מאמר שיטה

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

8.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56537

⸱

19 בפברואר 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

במאמר זה

סיכום

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

תקציר

הקלטה Amperometry של תאים נתון שוק אוסמוטי מראים כי תאים הפרשה להגיב על הלחץ הפיזי הזה על-ידי הפחתת הפעילות אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שוחרר מן שלפוחית באירועים אקסוציטוזה יחיד. הוצע כי הירידה נוירוטרנסמיטורים גורשו היא עקב שינויים במאפייני biophysical ממברנה כאשר תאים להתכווץ בתגובה ללחץ osmotic עם ההנחות זה שלפוחית הפרשה בציטופלסמה תא אינן מושפעות על ידי מתח osmotic חוץ-תאית. Amperometry הקלטה של אקסוציטוזה מפקחת מה הוא שוחרר מן התאים הרגע שלפוחית ולספות עם קרום פלזמה, אך אינו מספק מידע על תוכן שלפוחית לפני המיזוג שלפוחית מופעלת. לכן, על ידי שילוב של amperometry הקלטה עם שיטות אנליטיות משלימים אחרים המסוגלים אפיון השלפוחיות המוגלתיות הפרשה לפני אקסוציטוזה-תאים המופעלת מציע סקירה רחבה יותר לבחינת שלפוחית איך הפרשה ו בתהליך אקסוציטוזה מושפעים שוק אוסמוטי. כאן נתאר כיצד משלימים amperometry הקלטה עם cytometry אלקטרוכימי תאיים והדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) שידור ניתן להשתמש כדי לאפיין שינויים בגודל שלפוחית הפרשה ותוכן עצבי- תאים chromaffin ביחס אקסוציטוזה פעילות לפני ואחרי חשיפה osmotic מתח. על-ידי קישור כמותיים המידע שנצבר ניסויים באמצעות כל שלוש שיטות אנליטיות, מסקנות בעבר נעשו כי הפרשה שלפוחית להגיב ללחץ osmotic חוץ-תאית על ידי כיווץ גודל הקטנת גודל quantal שלפוחית כדי לשמור על ריכוז עצבי קבוע שלפוחית. ומכאן, זה נותן קצת הבהרה בנוגע למה שלפוחית, בתגובה osmotic מתח, להפחית את כמות נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך שחרור אקסוציטוזה. ההקלטות amperometric כאן מציינים שזה הוא תהליך הפיך, את שלפוחית לאחר הלם אוסמוטי והינם מחודשים עם נוירוטרנסמיטורים כאשר תאים שמוקם הם להחזירה לתוך סביבה מול.

מבוא

Chromaffin תאים בבלוטות יותרת הכליה הם תאים נוירואנדוקריניים שחרור נוירוטרנסמיטר מולקולות לתוך זרם הדם. מצב זה מתרחש דרך הסלולר התהליך הכרוך עגינה של פיוז'ן של שלפוחית מלאה נוירוטרנסמיטר, וכתוצאה מכך שחרור תוכן שלפוחית למרחב חוץ-תאית בתהליך הנקרא אקסוציטוזה. נוירוטרנסמיטרים תאים chromaffin (אדרנלין, ונוראדרנלין) מועבר על ידי קרום חלבונים לתוך שלפוחית גדול ליבה צפופה (LDCVs) ומאוחסנים באופן פעיל-ריכוזים גבוהים (~0.5-1 מ')1,2. הצטברות של נוירוטרנסמיטורים פנימה LDCVs מושגת על ידי בזיקה של מולקולות קטכולאמין למטריקס חלבון intravesicular ליבה צפופה המורכבת chromogranin חלבונים (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6ופתרון קוקטייל intravesicular המכיל רכיבי מפתח קטכולאמין העמסה ואחסון לתוך שלפוחית כגון ATP (125-300 מ מ)7, Ca2 + (50-100 מיקרומטר פתרון ו ~ 40 מ מ חייב מטריקס חלבון)8,9מ ג2 + (5 מ מ), ascorbate (10-30 מ מ)10ו- pH של ~5.511,12. LDCVs לשמור על תנאי iso-osmotic עם תא הציטופלסמה (310 mOsm/kg)13, למרות הריכוז ממס תיאורטי בתוך השלפוחיות המוגלתיות לסכם עד יותר מ 750 מ"מ. ההרכב של הרכיבים intravesicular חיוני לא רק עבור העמסה ואחסון של catecholamines, אלא גם לצורך צבירת של מומסים בגבול למטריקס חלבון הליבה צפופה. זה מפחית באופן משמעותי את osmolarity של השלפוחיות המוגלתיות פוחת באופן משמעותי והוא יכול להשפיע על קטכולאמין סכום זה הוא שוחרר במהלך אקסוציטוזה5,6.

