
      1. שטיפת hWJCs עם 37 ° C מראש חימם 1 x PBS פעמיים.
      2. הוסף מספיק 37 ° C מראש חימם טריפסין עם EDTA 0.5% כדי לכסות את המשטח הקיבול של התא.
      3. דגירה hWJCs של עד 5 דקות 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה.
        1. ודא כי 90% של תאים יש מנותקת השטח התרבות התא על-ידי הצגת תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
          הערה: תאים ינוע הכלי תרבות הוא טפח בעדינות, יש להתנתק. תאים דייל, יש אינו מנותק.
        2. טפח בעדינות את צידי הבקבוק עוד יותר מכך התאים המצורפת.
      4. באמצעות הטכניקה aseptic, hWJCs העברה מכלי הקיבול תרבות אל צינור חרוטי 50-mL המכילים אמצעי אחסון המקבילה של MSCGM לנפח של טריפסין נהגו מביצועם התאים.
      5. גלולה של hWJCs על ידי צריך שתוציאו ב 500 g x בטמפרטורת החדר (~ 27 ° C) במשך 5 דקות.
      6. האחות תגובת שיקוע, resuspend hWJCs של MSCGM-ריכוז של תאים למ"ל 500,000.
    3. Perfuse cochleae
      1. העברת cochleae צלחת 24-ובכן חדשה באמצעות פיפטה של העברה.
      2. להוסיף טיפה של MSCGM כל שבלול כדי למנוע כל שבלול ממנו להתייבש.
      3. בעדינות אוריינט שבלול באמצעות מלקחיים ultra-בסדר, כך החלונות סגלגל ועגול פונות מעלה.
        הערה: שמור על עצמך קיצוני בעת טיפול ישירות כל שבלול כמו שבלול בקלות יתערער.
      4. באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד סטרילי עם צינורות מחוברים, צייר עד 0.2 מ"ל resuspended hWJCs (100,000 תאים).
      5. בעזרת מלקחיים בסדר מעוקר, הצב אבובים החלון הסגלגל.
      6. בעדינות, לאט לאט perfuse שבלול 0.2 מ של hWJCs resuspended באמצעות מזרק אינסולין 28.5-מד מחובר לצנרת פוליאתילן (הקוטר החיצוני: 0.61 מ מ, קוטר פנימי: 0.28 מ מ) במשך כ 5 דקות.
      7. לאחר זלוף, להוסיף 0.8 מ של 37 ° C מראש חימם MSCGM את טוב המכיל שבלול להביא את הנפח הכולל בבאר 1 מ"ל.
      8. חזור על צעדים 4.3.3-4.3.7 עבור כל שבלול, באמצעות מזרק טריים, אבובים בכל פעם.
      9. הכנס perfused cochleae 5% CO2, 37 ° C תא תרבות חממה, ושנה מדיה שלוש פעמים בשבוע.

    5. שבלול הקציר ושימור

    הערה: Cochleae עשוי להיות בתרבית וקצרו בכל נקודת זמן עד 30 ימים שלאחר זלוף.

