הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים

6.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56547

⸱

29 באוקטובר 2017

 , 
1Department of Biology, Chemistry and Environmental Sciences, American University of Sharjah, 2Department of Biology, The City College of New York

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים הליך פתולוגיה המגלה אבץ למינריות, אריאל האופיינית מכתים דפוסי באזורים שונים במוח. התבנית מכתים אבץ עשוי לשמש בשילוב עם סמנים אנטומיים אחרים להבחין בצורה אמינה שכבות של אזורים במוח המתפתח, למבוגרים.

תקציר

אפיון של הארגון האנטומי ופונקציונלי המוח ופיתוח דורש זיהוי מדויק של המעגלים העצביים ברורים אזורים במוח ילדותי. ולא למבוגרים. כאן נתאר אבץ פתולוגיה מכתימים הליך זה מגלה הבדלים בדפוסי מכתימים בין שכבות שונות ואזורי המוח. אחרים נעזרו הליך זה לא רק כדי לחשוף את ההתפלגות של נוירונים, מעגלים במוח המכילים אבץ, אלא גם על בהצלחה גבולות אמיתיות ולא למינריות במוח המתפתח, למבוגרים מספר מינים. כאן אנחנו להמחיש זאת מכתים הליך עם תמונות של פיתוח והמוח פארט למבוגרים. אנחנו חושפים תבנית מכתים אבץ משמש סמן האנטומי של אזורים ושכבות, יכול לשמש באופן אמין להבחנה חזותית באזורים קורטיקליים הראייה בקליפת המוח המתפתח, למבוגרים. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להציג שיטה פתולוגיה המאפשר זיהוי מדויק של שכבות, אזורים במוח המתפתח, למבוגרים בו שיטות אחרות לא תעשה. שנית, בשילוב עם ניתוח תמונות densitometric, שיטה זו מאפשרת לו להעריך את ההתפלגות של אבץ סינפטית לחשיפת פוטנציאל שינויים במהלך הפיתוח. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את ריאגנטים, ' כלים ' השלבים הנחוצים להפיכת במרוכז כתם מוח קפוא מקטעים. למרות פרוטוקול זה מתואר באמצעות רקמת המוח חמוס, זה בקלות יכול להיות מותאם לשימוש מכרסמים, חתולים או קופים גם ואזורים נוספים במוח.

מבוא

כתמי היסטולוגית שימשו באופן מסורתי כדי לסייע בזיהוי אזורים קורטיקליים במינים שונים על ידי חשיפת ההבדלים בתכונות ארכיטקטוני. השימוש המשולב של פתולוגיה טכניקות כגון חומר Nissl, תגובתיות ציטוכרום אוקסידאז (CO) או המיאלין יכול להוכיח פורה כפי הם חושפים דומה גבולות המכסים איזורים במוח למבוגרים. עם זאת, הכתמים פתולוגיה האלה לא תמיד מספקת לחשוף גבולות ברורים בין אזורים קורטיקליים ושכבות במוח לא בוגר.

במערכת העצבים המרכזית, אבץ יש כמה תפקידים קריטיים הכוללים ייצוב מבנה ה-DNA, מתנהג כמו קופקטור האנזים, השתתפות פונקציות רגולטוריות רבות, מתנהג כמו המודל העצבי דרך נוכחותה הסינפטיות 1. אבץ סינפטית היא ייחודית כמו זה ניתן לאבחן באמצעות שיטות היסטולוגית, ואילו חלבון מכורך אבץ לא יכול להיות מטמיעים2. תכונה זו נוצלה כדי לחשוף את התבנית אבץ סינפטית אזורים קורטיקליים שונים, אבץ סינפטית להסטולוגיה שימש במספר מחקרים. תת-קבוצה של glutamatergic נוירונים בקליפת מכילים אבץ השלפוחיות המוגלתיות presynaptic בתוך3,שלהם מסופי האקסון4. לימודי מעבדה הומנית נחשפו התפלגות הטרוגנית של אבץ סינפטית קליפת המוח5,6,7. נראה שיש חלוקה אמיתיות ולא למינריות שונה של האבץ ריאקטיבי histochemically אזורים קורטיקליים שונים (למשל, חזותית לעומת קליפה המגע), או שכבות (למשל, רמות אבץ supragranular, שכבות infragranular של קליפת הראיה העיקרית הם התלמידות-גבוה בהרבה thalamocortical קלט שכבה IV עם רמות אבץ סינפטית נמוכה יחסית)5,8,9. הטרוגניות של אבץ סינפטית מכתים שנצפתה קליפת יש יתרון במיוחד הוא מקל זיהוי אמיתיות, אביזרים.

כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הליך פתולוגיה אבץ סינפטית, אשר יש את הגירסה של Danscher-1982-שיטה-10. שיטה זו משתמשת הסלנייט מוזרק intraperitoneally (IP) חיות כמו חומר מכלט. הסלנייט נוסע אל המוח כדי להגיב עם שלוליות חינם אבץ שנמצאו ב שלפוחית של קבוצת משנה של glutamatergic הסינפסות במוח. התגובה הזו מניבה התמיסה זה יכול להיות מוגברת לאחר מכן על ידי פיתוח כסף2,10,11.

הליך זה חושף למינריות אמיתיות דפוסי אבץ סינפטית מכתימה; ניתוח densitometric עשוי לשמש כדי להעריך הדפוסים הללו איכותית והן באופן כמותי במוח למבוגרים ולא בוגרת כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות אחרות, כגון מניפולציות חושית, איכות הסביבה, תרופתי או גנטית. יתר על כן, אחד מומלץ גם להעריך את פוטנציאל שינויים התפתחותיים בתחום ההפצה של אבץ סינפטית במבנים אחרים בקליפת המוח או subcortical במערכות אחרות מודל. המידע הכמותי המספק ניתוח densitometric בשיטה זו יכול להיות יתרון להתפתחות המוח הבאות לאורך זמן. פרוטוקול זה מספק חבר של אחרים חיסונית - וסמנים פתולוגיה כדי לחשוף את גבולות למינריות ולא אמיתיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול הבאים מנחים את טיפול בבעלי חיים נוסדה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) ב- מכללת ניו יורק, אשר לציית כל המדינה המתאימה והנחיות הפדרלי. הרדמה מתאים חמוסים, צריך להיות שונה לפי מינים למד.

figure-protocol-1
איור 1: תרשים זרימה בהתוויית הצעדים העיקריים המעורבים ב-3 שלבים של הפרוטוקול ואת הזמן הדרוש להשלמת כל צעד. תקופות דרישת סעיפים להתייבש לגמרי מוצגים עיגולים ירוקים טקסט, בעוד כל צעדים אחרים נמצאים במעגלים טקסט לבן. תיבת הטקסט בצורת יהלום ירוק מהווה נקודת ההחלטה, ואילו המלבן האדום הוא שלב קריטי יש לבצע עם טיפול נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

1. פעולות הכנה (שקופית ממלא מקום, ביצוע פתרון)

