שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג'לים למסמס את הג'ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטות מכתימים DNA חשובים מאוד למחקר ביורפואי. תיכננו שיטה פשוטה המאפשרת ויזואליזציה DNA בעין בלתי מזוינת על ידי היווצרות התמיסה צבעוניים. זה עובד על ידי השריה של אקרילאמיד או agarose DNA ג'ל בריכוז של 1 x (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) SYBR Green אני (SG אני), מ מ 0.20 ניטרו כחול tetrazolium שמייצר סגול לזרז של formazan כאשר הם נחשפים לאור השמש או אור כחול במיוחד. בנוסף, בדיקות דנ א השחזור בוצעו באמצעות פלסמיד עמיד אמפיצילין ב ג'ל agarose צבעונית עם השיטה שלנו. מספר גדול יותר של המושבות הושג בשיטה שלנו מאשר עם מסורתיים מכתים באמצעות ג. אני עם תאורה אולטרה סגולה. השיטה המתוארת הוא מהיר ספציפיים, שאינם רעילים עבור זיהוי ה-DNA, המאפשר ויזואליזציה של מולקולות "בעין בלתי מזוינת" בלי transilluminator, והוא מתאים לשימוש שדה וזולה. מסיבות אלו, יש DNA החדש שלנו מכתים שיטה היתרונות הפוטנציאליים לפעילות המחקר והתעשייה.
מבוא
עם ההתקדמות לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, מחקרים שכללו דנ א דרושים טכניקות טובות יותר כדי לנתח את הדנ א. השיטה הראשונה עבור ה-DNA מכתים היה כסף מכתים, הרגישה מאוד אבל חסר סלקטיביות, אינו מאפשר שחזור הדגימה. מאוחר יותר, ההתפתחות של צביעת DNA פלורסנט מותר כימות סלקטיבי של ה-DNA עם האפשרות של שחזור הדגימה. אחד צבעי פלורסנט הראשון משמש DNA כימות היה אתידיום ברומיד1, אשר הוא מוטגניות2. עם זאת, כעת ישנם צבעי פלורסנט משופרת, כי הם יותר רגישים, כגון GelRed ו- SYBR Green ובטוחה אני (SG אני)3; אבל כל אלה צבעי פלורסנט מחייבות השימוש של אולטרה סגול (UV) transilluminator או fluorimeter.
ישנן טכניקות אחרות עבור בעליל מכתים ה-DNA, כגון מתילן כחול4 וקריסטל ויולט5,6,7,8,9, אך כל אלה סובלים רגישות מופחתת, סלקטיביות. המלחים tetrazolium הן תרכובות אורגניות רגישים צמצום, כאשר זה קורה הם יוצרים לא מסיס, formazan צבעוניים לזרז10,11. לאחרונה, כמה מלחים tetrazolium טרינארית הוכחו לאגד DNA עקב שלהם טבעות חיובי tetrazolium12.
האחרונות הפרסום13, הוצע טכניקה גלויה חדשה כדי להכתים ולכמת DNA ב לזיהוי ג'לים, באמצעות הפחתת מלח tetrazolium טרינארית בשם ניטרו כחול tetrazolium (NBT) ו צבעי פלורסנט כמו אתידיום ברומיד, GelRed, SYBR ירוק אני וזהב SYBR. התגובה הזו עבד בנוכחות אור כחול או אור שמש ואיפשר שחזור הדגימה עם איכות משופרת בהשוואה לשימוש של ס ג אני transilluminator UV. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט לשיטת ההגדלה באמצעות tetrazolium מלחי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ויפעילו את הג'ל
- הכינו את הלא-denaturing 12% ג'ל לזיהוי ג'לים בעזרת המתכון נתרן Dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) נמצא Sambrook וראסל14 אך באמצעות מים במקום מרחביות.
- כדי להכין 5 מ ל ג'ל לפתרון, השתמש 1.7 מ ל מים מזוקקים, 2 מ של אקרילאמיד/bis אקרילאמיד (30/0.8% w/v), מ 1.3 ל 1.5 M טריס pH 8.8, מ 0.05 ל 10% קירור ו 0.002 מ"ל של TEMED.