מחקרים על ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על התהליך אקסוציטוזה הקלטה amperometric דיווחו על הזאת לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית מעכב פעילות אקסוציטוזה ומפחיתה את מספר הנוירוטרנסמיטרים המופרשים יחיד שלפוחית תאים4,14,15,16,17,18,19. ההסברים מתצפיות אלה העריכו על שיפור אפשרי של הצפיפות macromolecular את האירועים של התא הציטופלסמה פיוז'ן שלפוחית מעכבות, שינוי במאפייני biophysical ממברנה להשפיע על מספר נוירוטרנסמיטורים שפורסמו במהלך אקסוציטוזה. מחשבות אלו הניחו כי מתח נפשי גבוה osmotic חוץ-תאית אינה משפיעה על גודל quantal שלפוחית, אשר מגדירה את מספר מולקולות עצבי המאוחסן בתא שלפוחית בשלב קודם של אקסוציטוזה מופעלות14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. במדידות amperometric של שחרור אקסוציטוזה תאים בודדים, microelectrode דיסק סיבי פחמן מושם בקשר הדוק עם פני השטח של התא, יצירת ערכה ניסוי למעלה מחקה את תצורת סינפסה, איפה amperometric אלקטרודה משמש22,גלאי postsynaptic (איור 1)23. על ידי גירוי תא אקסוציטוזה, אחד יכול לגרום שלפוחית מלאה עצבי נתיך עם קרום פלזמה התא ולשחרר חלק או את התוכן שלפוחית מלאה לחלל חוץ-תאית. מולקולות אלה הנוירוטרנסמיטר משוחרר על פני השטח של האלקטרודה ניתן להבחין electrochemically אם נוירוטרנסמיטורים הם electroactive (למשל, catecholamines) על-ידי החלת פוטנציאלי חמצון-חיזור של +700 mV vs אלקטרודה הפניה של Ag/AgCl . כתוצאה מכך, סדרה של קוצים הנוכחי לסמן את הגילוי של אירועים בודדים אקסוציטוזה. הנוכחי לעומת עקיבה זמן הקלטת amperometric, האזור שמתחת לכל ספייק amperometric יחיד מייצג את המטען זוהה לכל אירוע אקסוציטוזה, ניתן להמיר את החפרפרת של נוירוטרנסמיטרים שוחרר, באמצעות המשוואה פאראדיי. לפיכך, ההקלטות amperometric לספק מידע כמותי על כמות נוירוטרנסמיטורים שגורשו אירועים אקסוציטוזה יחיד, הדו ח על התדר של אירועים אקסוציטוזה, אבל לא מציגות מידע כמותי על השלפוחיות המוגלתיות הפרשה תוכן לפני שחרור נוירוטרנסמיטר וה פיוז'ן שלפוחית החל.

לכן, כדי לקבל הבנה טובה יותר של שלפוחית איך הפרשה בתא הציטופלסמה להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic לפני התא מופעלת בתהליך אקסוציטוזה, שיטות אנליטיות משלימים אחרים יכול לשמש כדי להעשיר את המידע הזה. למשל, כדי לחקור אם הלחץ osmotic הפיצולים נפח שלפוחית, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הדמיה ניתוח יכול לשמש כדי למדוד את גודל שלפוחית של תאים לאחר קיבוע כימי. כדי לבחון אם osmotic לחץ משפיע על גודל quantal שלפוחית, amperometric פיתחה לאחרונה בטכניקה הקרויה תאיים cytometry אלקטרוכימי, יכול להיות מיושם על כימות של שלפוחית תוכן עצבי ב שלפוחית הפרשה ב שלהם מצב מקורי כאשר בעובדי בציטופלסמה של תאים חיים26. בשיטה תאיים cytometry אלקטרוכימי, אלקטרודה סיב פחמן גלילי nanotip בעדינות מוכנס לתוך הציטופלסמה של תאים חיים, על-ידי החלת +700 mV פוטנציאל אלקטרודה זו (לעומת Ag/AgCl להפנות אלקטרודה), קטכולאמין תכולת שלפוחית ניתן לכמת על ידי הגילוי של יתד הנוכחי חמצון-חיזור של שלפוחית אחת מתנגשים, adsorbing, ולא לאחר מכן stochastically קריעה על פני האלקטרודה, ובכך לשחרר את תוכנם נגד אלקטרודה משטח26. לפיכך, amperometric הנוכחי לעומת זמן מעקב, כל אירוע rupturing שלפוחית יחיד יכול לגרום ארעי הנוכחי ו, בהכניסו את האזור של ספייק הנוכחי כל, הגודל quantal שלפוחית ניתן לחשב באמצעות חוק Faraday´s.