  1. לרחוץ שקופיות unsubbed עם חומר ניקוי במים חמים ולשטוף מספר פעמים במים חמים ולאחר מכן עם שטיפה מים מזוקקים להסרת ביסודיות כל לכלוך או פסולת. לאפשר שקופיות לייבוש בטמפרטורת החדר או בתנור ב- 37 מעלות צלזיוס.
  2. ברגע המגלשות יבש לחלוטין, שכבה מעיל אפילו דקה של ביצה-לבן בכל שקופית בעזרת האצבעות או במכחול. אפשר לייבש בתנור ב 60 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. לקבלת תוצאות מיטביות, וכדי להימנע מקטעים מאובדן, להוסיף שכבה שנייה של חלבון ביצה ולאפשר להתייבש פעם נוספת בתנור ב-60 מעלות צלזיוס
  3. להכין פתרון ג'לטין 1% על ידי המסת 1 גרם של ג'לטין ב- 100 מ של מים חמים (60 ° C) ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
  4. להכין 200 מ של מפתח הפתרון כפי שמתואר להלן לשימוש בסעיף 4.
    1. הכן שסחרה פתרון על-ידי לאט הוספת 40 g במרווחים של 120 מ ל מים חמים (הוא מתמוסס בקלות רבה יותר בדרך זו). להמשיך לבחוש את הפתרון עם זכוכית זע רוד. ברגע הפתרון יש התפרקה לחלוטין, להסירו מהאש ולאפשר לו להתקרר למשך כמה דקות, ואז לסנן בין 6-8 שכבות של בד גזה משפך.
      2. מאגר
    2. ציטראט הכן על-ידי הוספת ציטראט נתרן חומצה ציטרית ועוד 4.7 g 5.04 g 20 מ ל dH 2 O את התערובת. ודא כי ה-pH של פתרון זה 4.0-25 ° C. התאם ה-pH במידת הצורך על-ידי הוספת סודיום הידרוקסיד או חומצה הידרוכלורית הפתרון.
    3. להכין את הפתרון הידרוקינון על ידי חימום 30 מ ל dH 2 O, המסת 1.7 g של הידרוקינון.
      הערה: מתחמם הפתרון הידרוקינון חיוני כדי לאפשר לו מתמוסס בקלות במים, הידרוקינון אינה ברצון נמסים במים בטמפרטורת החדר. יש להקפיד לשמור על הטמפרטורה של המים מתחת 60 ° C, אחרת עלולה להיות תחמוצת הידרוקינון. אם הפתרון לצהוב, למחוק ולהכין פתרון טרי אחר.
    4. הכנת כסף לקטט פתרון על ידי המסת 0.22 g ב- 30 מ של dH 2 O.
    5. לערבב את הפתרונות (1.4.1 - 1.4.4) לפי הסדר שבו הם מתוארים כשאתה מוכן לבצע את התגובות (דהיינו, לאחר חלוקתה, ייבוש, ולתקן) ( איור 2). הוסף את הפתרון לקטט כסף בסוף. להבטיח כי צעד זה הושלם במהירות, הפתרון מפתח מושם בחושך עד שהגיע הזמן להגיב הסעיפים כפי לקטט כסף רגישה לאור.

figure-protocol-2
איור 2: מפרטים טכניים, הממחישות את רצף השלבים המעורבים ערבוב של ריאגנטים בשלב להסטולוגיה אבץ של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. הרדמה וטיפול חיה

  1. לפני לסמם את החיה, להכין פתרון הסלנייט (נה 2 SeO 3) 1% נתרן על ידי המסת 10 מ ג של סודיום סלניט 1 מ"ל dH 2 O.
  2. עזים ומתנגד החיה עם זריקה תוך שרירית של קטאמין (25 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (2 מ ג/ק ג).
    הערה: ודא כי רמה מתאימה של הרדמה מושגת באמצעות תגובת רפלקס פדלים.
  3. הכנס אבץ chelator סודיום סלניט פתרון (15 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally (IP).
    הערה: הרעילות של סודיום סלניט בגילאים שונים או מינים אחרים יכול להשתנות.
  4. אפשר 60 עד 90 דקות עבור הנתרן הסלנייט לנסוע אל המוח. במהלך תקופה זו, זה הכרחי כדי להבטיח כי החיה מורדמת כראוי והוא לא מגיב, אז בדוק את עומק ההרדמה כל 5 דק
  5. במהלך תקופת סלניט, בעוד החיה. הוא מורדם, להבטיח כי לעצום העיניים למניעת יובש, או לנהל אופטלמולוגיות משחה כדי לשמור על לחות.