- להכין 2 מ ל ג'ל הערימה להשתמש 1.5 מ ל מים, 0.33 מ של אקרילאמיד/bis אקרילאמיד (30/0.8% w/v), 0.25 mL של 1 מ' טריס pH 6.8, מ 0.02 נקודות ל 10% קירור ו 0.002 מ"ל של TEMED. הממדים של הג'ל הם 7.3 ס מ x 8.2 ס מ x 0.075 ס"מ (l x ע w x).
הערה: משתמש במסרק טוב 15 של 0.75 מ מ עובי על הרגישות הכי טוב.
- הוסף את כמויות מתאימות של 6 x טעינת מאגר ודגימת דנ א כדי צינור microcentrifuge 1.5 mL (למשל שימוש 1 µL x 6 טעינת מאגר כדי µL 5 של דנ א).
- מקם את הג'ל בבית הבליעה אלקטרופורזה אנכי.
- למלא את החדר עם 750 מ ל 1 מאגר x TAE לבדוק 2 משטחים. להכנת 1 ליטר של 50 x TAE, השתמש g 442 בבסיס טריס, 57.1 מ ל חומצה אצטית קרחונית, 100 מ של 0.5 M EDTA pH 8. להוסיף מים מזוקקים נפח סופי של 1 ל'
- לטעון את הדגימות הג'ל. הפעל את הג'ל ב- 100 וולט כבר שעתיים.
- לחלופין, להכין 1 x TAE agarose ג'ל באמצעות מתכון שנמצאו Sambrook14.
- להוסיף 300 מ של 1 x TAE אל התא אלקטרופורזה אופקית. הפעל את ג'ל למשך 45 דקות ב- 100 וולט.
2. NBT-SG אני מכתימה (איור 1).
-
ג'ל אקרילאמיד מכתים.
- להכין את הפתרונות: 0.1% w/v NBT ו- 1.2 x ג אני.
הערה: ניתן להשתמש אתידיום ברומיד, GelRed וזהב SYBR במקום ס ג אבל ג היה לי את הביצועים הטובים ביותר. - יוצקים 16.75 מיליליטר 1.2 x SYBR ירוק אני הפתרון לתוך מיכל בגודל המתאים.
הערה: . היינו המכסה של תיבה עצה פיפטה כגורם מכיל, אמצעי אחסון אלה מחושבים כדי לכסות את הג'ל משתמשים במיכל הזה; המימדים הם 11.6 ס מ x 7.6 ס"מ x 2.6 ס"מ (l x ע w x). - מקם את הג'ל הפתרון. להוסיף 3.25 מ של 0.1% w/v NBT פתרון לתת 0.2 מ מ NBT ו- x 1 (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) ס ג אני ריכוזים הסופי.
- לאטום את המיכל עם הסרט פלסטיק, לחלוטין לעטוף את המכולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את כל אור מקיף.
הערה: הסרט פלסטיק משמש למניעת ניתזים וכדי למנוע תגובה של רדיד האלומיניום עם הפתרון מוכתמים. - לנער 25 דקות על תפקודי לב / נשימה-60 סל ד.
- הסר אלומיניום מכסה פלסטיק. לחשוף אור מקסימלית 90 דקות. בדוק כל 5 דקות עד להופעת הלהקה עניין.
- כדי להשתמש אור כחול, להכין את protoboard עם 3 דיודות פולטות אור (LED) ומניחים על הנוריות כ- 5 מ"מ מהמשטח ג'ל (בדוק ההכתמה באופן רציף, משך הזמן הדרוש יהיה תלוי האינטנסיביות של מקור האור LED).
- להכין את הפתרונות: 0.1% w/v NBT ו- 1.2 x ג אני.
-
ג'ל Agarose מכתים.
- לאחר הכנת והפעלה של agarose 1% ג'ל כמתואר בסעיפים 1.4 (הממדים הם 1 ס מ x 6.2 ס מ x 7 ס מ; l x w x d), בצע את הצעדים אותם כמו 2.1 עם שינויים אלה:
- יוצקים 41.9 מיליליטר 1.2 x ג אני פתרון למכסה של תיבה עצה פיפטה; המימדים הם 11.6 ס מ x 7.6 ס"מ x 2.6 ס"מ (l x ע w x). הוסף 8.1 מ של 0.1% NBT פתרון.
- לאטום את המיכל עם הסרט פלסטיק ולאחר מכן לחלוטין לעטוף את המכולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את כל תאורת.
- לנער h 1 ב תפקודי לב / נשימה-60 סל ד.
3. נתונים ניתוח.
-
NBT-SG אני עקומות כיול.