לכן, על-ידי קישור המידע הכמותי שנרכשו מ מדידות גודל שלפוחית באמצעות הדמיה TEM יחד עם שלפוחית בגודל quantal ניתוח, כפי שנרשם על ידי תאיים cytometry אלקטרוכימי, שלפוחית עצבי הריכוז יכול גם להיות נחושים. זה מאפשר שלפוחית אפיון כאשר התאים חשופים למצבים שונים osmotic ומספק תצוגה טובה יותר על איך שלפוחית עשויים להגיב חוץ-תאי הלחץ osmotic בשלב לפני אקסוציטוזה. התוצאות של שילוב שיטות אלה הראו כי בנוכחות לחץ אוסמוטי גבוה חוץ-תאית, שלפוחית להתכווץ ולהתאים את גודלם quantal השוואת מידע כמותי על השינויים היחסיים של מדידות אלה מראה כי תוך כדי כיווץ, שלפוחית להתאים את התוכן ואת גודל כדי לשמור על ריכוז של עצבי קבוע24. לכן, הבנה זו הוא ערך שם מתחבר תצפיותיו על שחרור נוירוטרנסמיטר בתאים שנחשפו ללחץ osmotic. בפרוטוקולים אלה, אנו מתארים את השימוש האלה מתודולוגיות משלימות שלושה המאפשרים אפיון שלפוחית איך הפרשה ב שלהם לסביבתם הטבעית להגיב osmolality חוץ-תאית, את ההשפעות של תגובה זו על אקסוציטוזה תהליך. בנוסף התצפיות הקודמות לגבי ההשפעה של לחץ אוסמוטי גבוה על אקסוציטוזה24, אנו מציגים ניסויים נוספים המתארים תא התאוששות לאחר הלם אוסמוטי ואת השפעת stimulations בריום מרובים ב- chromaffin תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תא התרבות של תאים Chromaffin שור, מבודדים על ידי עיכול אנזימטי של יותרת הכליה

  1. בידוד תאי chromaffin אסף שור יותרת הכליה, לעקר תאים עם 70% אתנול פתרון. לקצץ משם שומן, רקמת חיבור באמצעות אזמל. כדי להסיר דם, יש לשטוף את הוורידים יותרת הכליה באמצעות הפתרון של לוק (NaCl 154 מ מ, אשלגן כלורי 5.6 מ מ, NaHCO3 3.6 מ מ, חומצה piperazineethanesulfonic hydroxyethyl (HEPES) 5.6 מ מ ב- pH 7.4) כי כבר thermostated ל- 37 מעלות צלזיוס.
  2. לעכל את הרקמה, לנפח כל בלוטה על ידי הזרקת כ 2.5 מ של חם סטרילי-מסוננים 0.2% collagenase P פתרון דרך הווריד של יותרת הכליה באמצעות מזרק, דגירה הרקמה במשך 20 דקות ב 37 º C. לבחון את בלוטות כדי להבטיח את שהשלמת תהליך העיכול של לשד. הרקמה צריך להרגיש לא מתוח ורכים.
  3. לאסוף לשד מתעכל על ידי החיתוך את הבלוטות בכיוון האורך. מינצ רקמת לשד באמצעות אזמל. לסנן את המתלים רקמות מעל מסננת פלדה ו לדלל עם הפתרון של לוק כ אמצעי כדי להפחית את הפעילות של collagenase עמ' 50 מ
  4. גלולה התאים ב g x 300 ומפרידה 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאסוף לתוך מבחנות סטרילי 50 מ. מחדש להשעות בגדר שהושג בפתרון של 20 מ"ל לוק ולסנן את הפתרון מעל רשת ניילון 100 סטרילי-מיקרומטר לתוך צינורות.
  5. לערבב התליה תא chromaffin עם Percoll סטרילי (1:1), centrifuge את הפתרון תא ב g x 18,600 במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את השכבה העליונה של המילוי ההדרגתי צפיפות ולסנן את הפתרון מעל רשת ניילון 100-מיקרומטר לתוך צינורות.
  6. כדי לא לכלול Percoll, לדלל את המתלים תא עם פתרון של לוק צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני מחדש השעיית בגדר בפתרון של לוק. הצפיפות תא המשוערת של התליה תא מבודד הוא כ-4 מיליון תאים/mL.
  7. עבור הקלטת amperometric של אקסוציטוזה ומדידות cytometry תאיים, בתאי הקולגן הרביעי chromaffin צלחת מצופה 60 מ מ פלסטיק ממנות צפיפות של 17.5 × 103 תאים/cm2 , דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 סביבה. לבצע את הניסויים אלקטרוכימי בתוך 1-3 ימים של תרבית תאים.
  8. עבור TEM הדמיה ניסויים, תאים chromaffin צלחת 75 ס מ2 תא תרבות מבחנות-צפיפות של 7-8 מיליון תאים לכל את הבקבוק, דגירה ב 37 ° C בסביבת2 CO 5% עבור יום אחד.