3. רקמות והכנה Staining

  1. להרדימו על ידי מתן מנת יתר של סודיום פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג, מקומות).
  2. זלוף transcardial בצע עם תמיסת מלח רגיל עבור 1 דקות, ועם 4% paraformaldehyde עבור 20 דק. לבסוף, לנהל פתרון עם 4% paraformaldehyde ו 10% סוכרוז (תקופה קיבוע מוחלט של 1 h).
  3. להסיר את הראש באמצעות זוג מספריים גדולים.
  4. עושים חתך קו האמצע באמצעות אזמל של האף בצוואר כדי לחשוף את הגולגולת.
  5. בזהירות להסיר את המוח ולהפריד את ההמיספרות עם להב-
  6. לחסום את החלק האחורי של המוח, postfix ב 4% paraformaldehyde במאגר פוספט 0.1 M (PB) במשך כמה שעות.
  7. מקום הבלוקים לתוך 30% סוכרוז פתרון ב 0.1 M PB ולאפשר המוח לשקוע.
    הערה: החלפת 4% paraformaldehyde 30% סוכרוז הפתרון, עם 30% סוכרוז הפתרון ב 0.1 M PB לשקוע המוח מגביל את המוח ' s חשיפה paraformaldehyde כמו זה יכול להשפיע על רקמות מכתים איכות.
  8. פעם המוח כיורים, לחתוך חצי וצורניים מיקרומטר 40 מקטעים עבה דרך קליפת הראייה או אזור עניין על הקפאה, הזזה מיקרוטום או cryostat. זה יכול להתבצע על ידי הצבת הרחוב עם המדיאלי פני השטח למטה, השיטוח בעדינות עם זכוכית-
  9. לאסוף במקטעים עם מכחול, בחנות קופסת הכלים המכיל באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
  10. להפריד בין החלקים לתוך סדרה ממוספרת בנפרד. מיד הר אחד או שתי סדרות של המוח מקטעים בשקופיות מחלבונים לספסל (סעיף 1), מאפשרים לינה יבש בטמפרטורת החדר, ולעבד מקטעים histochemically עבור אבץ סינפטית.
    הערה: סדרות אחרות עשויים להיות מעובד עבור סמנים אחרים לשם השוואה, כגון המיאלין 12 או אוקסידאז ציטוכרום באמצעות פרוטוקול ששונה 13: תקופת דגירה של 2-8 h ב 40 מעלות צלזיוס עם 3% סוכרוז, 0.015% ציטוכרום C, קטלאז 0.015%, diaminobenzidine 0.02% ב PB 0.1 M. Nissl חומר עשוי גם לשמש כסמן היסטולוגית להבחנה חזותית אזורים קורטיקליים. אלה כתמים היסטולוגית אחרים אינם מחייבים כי חלקים במוח הם רכובים בשקופיות לספסל מחלבונים, אז השקופיות ג'לטין מסורתי מצופה ניתן להשתמש במקום זאת.