    1. כדי לשמר את cochleae, לתקן את paraformaldehyde 4% ב- PBS 1 x לילה ב 4 ° C על פלטפורמה נדנדה.
    2. לאחר קיבוע, לשטוף cochleae עם 1 x PBS שלוש פעמים במשך 5 דקות.
    3. בהדרגה מייבשים שבלול עם אתנול, לנקות עם הממס פחמימן אליפטיות לפני הטבעה של פרפין.
    4. סעיף דגימות עובי של 10 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום הר על זכוכית שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: הדוגמאות הם עכשיו מוכן היסטולוגית או immunohistochemical עיבוד באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    באמצעות השיטות המובאות כאן, decellularization מוצלחת של cochleae הוערך על-ידי בדיקת נוכחות או היעדרות של ה-DNA באמצעות 4 אינץ ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. Cochleae נחשבו decellularized באופן מלא אם הדנ א לא זוהה בתוך שבלול decellularized. שבלול יליד מהניסוי הקודם זה לא עברה decellularization או decalcification שימש פקד חיובי כדי להמחיש את המבנים ותאים שנמצאו באופן מסורתי שבלול העכבר C57BL. שבלול decellularized-decalcified, אשר לא היה שום hWJCs חלוט, שימש פקד שלילי. אין גרעי...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    בהצלחה הראו כי ניתן להסיר תאים שבלולי יליד שבלול באמצעות תהליך decellularization, מה שמאפשר עבור השימוש של שבלול לגרדום רקמות מורכבות, תלת מימדי. סנטי ואח. 15 פיתח את שיטת הראשוני עבור decellularizing cochleae, במדויק העריכו את אמצעי האחסון של מבנים רבים-שבלולי דרך בעזרת מיקרוסקופ אור גיליון23. עבודה מוקדמת כל כך שימש בסיס חזק הנדסת רקמות וטכניקות התרבות התא המוצג כאן. שבלול decellularized בהצלחה יכול להיות מוחדר עם תאים ולאחר מכן תרבותי לתקופה ממושכת של זמן. תיאור...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    הפרויקט הנוכחי מומן על ידי אוניברסיטת קנזס הוכחת הרעיון קרן. ברצוננו להודות. האחיות-KUMC (קנזס סיטי, קאי אס) עבור מסייע לנו בהשגת האנושי חבל הטבור חוטי יורגנסן דוד על סיוע עם תרבויות cochleae.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Allegra X-14R צנטריפוגהבקמן-קולטרB08861
    צינורות חצי קשיחים אינטרמדייםבקטון דיקינסון427401
    ניו ברונסוויק Innova 2000 Orbital ShalerEppendorfM1190-0002
    מספריים כירורגייםכלי מדע עדינים14060-10
    מלקחיים עדיניםכלי מדע עדינים11370-40
    מלקחיים עדינים במיוחדכלים מדעיים עדינים18155-13
    צינורות חרוטיים 50 מ"לפישר סיינטיפיק12565271
    צלחת פטריפישר סיינטיפיקFB087579B
    U-100 מזרק אינסוליןפישר סיינטיפיק14-829-1B
    בקבוקון נצנוץ פישרסיינטיפיק03-341-73
    מסובבפישר סיינטיפיק88-861-049
    העברה פיפטהפישר סיינטיפיק22-170-404
    סכין גילוחפישר סיינטיפיק12-640
    אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיתפישר סיינטיפיק15-240-062
    פניצילין-סטרפטומיציןפישר סיינטיפיק15-140-122
    צלחת24 בארותפישר סיינטיפיק07-200-84
    SuperFrost PLUS זכוכית מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
    העברת פיפטהפישר סיינטיפיק22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPIפישר סיינטיפיקP36935
    Clear-Rite 3פישר סיינטיפיק22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 חממת CO2 Thermo ScientificFisher Scientific13-998-078
    מדיום גידול תאי גזע מזנכימליLonzaPT-3001
    Trypsin-EDTALonzaCC-3232
    TPP T-75 בקבוק תרביתMidSciTP90076
    TPP T-150 בקבוק תרביתMidSciTP90151
    TPP T-300 בקבוק תרבותMidSciTP90301
    דיסקציה מיקרוסקופNikonInstruments Nikon SMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL מיקרוסקופ הפוךNikon InstrumentsMFA51010
    NuAire Class II, סוג A2 ארון בטיחות ביולוגיתNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    1% תמיסת SDSסיגמא-אולדריץ'436143-100G
    10% EDTAסיגמא-אולדריץ'E9884-100G

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
    2. LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
    3. Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
    4. Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
    5. Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
    6. Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
    7. Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
    8. House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
    9. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
    10. Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
    11. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
    12. Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
    13. Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
    14. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
    15. Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
    16. Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
    17. Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
    18. Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
    19. Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
    20. Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
    21. Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
    22. Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
    23. Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
    24. Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
    25. Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
    26. Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Mouse Cochlea DecellularizationInner Ear Tissue EngineeringCochlear ECM ScaffoldDecalcification ProtocolHuman Wharton s Jelly CellsTemporal Bone IsolationExtracellular Matrix AnalysisCell Perfusion TechniqueOrgan of Corti PreservationTissue Engineering Scaffold

    Related Articles