2. ותא אקסוציטוזה Amperometry ניסויים24

  1. כדי לבדות סיב פחמן microelectrodes לניסויים אלה, שותה כוס נימי בקוטר חיצוני מתאים המחזיק אלקטרודה בשלב הראשי שישמש בניסויים אלה. שימוש של נימי זכוכית בורוסיליקט עם הקוטר החיצוני של 1.2 מ מ של הקוטר הפנימי של 0.69 מ מ.
    1. להתחבר לאחד הקצוות נימי צינור מים השאיפה. במקום 5 מיקרומטר קוטר פחמן סיבים על משהו, כמו פיסת נייר לבן, כדי לשפר את ההדמיה.
    2. זיהוי של סיבי פחמן יחיד והחזק הסיבים אותו בקצה אחד עם אצבע כדי לשמור את סיבי פחמן במקום תוך מיצוב את הקצה הפתוח של נים בסמיכות לסוף חינם של סיבי פחמן. תשאף בעדינות את סיבי פחמן לתוך כוס נימי, כך סיבי פחמן מוציא החוצה דרך צידי נימי. . קדימה, תתרחק הכוח השאיפה
  2. למקם את נימי עם סיבי פחמן פולר micropipette ומשוך את הזכוכית נימי לתוך שתי עצות פיפטה מזכוכית נפרדים. כדי לנתק את סיבי פחמן המחובר בין קצות שתי זכוכית, השתמש זוג מספריים לחתוך את סיבי פחמן ולהשיג שני microelectrodes סיב פחמן.
  3. תחת מיקרוסקופ, מקם את סיבי פחמן על גבי שקופית מיקרוסקופ עבה המאפשרת חיתוך ידני של סיבי פחמן בקצה איפה הסיבים המשתרעת הציפוי נימי זכוכית באמצעות אזמל.
  4. לאחר קיצוץ סיבים פחמן, אשאיר טיפ סיב פחמן מצופה זכוכית, מכניס כמה מ מ של קצה האלקטרודה פתרון אפוקסי עבור 10 דקות תעלה אפוקסי, לאטום את כל שטח פתוח אפשרי בין סיבי פחמן של הזכוכית שמסביב. הרם את האלקטרודות לאט מחוץ הפתרון אפוקסי כדי למנוע מגושם דבק טיפות ויוצרים בקצה האלקטרודה.
  5. מקם את האלקטרודות על בעל (למשל, מקל עץ שטוח) עם קלטת עמידי חום דביק בצד שני, אשר יכול להיות מצורף אלקטרודות. אופים האלקטרודות אפוקסי שטופלו במשך הלילה בתנור ב- 100 מעלות צלזיוס. האלקטרודה טיפים לשבור בקלות אם הם באים במגע עם משטח, אז להבטיח האלקטרודות תמיד בבטחה נשמרים באמצעות בעל שם האלקטרודות קבועים במקום ולהסתכן הטיפים לא שנוגעים.
  6. כדי לקבל משטח אלקטרודה דיסק שטוח, למקם את האלקטרודה האוחז microgrinder, מסגרת משופעת כל אלקטרודה סיב פחמן-מלאך של 45°. לאחר שיפוע, לסמן את נימי על שלה למעלה באמצעות סמן קבוע לדעת כיצד לאתר את פני השטח של הדיסק אלקטרודה בזווית של 45°, כאשר הצבת האלקטרודה ליד תאים עבור המידה אקסוציטוזה מאוחר יותר.
    הערה: השלב זה חשוב כמו ניסויים אלה, האלקטרודה סגלגל הדיסק צריך להיות ממוקם שטוח על גבי תאים עם שלה מקביל פני השטח של הפטרי. כמו כן, מסגרת משופעת אלקטרודות נעשים באותו יום כמו ניסויים כדי להבטיח משטח אלקטרודה טריים ונקיים.
  7. לפני השימוש, מקום microelectrode סיב פחמן בכל פתרון מבחן (לדוגמה, 0.1 מ מ דופמין במאגר PBS (pH 7.4)) כדי לנטר את מצב יציב הנוכחי באמצעות וולטמטריה ציקלית. עבור סריקה וולטמטריה ציקלית, להחיל waveform פוטנציאלי של משולש מן-0.2 V כדי +0.8 V vs אלקטרודה הפניה Ag/AgCl ב mV 100/s כדי להבטיח תגובה טובה קינטיקה הנתונים מתקבלים זה נוטים להסכים ערכים מחושבים באופן תיאורטי עבור דיסק בקוטר 5 מיקרומטר סיב פחמן microelectrode25.