- לקבל תמונות ג'ל על-ידי סריקה ברזולוציה של 1200 dpi.
- תוכנה פתוחה עבור ניתוח תמונות. יישר את התמונות באמצעות עורך תמונות. הפעל את densitometry של התמונה.
- לחשב את השטח מתחת לעקומה. הכינו את גרף של האות/אותמקס לעומת ריכוז ה-DNA.
4. DNA השחזור.
- הכנת ג'ל agarose 1% 1 x TAE בעזרת המתכון שנמצאו Sambrook14.
- להוסיף 300 מ של 1 x TAE אל התא אלקטרופורזה אופקית. לטעון µL 4 של 100 ng/µL pDJ10015 פלסמיד, סולם הדנ א בעקבות ערכת נתון באיור2. הפעל את הג'ל מאובטח ב- 100 וולט.
- מארק, שוקל שני צינורות microcentrifuge 2 מ"ל.
- חותכים את הג'ל למטה באמצע כדי שיהיה זהה לשני חצאים. כל אחד צריך להכיל את הסולם, על פלסמיד מדגם להשוות את טכניקות צביעת שונים. ייצוג סכמטי הוא באיור2.
- כתם אחד חצי עם NBT-SG. אני כמו שלב 2.
- לגזור את הלהקה פלסמיד באמצעות אזמל נקי. להציל את החתיכה ג'ל בצינור אחד ומשקלו.
- כתם החלק השני של הג'ל עם ס ג אני עם 50 מ של 1 x ג אני הפתרון וללחוץ לאט (60 סל ד) את הג'ל על 1 h בחשכה.
- להניח את הג'ל על transilluminator ולחשוף עבור 2 דק לחתוך את הלהקה פלסמיד באמצעות אזמל נקי.
- לשמור את החתיכה ג'ל בצינור השני, שוקל.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה תוך שמירה על הצינורות ב-20 ° C.
- לבצע את החילוץ פלסמיד באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרי.
5. פלסמיד נורמליזציה.
- צינור microcentrifuge 1.5 mL, להוסיף 10 µL של פלסמיד שחולצו µL 60 סוג אני מים. מיקס להעביר cuvette קוורץ 60 µL או להשתמש 2 µL ישירות Nanodrop.
- למדוד את ספקטרום בליעה בין 230 ל 320 ננומטר. חישוב פלסמיד הריכוז של המדגם באמצעות הנוסחה הבאה:
איפה D הוא הגורם לדילול חלה (במקרה הזה זה 70/10), Ax הוא קליטה ב- x nm ו- 50 הוא פקטור המרה µg/mL עבור dsDNA. - לדלל דגימות 9.1 ng/µL.
- שינוי צורה Escherichia coli (e. coli) המוסמכת תאים (למשל XL10 זהב) בעקבות ה ינו טרנספורמציה הליך-16 באמצעות µL 5 שתדללו מדגם.
- לספור את מספר מושבות על בצלחות פטרי ושים לב הדילול. לחשב את המושבה יוצרי יחידות (CFU) עם הבאים נוסחה17:
איפה D היא הגורם דילול מאובייקט התרבות הראשונית. - לבצע מבחן-t אינטראקצית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התמיסה formazan סגול מופיע היכן ממוקם ה-DNA (נבדק על ידי ספקטרומטר מסה13). בניסוי, סולם הדנ א נטען לבצע עקומת כיול (איור 3). הפרוטוקול פועל עבור ג'לים אקרילאמיד והן agarose, אך יש עוצמה נמוכה יותר והוא לוקח זמן רב יותר agarose. עם זאת, השימוש agarose ג'ל מאפשר ההתאוששות של המדגם באמצעות ערכת זמינים מסחרית, זה לא מפריע החילוץ. הדגימות התאושש באמצעות שיטה זו עם נוריות כחולות יש איכות טובה יותר בהשוואה לס ג אני משתמש של transilluminator (...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הרומן ורגיש DNA מכתים שיטה מבוסס על הפחתת NBT השימוש של ס ג. הוצגתי במאמר זה. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא זמן הדגירה של הג'ל ב NBT-ס ג אני פתרון וריכוז NBT. הזמן מוכתמים agarose ג'ל הוא ארוך יותר עבור אקרילאמיד ג'לים בשל עובי גדול יותר agarose ג'ל. שיטה זו אינה פועלת היטב בנוכחות מרחביות כפי NBT ארגונייט שוקע במגע עם זה. אם הג'ל משיג רקע סגול, אנו ממליצים על כך עוד ג'ל להיות מוכן כדי לצמצם את זמן חשיפה קלה. אם ג'ל agarose היא מוכתמת, ואין רגישות מספיק, מומלץ להגדיל את הזמן לאור החשיפה. אם יש חוסר הרגישות התמיסה שאדרה ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי Fondo נאסיונאל דה Desarrollo y אזור Tecnológico (Fondecyt), צ'ילה, פרויקט 11130263 (ל CW), פרויקט CONICYT + NERC + פרוגרמה דה Colaboración אינטרנסיונל PCI-PII20150073 (ל CW) ו- U-inicia מדה Vicerrectoría Investigación אוניברסידאד דה צ'ילה (ל CW).