4. להסטולוגיה אבץ סינפטית

  1. לתקן מקטעים שקופית רכוב המוחלט אלכוהול למשך 15 דקות, אפשר להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר במשך ה 1
    2. < lאני > בקצרה לטבול מקטעים עבור 10 s בפתרון ג'לטין 1% (סעיף 1) וגם תאפשר לילה יבש בטמפרטורת החדר.
    הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות מאפשר מקטעים כדי לילה יבש. מאפשר מקטעים לילה יבש על התשואות צביעת רקמות טוב יותר.
  2. מערבבים את הפתרונות יחד כפי שמתואר בשלב 1.8 ברגע מקטעים מוכנים להיות הגיבו.
    1. להגיב הסעיפים על ידי הסדרת השקופיות לצד בכוס, או מגש פלסטיק, לשפוך את הפתרון המתפתח על השקופיות. לוודא כי שקופיות הם שקועים לחלוטין הפתרון ולא להעביר את המגש לתוך חלל חשוך, או לכסות עם תיבת אור חזק-
      הערה: מגש פלסטיק זה כ 12 אינצ'ים ארוך על ידי 8 אינץ ' רחב יכול לשמש, מה שמתאים בדיוק 18 שקופיות. הנפח הכולל של 200 מ ל מפתחת פתרון מספיקה לגמרי להטביע את השקופיות, אז ודא כי אמצעי האחסון הנכון משמש עבור מספר השקופיות כדי להיות הגיבו ולהתאים את המתכון בהתאם. השימוש מגש פלסטיק או זכוכית לעומת שימוש מגש מתכת מומלץ יש מידה מסוימת של צלב תגובתיות בין של לקטט כסף בפתרון מפתח הברזל או מתכות השני מגשי מתכת שנמצא ב-
  3. לפקח על התפתחות התגובה על-ידי בדיקה חזותית של הסעיפים כל 30 דקות. הסעיפים דורשים בדרך כלל 120-180 דקות להתפתחות מלאה.
  4. אם המקטעים יהפכו overstained (ראה איור 3 א), להבדיל אצל 2% חקלאי ' s פתרון (9 חלקים 2% נתרן תיוסולפט dH 2 O ו- 1 חלק 2% אשלגן Ferricyanide dH 2 O) עבור 1-2 דקות
    הערה: סעיף מדגם זה יהיה מוכתם לקוי מוצג באיור 3b.
  5. פעם העוצמה הרצויה מושגת, לסיים את התגובה על ידי הסרת את השקופית רכוב מקטעים של המגש והצבת השקופיות על מתלה שקופיות.
  6. למקם את המדף שקופית בכוס גדולה להכתים את המנה, לשטוף את השקופיות חמים (40-50 ° C) זורמים במשך 10 דקות להסיר את המעיל הג'לטין ואת ההפקדה כסף החיצוני.
    הערה: יש להיזהר לא להתסיס המדף שקופית כדי למנוע מקטעים מאובדן. העוצמה הרצויה של המקטע מושגת כאשר מספיק וריאציה למינריות מתבטא מקטעים מספיק חשוך אבל לא הגבתי (ראה איור 4a).
  7. לאפשר את השקופיות יבש בטמפרטורת החדר ולאחר מכן מייבשים 100% EtOH (5 דקות), ברור של קסילן (5 דקות), כיסוי להחליק עם מדיום הרכבה. לחלופין, למקם את השקופיות סדרות בסדר עולה של אלכוהול, ואז מייבשים, נקי, coverslip.
  8. שימוש בסעיפים מחיות ללא טיפול הסלנייט הקודם כדי לשמש פקד שלילי. כסף הגברה של סעיפים אלה אמור להניב לא מכתים.