  8. עבור הקלטת amperometry של אקסוציטוזה, מניחים על צלחת פטרי עם תאים בתרבית chromaffin על גבי מיקרוסקופ הפוכה. חשוב לחסום. את המיקרוסקופ להגדיר עם כלוב פאראדיי לחסל את רעש חשמלי במהלך amperometry הקלטת, בשל הזרמים קטן מאוד הנמדדים. השתמש במיקרוסקופ חימום הבמה כדי לשמור על חום של 37 ° C במהלך הניסויים תא.
  9. להשתמש מכשיר מלחציים תיקון רעש נמוך כדי להחיל פוטנציאל קבוע של +700 mV ב האלקטרודה עבודה לעומת אלקטרודה הפניה Ag/AgCl אשר ממוקם גם הפטרי הרחק האלקטרודה עבודה. עבור אקסוציטוזה הקלטה של תאים chromaffin, digitalize את האות-10 קילו-הרץ ולהחיל של פנימי יעברו סינון בסל-2 קילו-הרץ כדי לסנן את האות המוקלט.
  10. כדי לבצע amperometric הקלטה ב תאים בודדים, הר microelectrode דיסק את סיב פחמן טרי משופע ונבדק ב מחזיק האלקטרודה השלב הראשי המשמש עם potentiostat.
    1. בעדינות למקם האלקטרודה עם הדיסק אובל שטוח צורה אלקטרודה השטח פונה כלפי מטה לכיוון פני השטח הפסגה של התא ולמקם האלקטרודה בקשר עם קרום התא באמצעות של micromanipulator.
    2. להתאים את המרחק בין האלקטרודה לתא על ידי ניטור להרכב תא הנגרמת על ידי האלקטרודה על מיקום על גבי קרום התא ומשכו ואז בזהירות האלקטרודה למרחק שבו התא חוזר צורה קרוב לצורתו המקורית תא . האידיאלית עבור הקלטה קינטי, תפוקה הוא ליצור סרט נוזלי דק של 100 ננומטר כדי להפריד בין פני השטח אלקטרודה ותא, אשר הם תנאים דומים עבור זיהוי postsynaptic במהדורה סינפסה כימית.
  11. כדי לגרות את התאים כדי אקסוציטוזה, הצב של micropipette זכוכית עם טיפ בגודל של 2-3 מיקרומטר קוטר, מלא עם 5 מ מ BaCl2 פתרון ממרחק של פחות 20 מיקרומטר מן התא, כדי למנוע כל פתרון דולף מהקצה פיפטה להשפיע ניסוי ולהחיל דופק הזרקת s 5 של 5 מ מ BaCl פתרון2 על פני התא כדי לגרות את התא כדי אקסוציטוזה.
  12. כדי לבחון את השפעות לחץ אוסמוטי. הפיך בתהליך אקסוציטוזה, להכין פתרון מול מאגר (150 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1.2 מ מ MgCl2, גלוקוז 5 מ מ, 10 מ מ HEPES, pH 7.4) עם הלחץ iso-osmotic mOsm/kg 310, מאגר hypertonic שנעשו על ידי התאמת NaCl ריכוז של הפתרון מול מאגר עם osmolality המתאים 730 mOsm/kg.
  13. המקום התאים במאגר מול ולעורר את התא כדי אקסוציטוזה על-ידי החלת דופק הזרקת בריום בעת הקלטת שנחשולי הנוכחי של amperometric במהלך הפעילות אקסוציטוזה יזם למשך כ 3 דקות.
    1. כדי להשוות את התגובות אקסוציטוזה בתנאים מול תנאי hypertonic, דגירה התאים 10 דקות ב בופר hypertonic ולהחיל לאחר מכן דופק הזרקת בריום לעורר אקסוציטוזה ולבצע 3 דקות של הקלטה amperometric.
    2. על התגובה הפיך של תאים, דגירה תאים שוב למשך 10 דקות ב בופר מול ולעורר תאים על-ידי החלת 5s בריום הזרקת דופק ולבצע 3 דקות של הקלטה התגובה אקסוציטוזה מהתא.
  14. כמו בקרת ניסויים כדי לקבוע את ההשפעה על פעילות אקסוציטוזה מאת stimulations בריום מרובים, לבצע הקלטת amperometric של שחרור אקסוציטוזה מ-3 רצופות BaCl stimulations2 על אותו תא מאגר מול ממוקם ב ו שימוש באותו פרוטוקול זמן עבור הניסויים הדגירה תא רצופים עם osmolarity שונים.