תודה על טטיאנה נאראנחו-פלמה על העזרה בשלב הראשוני של הפרויקט, ד ר חורחה Babul, דייגו קירוגה-רוג'ר לדיון מועיל, רוברט Lesch עבור תיקון של כתב היד, Dirección דה extensión דה לה Facultad דה y Químicas עצמה Farmacéuticas מ אוניברסידאד דה צ'ילה. תודות גם מרסלו Pérez עבור עריכת הוידאו וסטיבנס ניל שתיקנת את הטקסט ואת ארול ווטסון למתן הקריינות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מגיב ניטרו כחול טטרזוליום | זהב ביוטכנולוגיה | 298-83-9 | המשמש במגיב הצביעה |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | המשמש בערכת מיצוי |
| ג'ל | QIAGEN | 28704 | המשמש לחילוץ פלסמיד מהג'ל בסולם בדיקת תקינות |
| DNA Thermo-Fisher | SM 1331 | משמש לייצור עקומות כיול וכהתייחסות לרצועת חיתוך בבדיקת תקינות | |
| אגר אגר | מרק | שימש לייצור לוחות תרבית LB-אמפיצילין | |
| נתרן כלורי | Merck | משמש 1064045000 | לייצור לוחות תרבית LB-אמפיצילין |
| תמצית שמרים | Becton, Dickinson and Company | 212750 | המשמשת לייצור צלחות תרבית LB-ampicillin |
| פפטון | Merck | 72161000 | המשמש לייצור צלחות תרבית LB-אמפיצילין |
| TEMED | AMRESCO | 761 | משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד |
| אמוניום פרסולפט | Calbiochem | 2310 | משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד |
| אקרילאמיד | invitrogen | 15512-023 | משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד |
| ביסקרילאמיד | SIGMA | 146072 | משמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | משמש לייצור מאגר TAE וג'ל פוליאקרילאמיד שאינו דנטורינג מאגר tris-HCl מאגר EDTA |
| J.T. Baker | 8993-01 | משמש לייצור מאגר TAE | |
| חומצה אצטית | Merck | 1,000,632,500 | משמש לייצור מאגר TAE |
| agarose | Merck | 16802 | המשמש לייצור |
| ספקטרופוטומטר | Tecan | אינסופי 200 pro | המשמש לכימות פלסמיד DNA |
| יחידת טיהור מים | Merck | Elix 100 | משמשת לייצור מים מסוג 1 (ASTM) המשמשים בספקטרופוטומטריה ודילול DNA\ |
| מים מזוקקים | המשמשים בג'לים, מדיום תרבית, מכתים ופתרונות כלליים | ||
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | המשמש לייצור ג'ל פוליאקרילאמיד ללא דנטורציה tris-HCl מאגר 6X |
| צבע טעינת DNA | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 מ"מ LED כחול | Jinyuan אלקטרוניקה | SP-021 | מקור אור המשמש בבדיקת תקינות |
| protoboard | KANDH | KH102 | תמיכה ומעגל מקור אור |
| סוללת 9 וולט | Duracell | משמשת | להפעלת תא האלקטרופורזה האופקי של ה-LED |
| Biorad | 1704486EDU | משמש לייצור והפעלה של ג'ל אגרוז בערכת | |
| אלקטרופורזה אנכית | לבדיקת תקינות Biorad | 1658002EDU | המשמש להפעלת ג'לים פוליאקרילאמיד בעקומות כיול |
| ספק כוח | Biorad | 1645050 | משמש להפעלת האלקטרופורזה |
מקורות
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40(1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
