הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56535

⸱

31 באוקטובר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville

במאמר זה

סיכום

אנחנו להמחיש שיטה ישר קדימה כדי להפיק מאתר ראשי מקרופאגים מתאי מח עצם, שיטה פשוטה להכנת BSA-חומצות conjugates. ואז נדגים כי חומצות שומן רוויות יכול לגרום מוות תאי מקרופאג, כגון מוות של תאים קשורה באופן חיובי הסלולר הצטברות ceramide רמות.

תקציר

מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות, אשר עשויים לשחק תפקיד קריטי בוויסות פונקציות החיסונית שלהם. מחקרים רבים הראו כי חומצות שומן שונות, רווי או במאי רוויים, בעלי השפעות שונות על צמיחת תאים ותפקוד. עם זאת, הגישות המשמש להכנת חומצת שומן משתנים, אשר עלול להוביל לתוצאות שאינן-פיזיולוגיים. אלבומין, נשאית הטבעי של חומצות שומן בדם היקפי יונקים, מומלצת ויוצרים את המספר המשלים מורכבים עם מלח הנתרן של חומצות שומן כדי לחקור פונקציה חומצת שומן בתאי יונקים, ובכך לחסוך הרעילות של חומצת שומן סבון. לפיכך, פשוט, מהיר יחסית חימום, sonicating שיטה שפותחה, המובאת כאן על היווצרות תרכיב חומצה BSA-שומן. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות חומצות שומן רוויות, חומצות סטארית במיוחד כדי לגרום מוות תאי חמור ב העכבר מח נגזר מקרופאגים. נדגים בהמשך כי מות תאים הנוצרות על-ידי חומצות שומן רוויות קשורה באופן חיובי ceramide הסלולר שהצטברו רמות. בשיטה זו ניתן להרחיב ללימודי ההשפעה של חומצות השומן בתאי יונקים אחרים.

מבוא

חומצות שומן לשחק תפקיד חיוני לחילוף חומרים של אנרגיה, הסינתזה של קרום phospholipids סוגים שונים של תאים. חומצות שומן יש המסיסות מימית נמוכה. הכנה מתאימה של חומצות שומן יש חשיבות קריטית ללמוד על תפקודים ביולוגיים של חומצות שומן בתאי יונקים. כאשר חומצות שומן מוכנים עם אתנול, חומצות שומן רבים עשוי להראות השפעתם רעילים סבון (דטרגנטים) על קרום התא, אפילו בריכוזים נמוכים יחסית1. בתור נהג טבעי, רס ן עבור חומצות שומן בחינם בהסרום, אלבומין נחשב נשאית טוב של חומצת שומן משלוח במבחנה חומצת שומן פונקציה מבחני2,3,4. עם זאת, הפרטים של הכנת המספר המשלים חומצת שומן, אלבומין בדרך כלל אינם זמינים אף-על-פי פורסמו עבודות מחקר רבות באמצעות חומצות שומן.

מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון5,6,7,8. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות אשר ייתכן לווסת פונקציות החיסונית שלהם. לחקור את ההשפעה של חומצות שומן על מקרופאגים ותאים אחרים, שיטות שונות של הכנת חומצות שומן היו יישומית1,7,9. באמצעות חומצת שומן מוכן כראוי/סרום אלבומין conjugates לחקור את ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יש חשיבות קריטית בקבלת נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית. מחקרים על ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יכול לספק ידע בסיסי פוטנציאלים טיפולית הנוגעים מטבוליזם חומצות שומן מעורב מקרופאג מחלות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת לואיוויל.

1. עכבר מח עצם נגזר מקרופאגים (BMDMs)