figure-protocol-3
איור 3: אבץ סינפטית מכתים במוח פארט לנוער- Photomicrographs למחצה וצורניים שהוכתמו אבץ בסעיפים א). overstained, ב) understained במוח פארט לנוער. גבולות אמיתיות הן קשה להבחין כמו וריאציה למינריות לוקה בחסר. חומר לבן גם בכבדות מוכתם. Ssy Suprasylvian cortex, WM לבן משנה, קדמי, D הגבי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (-b). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. הבחנה גבולות אמיתיות ורכישת תמונות

  1. שימוש בתכונות ארכיטקטוני של אזורי מוח שונים לזיהוי אמיתיות ולא למינריות.
    הערה: לדוגמה, פיתוח עכברוש retrosplenial cortex 14, המחברים חשף מודולריות ארעי המאופיינת על ידי צביעת כבד עבור אבץ, אשר לא קיים אצל אדם בוגר, אבל יכול להיות מנוצל כדי לתאר קורטיקלית ארגון במהלך הפיתוח של מין זה. מחקר אחר 15, המחברים חשף ירידה לפרטים בהפצה אבץ סינפטית של גרעינים שונים נמצאו באמיגדלה קוף מקוק, המספקות זיהוי של החטיבות. אזורים קורטיקליים חזותי במוח פארט המתפתח ומבוגרים כבר 17 , שתואר לעיל 16 , 18, חלוקה ארכיטקטוני של קליפת ב הסנאי האפור היו שתואר 19. יתר על כן, שבעבר שימשה להסטולוגיה אבץ להבחין בין אזורים קוף למבוגרים קליפת 8, בפיתוח של מבוגר החתול קליפת 5, פיתוח קליפה המגע עכברוש 9 , 20, העכבר למבוגרים קליפה המגע 6 , 21. אם הוא זמין, להשוות את דפוס ההגדלה של המיאלין צבעונית, ציטוכרום אוקסידאז (CO) צבעונית, ואבץ סינפטית צבעונית מקטעים המוח, כדי לאשר את גבולות אמיתיות אצל אדם בוגר. בסעיפים למחצה וקולו של חמוס קליפת מוכתם אבץ סינפטית, ישנם הבדלים בולטים בין אזורים קורטיקליים חזותי המאפשרים זיהוי אמיתיות. לדוגמה, אזורים 17 ו-18 שחמוס למבוגרים חושפים כי אבץ סינפטית מכתים הוא גבוה ב שכבות I-III, (פ') שכבה VI כתמי פחות בעוצמה, בעוד שכבה IV כמעט חסר אבץ. בולט חוסר אבץ צביעת שכבה IV או אזורים 17 ו-18 ניגודים כשהרצועה ויטראז'ים בקדרות למצוא שכבה ש-IV ב- CO צבעונית מקטעים. עם זאת, שכבה IV באזור 17 ב CO סעיפים מוכתמים שומרת על גבול חד עם שכבות III ו- V, אבל שכבה IV באזור 18 מאופיין על ידי ירידה עדין מכתים בעוצמה, הגבול העליון שלה נמצאו בשכבה השלישי הוא פחות ניתן להבחנה.
  2. לבחון למקטעים באמצעות מיקרוסקופ brightfield עם מטרה צריכת חשמל נמוכה (2 X או 4 X הגדלה) ולצלם תחומי עניין-
  3. שפר את החדות והבהירות של photomicrographs באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. תמונות שהושג עבור מדידות צפיפות אופטית לא צריך להשתנות בצורה כלשהי.