3. תאיים Cytometry אלקטרוכימי24,26

  1. כדי לבדות אלקטרודות למדידות גודל quantal שלפוחית, להשתמש בחומרי אותו ולהתחיל את הכנת של מיקרומטר 5 בקוטר אלקטרודה סיב פחמן על פי התיאורים בסעיפים 2.1 ו- 2.2 של ייצור microelectrode עבור amperometric אקסוציטוזה מדידות.
  2. תחת מיקרוסקופ, השימוש באזמל לחתוך את סיבי פחמן הארכת מחוץ קצה זכוכית כך סיבי פחמן באורך הנע בין 30 מיקרומטר 100 שנשאר בולטות מהקצה זכוכית.
  3. כדי להכין טיפ חרוט להבה של האלקטרודה סיבי פחמן, השתמש להבה בוטאן. כדי להשיג חרוט באופן שווה, עצה אלקטרודה בצורת גליל, החזק האלקטרודה סיב פחמן בצורת גלילי בעת סיבובם ולמקם את סיבי פחמן המשתרעת הזכוכית אל קצה הלהבה בוטאן כחול עד הקצה של הפחמן מפתחת אדום צבע. זה בדרך כלל לוקח פחות מ 2 s. אם מצליחים, התוצאה גודל קצה האלקטרודה חרוט של 50-100 ננומטר בקוטר (תמונת SEM של טיפ כזה מוצג באיור 5B). לאחר להבה תצריב, במקום האלקטרודה תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את קצה האלקטרודה.
  4. הכנס את microelectrode nanotip גלילי אפוקסי פתרון עבור 3 דקות ולאחריו 15 s חיטט של קצה האלקטרודה פתרון אצטון. דבר זה מאפשר אפוקסי לאטום את החלל הפער הפוטנציאלי בין סיבי פחמן של הקיר בידוד נימי זכוכית, בעוד אצטון מנקה את אפוקסי מעל פני השטח אלקטרודה חרוט סיבי פחמן. . כדי לרפא את האפוקסי, אופים האלקטרודות בתנור למשך הלילה ב- 100 מעלות צלזיוס.
  5. לפני השימוש, מבחן הזרם מצב יציב של כל microelectrode סיב פחמן, כפי שהוסבר בסעיף 2.7 באמצעות וולטמטריה ציקלית. לניסויים, להשתמש רק אלקטרודות המציגים מישור הנוכחי סביב 1.5-2.5 נה27.
  6. עבור מדידות amperometry המערכת, למקם את התאים במיקרוסקופ כמתואר ב- 2.8, להשתמש באותן הגדרות ניסיוני של potentiostat כמתואר ב- 2.9.
  7. לבצע מדידה תאיים amperometric, וכן כדי למנוע נזק פיזי משמעותי לתא, להוסיף את microelectrode גלילי nanotip לתוך התא על-ידי הוספת מכנית עדינה לכפות, רק מספיק כדי לדחוף את האלקטרודה דרך תאים פלזמה ממברנה לתוך הציטופלסמה התא באמצעות של micromanipulator.
  8. לאחר ההוספה, ועם קרום התא אטום ליד האלקטרודה גלילי, להתחיל בהקלטה amperometric באתרו מהתא בשידור חי. החמצון פוטנציאל זה מוחל על האלקטרודה, שלפוחית לספוח השטח אלקטרודה, קרע stochastically.  לפיכך, יש צורך כל סוג של גירוי ליזום את התהליך הזה.
  9. כדי לקבוע את ההשפעה osmotic על גודל quantal שלפוחית, לאסוף את המידות cytometry תאיים מתוך קבוצה של תאים יש כבר מתפשט מול, במאגר hypertonic באמצעות התנאי ניסיוני כמתואר בסעיף 2.13.