  1. Euthanize עכבר 6 עד 8-בת, בריא פראי סוג באמצעות CO 2. להצמיד אותו למטה לוח קצף, תשפריץ עם אתנול 70% עד שהכל רטוב. הסר את עצמות השוקה/עצם הירך עם מלקחיים ומספריים. להכניס אותה צלחת פטרי עם 5 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). ביצוע כל ההליכים בתנאים סטריליים.
  2. לפתוח בשני הקצוות של עצם השוקה/הירך עם מספריים בשכונה תרביות רקמה סטרילי. לשטוף את העצם עם מחט 25 גרם עם PBS + 2% סרום שור עוברית (FBS) לתוך צינור 15 mL-
  3. Centrifuge התאים במח העצם ב 500 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.
  4. Resuspend בגדר תא במאגר פירוק תאי הדם האדומים 1 מ"ל ל lyse תאי דם אדומים (RBC) עבור פחות מ 1 מינימלית Dilute מיד עם PBS 1 x 9 מ. צנטריפוגה שוב כמו שלב 1.3. Decant supernatants.
  5. Resuspend בגדר תא ב- PBS 1 x 10 מ"ל, לסנן התליה תא דרך רשת ניילון סטרילי μm 40 לתוך צינור אחר 15 מ"ל להסיר תא פסולת/גושים. צנטריפוגה שוב כמו 1.3. Decant supernatants.
  6. Resuspend בגדר תא ב 15 מ"ל רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) 1640 עם 5% FBS ו 10 גנטמיצין μg/mL, צלחת שהתאים בקערה תרביות רקמה 100-מ מ- 37 חממה o C עבור 60 דקות מערבולת בעדינות את המנה להוציא הצפים תאים, ולספור אותם.
  7. צלחת 6 x 10 6 תאים בצלחת 100-מ מ עם 12 mL מקרופאג המבדילים מדיה (RPMI 1640 עם 5% FBS ו גנטמיצין μg/מ"ל, מעורבב עם 30% L929 media ממוזגים 10) עם 10 ננוגרם למ"ל העכבר רקומביננטי מקרופאג המושבה-מגרה פקטור (M-CSF) במשך יומיים.
  8. לאחר culturing 2 ימים בחממה 37 ° C עם 5% CO 2, להאכיל כל מנה עם 6 מ ל מקרופאג טריים המבדילים מדיה עם 10 ננוגרם למ"ל M-נוזל מוחי-שדרתי.
  9. ביום 5, לקחת 8 מ של אמצעי התקשורת הישנים החוצה מבלי להפריע את התאים ולהוסיף 10 מ"ל מקרופאג טריים המבדילים מדיה עם 10 ננוגרם למ"ל M-נוזל מוחי-שדרתי.
  10. ביום 7, לקצור את מח העצם, נגזר המקרופאגים (BMDMs) באמצעות של מרים תא.
    הערה: מקרופאגים המצורף יכול גם להיות חלופה מועדפת עם 5 מ ל 1 מ"מ EDTA ב- PBS 1 x 5-10 דקות לאחר הסרת התאים צפים ושטיפת צלחת פעמיים עם PBS 1 x מ. Centrifuge התאים כמו שלב 1.3. resuspend אותם ב מקרופאג טריים המבדילים מדיה, נספור hemocytometer.
    1. אשר BMDMs ' פנוטיפ מאת cytometry זרימה כמו שמתואר 5. להכין העכבר נגזר מקרופאגים בריכוז מסוים עבור המחקרים הבאים.

2. הכנה נזווג חומצת שומן BSA

  1. להכין 2 מ מ BSA ב- PBS סטרילי. לדוגמה, שוקל 6.65 g BSA, להוסיף 30 מ ל 1 x PBS להתמוסס, ואז להוסיף PBS יותר עד 50 מל ', קנה מידה של רכיבים כדי להפוך 2 מ מ BSA PBS 1 x.
  2. הכן 5 מ מ מלח נתרן בודדים של חומצות שומן ב- 2 מ מ BSA. מחממים עד 37 מעלות צלזיוס או יותר, אם יש צורך בכך, sonicate התערובת של 2 מ מ BSA ומלח נתרן של חומצות שומן עד מתקבל פתרון ברור.
    הערה: בהשוואה חומצות שומן בלתי רוויות, חומצות שומן רוויות צריך טמפרטורה גבוהה יותר וזמן sonication יותר בשביל המסת.
    3. מסנן
  3. מסנן הפתרון שומן-חומצה-BSA דרך 0.22 μm, aliquot אותו microcentrifuge סטרילי 1.5 mL צינורות, ואחסן אותם ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר או ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך. אין משקעים להתייחס לאחר אחסון ב 4 ° C במקרר.

3. רוויות חומצות שומן זירוז תא מותו של עכבר מח עצם נגזר מקרופאגים

  1. צלחת את BMDMs בצלחת תרביות רקמה 24-ובכן עם 0.4 x 10 /mL 6 ב מקרופאג המבדילים מדיה.
  2. פנקו את התאים עם חומצה פלמיטית 0.4 מ מ, חומצה סטארית עבור 16 עד 24 h בחממה 37 ° C עם 5% CO 2. השתמש BSA של הפקד שלילי.
  3. לקצור את התאים עם מרים תא לאחר הטיפול, ספין למטה התאים ב 500 g x, 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.
  4. מכתים את התאים עם Annexin V-Alexa 488 ו- 7-aminoactinomycin D (7-מ) 100 μL annexin V מאגר איגוד למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לדלל את הדגימה עם 200 µL מאגר מחייב annexin, מערבבים בעדינות, ואז שומרים את הדגימות על הקרח לאחר תקופת הדגירה.
  6. לנתח את התאים מוכתם בהקדם האפשרי על ידי cytometry זרימה 5. Annexin V-Alexa 488 מזוהה בערוץ FITC, 7-מ ומתגלה בערוץ PerCP/PerCP-Cy5.5.