figure-protocol-4
איור 4: אבץ סינפטית מכתים במוח חמוס בוגר מבדיל אזורים שונים בקליפת המוח החזותי. Photomicrographs של חלקים למחצה וצורניים סמוכים מוכתם () סינפטית אבץ או (b) ציטוכרום אוקסידאז (CO) אצל אדם בוגר. החצים מסמנים גבולות אמיתיות. Ssy Suprasylvian cortex, קדמי, D הגבי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

6-Densitometry (אופציונלי)

הערה: Densitometric ניתוח עשוי לשמש כדי להעריך את ההתפלגות של אבץ סינפטיים במוח על ידי מדידת צפיפות אופטית של אבץ נציג צבעונית מקטעים באזורי עניין. שיטה זו שימושית גם עבור מעקב אחר שינויים פוטנציאליים רמות אבץ סינפטית במהלך פיתוח.

  1. שימוש שנבחרו שהוכתמו אבץ מקטעים, בחר באופן אקראי קורטיקלית (טורי photomicrographs) של רוחב המתאימה (עמודה רחב מיקרומטר 450 יכול לשמש) רכשה photomicrographs של האזור בעל עניין. עמודה קורטיקלית הוא אזור המתפרסות על-פני כל השכבות בקליפת המוח מפני השטח pial בחומר הלבן.
  2. לבחור מספר מתאים של עמודות מדגם בכמה סעיפים מוח שונים בכל אזור עניין.
  3. להעביר תמונות לדוגמה של עמודות נציג לתוך תמונה בתוכנת עיבוד.
  4. השתמש בכלי בחירה מלבנית כדי להקיף את העמודה כולה קליפתי.
  5. להשתמש בכלי ' היפוך ' כדי ליצור תמונת ניגודיות הפוך הדומה תשליל של צילום של העמודה.
    הערה: היפוך החדות של התמונות מתבצעת להניב צפיפות אופטית גבוהה עבור רמות אבץ סינפטית גבוה וערכי נמוך צפיפות אופטית עבור רמות נמוכות של אבץ סינפטית. זוהי דרך אינטואיטיבית יותר לעיבוד מגרש פרופיל גרפים זהים לאלו ראה באיור 5.
  6. לייצר צפיפות אופטית פרופילים מתמונות אלה באמצעות הכלי פרופיל מגרש כדי ליצור גרף דו מימדי של עוצמות פיקסל לאורך קו-
  7. השתמש באפשרויות מגרש כדי להמיר את הגרף פרופיל מגרש פרופיל אנכי ולחץ על מגרש פרופיל פעם יותר.
    הערה: המרחק מייצג ציר ה-x לאורך הקו, ציר ה-y מייצג את עוצמת פיקסל. לכן, כל ערך פרופיל מגרש משקף את הערך הממוצע סולם אפור בעומק כל לרוחב העמודה.
  8. מגרש פתוח פרופיל כקבצי טקסט בגיליון האלקטרוני, לנרמל, וערכים מגרש כמו גרפים (ראה איור 5).
    הערה: מומלץ להשתמש צפיפותה היחסית של אבץ סינפטית להשוואה של מדידות כמותיים תוצאות יכול להיות מבולבל על ידי וריאציה בעוצמתם מכתימים הכוללת כתוצאה זמני תגובה שונה, ההכתמה של רקמות, כמו גם את השני משתנים.
  9. לחשב צפיפות אבץ היחסי על-ידי ממוצע לקרון של הערכים פרופיל מגרש כדי להחליק את הנתונים לבצע תחילה.
    הערה: פעולה זו מושגת באמצעות חישוב ממוצע, לדוגמה, כל הפיקסלים רצופים של 20 או 30 (1 פיקסל = 2.5 מיקרומטר) עומק, נרמול אז אל העוצמה המקסימלית עבור כל דגימה. לכן, כל ערך פרופיל מגרש הממוצע משקף את הערך הממוצע סולם אפור בעומק זה (סולם אפור טווח ערכים מ- 0 עד 255). שיטה לנרמול שונים עשויים לשמש הראשון ערכי צפיפות אופטית רכישת חומר לבן (WM) מאזורים מדגם הכוללים בחומר הלבן שמתחת את תחומי עניין. באופן אידיאלי, לבחור מספר אזורים מוכתמים קלילה ככל האפשר כדי לקבל ממוצע WM ערך. צפיפות אופטית ממוצע הערכים מחולקים ואז בערכים WM מתכוון להשיג ערכי WM מנורמל.
  10. לקבוע כלומר ערכים צפיפות אופטית בשכבות ספציפיות של אזורים מעניינים להשוואות כמותיות.
    הערה: לדוגמה, הערך רשע צפיפות אופטית מינימלית בשכבת הרביעי של אזורים קורטיקליים חזותי של שחמוס נקבעים על-ידי המקיף את האזור המוכתם לפחות על ±5 פיקסלים-
  11. חישוב צפיפות אופטית רשע ערכים הרבדים supragranular ו- infragranular של אזורים קורטיקליים חזותי של שחמוס מאת המקיף את האזור המוכתם האפלים ביותר על ±5 פיקסלים כדי לקבוע את הערך המרבי רשע.
  12. ודא זה אומר ערכי צפיפות אופטית התקבלו בתוך שכבות מסוים.
    הערה: זה הכרחי כדי לאמת את גבולות הגוף האנושי של תמונות חדות הפוכה על-ידי השוואתם את photomicrographs המקורי, כמו גם הסעיף CO סמוכים. זה מבטיח כי אחד לא להפריע בשכבות סמוכות.

figure-protocol-5
איור 5: למינריות הפצה של אבץ סינפטית חזותיים שונים בקליפת המוח באזורים בוגרים שחמוס. Photomicrographs נציג של עמודות דרך כל השכבות קורטיקלית עם פרופילים המתאימים מנורמל צפיפות אופטית של אדם מבוגר. צפיפות נמוכה אבץ סינפטית בשכבה הרביעי של אזורים למבוגרים 17 ו-18 מציינים את השוקת בעלילה פרופיל. בפרופיל בכל מגרש, אליפסות מלא בשוקת של שכבה IV מציינים הערכים בהם משתמשים כדי לקבוע את הערך בעוצמה של הפיקסל המזעריות הממוצע. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצעדים העיקריים המעורבים פרוטוקול זה כתם המוח מקטעים עבור אבץ סינפטית מוצגים בתרשים זרימה באיור1. הפרוטוקול יכול להיות מחולק לשלושה שלבים: 1) זלוף, אוסף רקמה, הכנה 2) רקמת מכתים ואני להסטולוגיה 3) אבץ. בקצרה, במהלך השלב הראשון של הפרוטוקול, החיה הוא מורדם, הזריקו המינון המתאים של סודיום סלניט IP. אחרי מספיק זמן תקופה (אידיאלי 60-90 דקות), החיה היא לאחר מכן מורדמים, perfused עם 0.9% NaCl פתרון ואחריו פתרון paraformaldehyde 4%. הוא ערף את הראש, המוח יוסר במהירו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי מעסיקה פתולוגיה טכניקה המבוססת על גירסה שונה של Danscher (1982) שיטת10, לפיו אבץ סינפטית לוקליזציה ייתכן ועוזרת דמיינו במוח. שיטה זו פועלת בעיקר באמצעות הזרקת החיה עם הסלנייט נתרן chelator אבץ (נה2SeO3) (15 מ"ג/ק"ג). בעקבות זריקה, סלנייט נוסע אל המוח ומאגד אבץ חינם זה הוא מקומי כדי presynaptic שלפוחית של אבץ המכיל נוירונים. אבץ יונים מאוגדים מולקולות בתוך התמיסה הסינפטיות, ניתן לאבחן לאחר מכן דרך התפתחות גופנית2,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמך על ידי מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (2G12RR03060-26A1); המכון הלאומי על מיעוט בריאות פערים בשרותי בריאות (8G12MD007603-27) מ המכונים הלאומיים לבריאות; צוות מקצועי הקונגרס-סיטי יוניברסיטי בניו-יורק (PSC-הנטר); ומחקר בפקולטה גרנט (FRG II) האוניברסיטה האמריקאית של שארג'ה. אנו מודים Vidyasagar Sriramoju על שהכרת בינינו לשיטות אלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אותסול (תמיסת המתת חסד)הנרי שיין710101
נתרן סלניטסיגמא-אולדריץ'214485
קטמין (קטבד)הנרי שיין48858100 מ"ג/מ"ל זריקות
קסילזין (אנסד)הנרי שיין33198100 מ"ג/מ"ל זריקות
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'F8775מדולל עד 4%
גומי ערביסיגמא-אולדריץ'G9752-500 גרם
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'C1909
נתרן ציטראטסיגמא-אולדריץ'W302600
הידרוקינוןסיגמא-אולדריץ'H9003
כסף לקטטסיגמא-אולדריץ'85210
ג'לטין דגיםסיגמא-אולדריץ'G7765
ציטוכרום cסיגמא-אולדריץ'C2506(סוג III, מלב סוסים)
קטלסהסיגמא-אולדריץ'C10
סוכרוזדומינו
קסילןפישר סיינטיפיקX5P-1GAL
פרמאונטפישר סיינטיפיקSP15-500
100% אתנולפישר סיינטיפיקA406-20משמש להתייבשות לפני הרכבה על שקופיות
Coverslipsמעבדות מחקר מוח#3660-1
שקופיות חלביות ללא משנהמעבדות לחקר המוח#3875-FR
MicrotomeAmerican Optical Company860
מיקרוסקופאולימפוסBX-60
Adope פוטושופAdobe Systems, סן חוזה, קליפורניהלהרכבת תמונות
ניתן להוריד את התוכנה החינמית של ImageJ בכתובת http://rsb.info.nih.gov/ij/למדידות דנסומטריות
מגש פלסטיקניתן להשתמשכדי לטבול שקופיות בפתרון המפתחים
פלטה חמהניתן להשתמש
בכל מגש פלסטיק סטנדרטי בכל פלטה סטנדרטית

מקורות

  1. Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
  2. Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
  3. Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
  4. Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
  5. Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
  6. Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
  7. Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
  8. Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
  9. Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
  10. Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
  11. Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
  12. Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
  13. Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
  14. Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
  15. Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
  16. Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
  17. Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
  18. Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
  19. Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
  20. Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
  21. Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
  22. Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צביעת חתכי מוחניתוח קליפת המוח הוויזואליתרקמת מוח של נמסהכנת תמיסת מפתחהזרקת נתרן סלניטפרוטוקול פרפוזיה טרנסקרדיאליתחיתוך במיקרוטום בהקפאההליך ציפוי בג'לטיןפרופיל צפיפות אופטית
השימוש להסטולוגיה אבץ סינפטית כדי לחשוף אזורים שונים שנבזזו במוח המתפתח, למבוגרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.