4. נתוני ניתוח של הקלטות Amperometry

  1. כדי לנתח את הנתונים amperometry המוקלט אקסוציטוזה וניתוח גודל quantal שלפוחית תאיים, להשתמש תוכנית תוכנה המאפשרת ניתוח של תופעות מעבר הנוכחי הנוכחית מוקלטות לעומת עקבות הזמן אז זה קינטי שיא פרמטרים ו משולב הכולל תשלום עבור הפרט פסגות הנוכחי יכול להיקבע. עבור ניתוח נתונים, השתמשנו תוכנה שפותחה במעבדה זולצר שנכתב עבור התוכנית ניתוח נתונים איגור28.
  2. כאשר מנתחים את amperometric קוצים, בחר גבול הסף עבור פסגות של שלוש פעמים שורש-ממוצע מרובע (RMS) סטיית התקן של הרעש עבור כל הקלטה.
  3. לאסוף את הקוצים amperometric כל הקלטה תא ידנית כדי למנוע קוצים שווא לא פעל בצורה גאוסיאנית, כפול קוצים אשר יכול להיות התוצאה של אירועים אקסוציטוזה הממוזג, מקבלים רק לפי עקומת גאוס בצורת קוצים עם סף של שלוש פעמים גבוה יותר מאשר הרעש RMS.
  4. לאסוף הנתונים עבור תשלום סך amperometric יחיד שיא ולהשתמש חוק פאראדיי (N = QnF) כדי לחשב את כמות הנוירוטרנסמיטר קטכולאמין זוהה לכל אקסוציטוזה או שלפוחית אחת תאיים קרע אירוע, כאשר N הוא מספר השומות של שן טוחנת נוירוטרנסמיטורים עובר תגובת חמצון-חיזור על פני האלקטרודה, Q = והעלות הכוללת זוהה תחת כל ספייק, n = מספר האלקטרונים הועברו, בעקבות תגובות חמצון-חיזור (n = 2 עבור catecholamines), ולא את Faraday´s קבוע F = 96485 C/מול.
  5. לבצע ניתוח סטטיסטי של הנתונים שנאספו על-ידי הראשונה חישוב החיוב הממוצע זוהה לכל אירוע עבור כל תא. לאחר מכן על השונות בין תאים, לחשב את המטען הממוצע בין תאים, להשתמש במבחן t של סטודנט בין תאים בהנחה סטיה לא שיוויוני. מחקר זה משמש את תוכנית MATLAB לשם ניתוח סטטיסטי.