4. צביעת Ceramide תאיים

  1. לאחר טיפול חומצת שומן, לקצור את התאים כמו שלב 3.3. אז תתקן את התאים ב- 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות
  2. לרחוץ את הדגימה עם PBS 1 x 1 מ"ל, ספין למטה כמו 3.3, ולקבל את תגובת שיקוע decant.
  3. כתם התאים עם נוגדן anti-ceramide הראשי (דילול 1:200) במאגר 100 μL 1 x permeabilization במשך 30 דקות
  4. שטיפת ו ספין למטה את התאים שוב כמו שלב 4.2.
  5. כתם התאים עם אנטי-העכבר IgM משני נוגדנים (דילול שבערך) במאגר 100 μL 1 x permeabilization במשך 30 דקות
  6. שטיפת ו ספין למטה שוב כמו שלב 4.2 התאים. להוסיף 250 μL 1 x PBS ולנתח את התאים מוכתם על ידי cytometry זרימה 5.
    הערה: ראה את הרשימה ריאגנט מפורט בטבלה של ציוד, ריאגנטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השמנת יתר מגדילה את ריכוז חומצות השומן החופשיות בנסיוב. כמו המקצועי phagocytes, מקרופאגים פעיל לקחת את חומצות השומן כדי לשמור על הומאוסטזיס המארח. במהלך תהליכים אלה, ליפידים עומס יתר עלול לגרום מוות תאי מקרופאג. לשם כך, אנו תרבותי BMDMs במבחנה עם רמות מהשמנת יתר של חומצות שומן תזונתיים מוות תאי מקרופאג נמדד באמצעות זרימת cytometric מכתים. בהשוואה הפקד BSA, חומצות שומן רוויות, בפרט חומצות סטארית, המושרה בתא משמעותיים מות BMDMs. תאים מתים הוצגו כמו אוכלוסיות חיובית כפולה מוכתמת Ann...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכנה נכונה של חומצת שומן פתרון יש חשיבות קריטית כדי ללמוד את התפקוד הביולוגי של חומצות שומן. הניטרול של חומצת שומן מעלה מסיסות שלה ב תמיסה מימית. עם זאת, מלחי נתרן של חומצות שומן, בעיקר חומצות שומן רוויות, הן עדיין של מסיסות נמוכה במים או PBS הבחנו. שיטה אחת היא להשתמש אתנול 95-100% כדי לסייע לפזר את חומצת שומן1. באמצעות שיטה זו, רעילות גבוה יותר לתאים ייבחנו אפילו בריכוזים נמוכים עבור חומצות שומן בלתי רוויות פחות רעיל. דרך נוספת להכין פתרון חומצת שומן היא לנצל מתיל-β-cyclodextrin כמערכת משלוח כך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים כספיים.

תודות

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי ראשונית אוניברסיטת לואיוויל ומענקים המכון הלאומי לסרטן (בת'סדה, מרילנד) R01CA177679, R01CA180986.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמבט אולטרסאונד CPX Bransonicדגם 2800
נתרן פלמיטט (PA)Nu-Chek Prep, Inc.S-1109M.W. 278
נתרן סטארט (SA)Nu-Chek Prep, Inc.S-1111M.W. 306
אלבומין בסרום בקר (BSA), ללא חומצות שומןFisher Scientific9048-46-8
גורם מגרה מושבת מקרופאגים של עכבר (mM-CSF) טכנולוגיית איתות סלולרי,   בע"מ5228
RPMI 1640VWR International71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 מצומדFisher ScientificA13201
7-AADBD Biosciences559925
נוגדן חד-שבטי נגד סרמיד (IgM של עכבר)SigmaC8104-50TSTשיבוט: MID 15B4
נוגדן IgM נגד עכבר, ומיקרו; שרשרת, FITC מאגרמצומד SigmaAP128F
Biolegend420801
מאגר פרמביליזציהEbioscience4307693
מאגר ליזה של תאי דם אדומים Sigma11814389001
Annexin V Binding BufferBD Biosciences556454
תאי L929ATCCCCL-1
Corning  מרים תאים פישר סיינטיפיק07-200-364
הערה: M.W. מיועד למשקל מולקולרי.
קיבוע

מקורות

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

BSAAnnexin V
חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.