5. TEM דימות לצורך ניתוח גודל שלפוחית

  1. כדי לבצע הדמיה TEM של תאים על התנאים osmotic שונים, תחילה דגירה התאים במאגר מול או hypertonic 10 דקות ב 37 ° C בסביבת2 CO 5% לפני קיבוע כימי של תאים.
  2. לבצע קיבוע תאים באמצעות שיטת מקבע את Karnovsky29. באמצעות שיטה זו, דגירה התאים עם פתרון המכיל אזיד הנתרן 0.01%, 1% פורמלדהיד ו- 1.25% גלוטראלדהיד שבו ניתן לאחסן את הדגימה ב 4 º C.
  3. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים באמצעות מאגר cacodylate נתרן 0.15 מ'.
  4. כתם התא דגימות פוסט קיבעון, כהכנה TEM הדמיה, דגירה התאים עם פתרון 1% אוסמיום ארבע-חמצני 2 h-4 ° C, ואחריו הדגירה 1 h ב- 0.5% uranyl אצטט פתרון בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. בשלב הסופי קיבעון, מייבשים את התאים קודם על ידי שטיפה התאים ב- 100% אתנול, ואז לשטוף תאים עם אצטון.
  6. להטביע את הדגימות תא epoxyresin לאחר מכן לבצע צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 30-40 דקות ומאפשרים את הדגימה תא כדי פולימריזציה ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 h ואחריו 48 שעות הדגירה ב 60 מעלות צלזיוס.
  7. כהכנה הדמיה, סעיף המדגם תא נעוץ אגר 100 שרף לפרוסות בעובי של 60 ננומטר באמצעות של ultramicrotome.
  8. נושא את התאים uranyl 4% acetate/25% אתנול פתרון עבור 4 דקות ולאחריו 20 s של שטיפה עם מים. לשטוף את התאים עם ריינולדס עופרת ציטראט למשך 3 דקות, ואחריו 20 s של שטיפה עם מים.
  9. לבצע הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים של דגימות תאים. בניסויים שלנו, השתמשנו מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יש כבר פעלה ב 120 kV.
  10. מ לכל תמונה מוקלטות של מקטע תא הממחישות את ultrastructure תא המציג אוכלוסיה של השלפוחיות המוגלתיות בציטופלסמה של התא, קודם כיילו את גודל הפיקסל של התמונה על-ידי הנוגעים פיקסלים הבר סולם מוקלטות כל תמונת TEM. השתמש בתוכנת הדמיה כדי לקבוע את גודל שלפוחית-כל תמונה של תאים נחשפו לתנאים מול או hypertonic. בניסויים שלנו, השתמשנו בתוכנה ImageJ עבור ניתוח תמונות. ראוי לציין כי לניתוח תמונה של ultrastructure הסלולר מתמונות TEM של תאים, התאמת גודל של מדידות אלה בהתבסס על עובי סעיפים התא צריך להיחשב שתוארו קודם לכן על ידי המעבדה Almers´s30.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נתאר כאן את הפרוטוקול עבור איך שילוב הדמיה TEM יחד עם שתי מתודולוגיות אלקטרוכימי, סיבי פחמן amperometry ותאיים cytometry אלקטרוכימי, יכול לספק מידע רווחים מבט רחב יותר על השפעת חוץ-תאי לחץ אוסמוטי על שלפוחית הפרשה ותהליך אקסוציטוזה. על ידי השוואת amperometric נציג הקלטות של שחרור אקסוציטוזה תאים chromaffin בודדים באמצעות את ניסיוני להגדיר (ראה איור 1), ירידה משמעותית בפעילות exocytotic היה מוצג כאשר תאים נחשפו osmotic דגש לעומת תאים בתנאים מול (איור 2 א)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים כאן פרוטוקול ומהם היתרונות של שילוב שלוש שיטות אנליטיות משלימים לנתח שלפוחית הפרשה ותהליך אקסוציטוזה כדי להשיג הבנה טובה יותר של כיצד כוח פיזי כגון לחץ אוסמוטי יכולות להשפיע על הפרשה שלפוחית בתהליך אקסוציטוזה בתאי הפרשה. שיטות אלה כוללות סיב פחמן microelectrode amperometry, אשר היא שיטה הוקמה עבור הקלטה אקסוציטוזה פעילות, תאיים cytometry אלקטרוכימי, המשמש לקביעת הגודל quantal של שלפוחית בסביבה הטבעית שלהם, ו שידור ניתוח תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים לפקח נפח שלפוחית הפרשה. בעבודה זו, על ידי איסוף נתונים כמותיים של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות המועצה למחקר השבדי (349-2007-8680) למימון, Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, שוודיה) לתרומה של שור בלוטת יותרת הכליה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
NaClSigma AldrichS7653
KClSigma AldrichP9333
NaHCO3Sigma AldrichS5761
HEPESSigma AldrichH3375
MgCl2Sigma AldrichM-2670
גלוקוזסיגמא אולדריץ'G8270
Collagenase PRoche, שוודיה11 213 857 001
100-µ M ניילון רשתפישר סינטיפיק08-771-19
PercollSigma AldrichP1677
קולגן IV מצופה 60 מ"מ צלחת פלסטיקVWR354416
צנטריפוגהAvanti J-20XP
נימי זכוכית בורוסיליקטSutter instrument Co., Novato, CA
חולץ מיקרופיפטהNarishing Inc., יפןPE-21
פתרונות אפוקסי (A ו-B)טכנולוגיית אפוקסי, Billerica, MA
BevellerNarishing Inc.EG-400
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX81
תיקון מהדק מכשירמכשירים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניהAxopatch 200B
מיקרומניפולטורBurleigh Instrument Inc., ארה"בPCS-5000
בוטאן להבהMultiflame AB, Hä sselholm, שוודיה
מיקרוסקופ אלקטרונים שידוראומגהליאו 912 AB

מקורות

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33(1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633(1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים