ויזואליזציה של האקסון Thalamocortical הסתעפות, סינפסה-צורה Organotypic Cocultures

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה סימולטני של thalamocortical האקסון מסעף סינפסה היווצרות של organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח. Thalamocortical בודדים אקסונים ומסופי presynaptic שלהם הם דמיינו ידי טכניקה אלקטרופורציה תא בודד עם DsRed ו מתויג GFP synaptophysin.

תקציר

האקסון מסעף סינפסה היווצרות הן תהליכים חיוניים להקמת מעגלים עצביים מדויק. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים thalamocortical (TC) טופס סניפים, הסינפסות בשכבות ספציפיות של קליפת המוח. למרות קורלציה מרחבית ברורה בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות, הקשר הסיבתי בין אותם ממעטים להבין. כדי לטפל בבעיה זו, לאחרונה פיתחנו שיטת הדמיה סימולטני של הסתעפות סינפסה היווצרות של אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures.

פרוטוקול זה מתאר שיטה אשר מורכב של שילוב של organotypic coculture ושל אלקטרופורציה. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח להקל על מניפולציה ג'ין והתבוננות של תהליכים עצב, שימור מבנים אופייניים כגון תצורת למינריות. שני פלסמידים שונים קידוד DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס על ידי טכניקת אלקטרופורציה. שיטה זו אפשרה לנו לדמיין מורפולוגיות עצב בודדים של נוירונים TC ואתרים presynaptic שלהם בו זמנית. השיטה זמינה גם תצפית לטווח ארוך אשר חשף את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.

מבוא

התחזית thalamocortical (TC) במוח של יונקים היא מערכת מתאימה לחקור מנגנוני הדרכה האקסון ומיקוד. במהלך הפיתוח, אקסונים סנסוריים TC לגדול צלחת בקליפת המוח, ואת הטופס סניפים, הסינפסות מעדיפים בתוך שכבה IV של אזורי החישה העיקרי קליפת המוח^1,2. גם לאחר הקמתה של חיבורי היסוד, עצב ובשבילים ומסופי סינפטית הם השתקם בהתאם שינויים סביבתיים^3,4. עם זאת, איך TC האקסון המורפולוגיה היא שונה באופן דינמי הוא ממעטים להבין. אחת הסיבות העיקריות היא חוסר טכניקה נאותה לבחון שינויים מבניים ברמה תא בודד. למרות ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופ, כגון מיקרוסקופ שני הפוטונים, אפשרו בהתבוננות ישירה של החיים נוירונים בקליפת המוח ויוו, ישנן מגבלות טכניות עדיין עבור לכידת הכוללת TC מסלולים^{5, 6}. לכן, במבחנה שיטות הדמיה חיה של אקסונים TC יספק כלים רבי-עוצמה עבור ניתוח מבנה של האקסון מסעף סינפסה היווצרות.

הקבוצה שלנו בפעם הראשונה הוקמה שיטה התרבות פרוסה סטטי עם קרום חדיר⁷. באמצעות שיטה זו, פרוסה קורטיקלית חולדה היה cocultured עם בלוק דפנות התלמוס חושית, חיבורים TC פרופריה ספציפי היו recapitulated הזה^7,cocultures organotypic⁸. תיוג דליל עם החלבון הניאון עוד מותר לנו להתבונן סניף היווצרות^9,10,11וצמיחה של האקסון TC. לאחרונה, פיתחנו שיטה עבור הדמיה סימולטני של הסתעפות, סינפסה היווצרות אקסונים TC בודדים ב- organotypic cocultures¹². להמחיש TC אקסונים ואתרים presynaptic בו זמנית, DsRed ו מתויג EGFP synaptophysin (SYP-EGFP) היו transfected משותפת למספר קטן של נוירונים דפנות התלמוס מאת אלקטרופורציה של coculture organotypic. השיטה הנוכחית מקלה על ניתוח מורפולוגי של אקסונים TC ומאפשר התבוננות ארוכת טווח, אשר יכול לשמש כדי להראות את הקשר הסיבתי בין אקסון מסעף סינפסה היווצרות.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו בהתאם לקווים המנחים שנקבעו על-ידי הוועדות רווחת של אוניברסיטת אוסקה, יפן Neuroscience החברה.

1. Organotypic cocultures של תלמוס, קליפת המוח

הערה: לקבלת ההליך מפורט, עיין המקורי פרסומים^7,8,13. כל ההליכים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים. ספראג-Dawley (SD) עכברים משמשים תרבויות עצביים.

1. ההכנות של ריאגנטים
   הערה: כרכים ריאגנטים הבאות הן עבור מוח עכברוש אחד.
   1. הכן 10 x תוספת N2 ששונה ¹³: אינסולין (50 μg/mL), פרוגסטרון (200 ננומטר), הידרוקורטיזון (200 ננומטר), סודיום סלניט (300 ננומטר), transferrin (1 מ"ג/מ"ל), putrescine (1 מ מ), גלוקוז (60 מ"ג/מ"ל)
   2. הכן סרום המכיל תרבות בינוני (10 מ"ל): 85% DMEM/F12, תוספת N2 10 x שונה של 10%, 5% סרום שור עוברית (FBS)
   3. הכן ללא סרום תרבות בינוני (20 מ ל): 90% DMEM/F12, 10% x 10 ששינה N2 תוספת
   4. להכין עכבר זנב קולגן פתרון (0.5 מ"ל). בקיצור, קח במכרז סיבי זנב העכברוש בתנאים סטריליים, דגירה תמיסת חומצה אצטית בן לילה. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את תגובת שיקוע (כמה מ"ג/מ"ל) ולאחסן במקרר¹³.
2. הכנת מאכלים תרבות
   1. למקם את הוספה ממברנה של 35 מ מ פטרי.
   2. להוסיף 40-50 μL של עכבר זנב קולגן פתרון למוח, להפיץ את הפתרון קולגן סביב המרכז.
   3. האוויר יבש קרום לחלוטין ב ספסל נקי.
   4. מכניסים 1.5-2 מ"ל של המדיום תרבות סרום המכיל המנה, כך הקרום ספוגה עם המדיום.
   5. מקם את המנה תרבות בתוך אינקובטור (37 ° C, humidified אוויר 95% ו- 5% CO₂) לפני ציפוי.
3. הכנת פרוסות בקליפת המוח
   1. לעקר כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70% במשך 10 דקות או יותר.
   2. לנתח את זה. במהירות של יום לאחר הלידה (P) 2 עכברוש בהרדמה כקרח (שקוע בתוך קוביות קרח לכמה דקות).
   3. המקום המוח לתוך 100 מ מ פטרי המכיל 100 מ של הנקס קר מאוזנת תמיסת מלח.
   4. הסר את העניין פיא המוח עם מלקחיים בסדר, חותכים פרוסות בקליפת המוח (300-400 μm עובי) מאזור הקליפה חזותי, המגע עם מספריים המיקרוכירורגית (לפרטים, ראה איור 1).
      הערה: עובי הפרוסות בקליפת המוח מוערך בערך לפי קנה המידה של רשתות תחת מיקרוסקופ דו-עינית.
      הערה: לחלופין, פרוסות בקליפת המוח יכולה להתבצע באמצעות vibratome בתנאים סטריליים.
   5. העברת כמה פרוסות בקליפת המוח על גבי קרום המכסה מול פיפטה פלסטיק חד פעמיות.
   6. להתאים את העמדות של הפרוסות ליד המרכז של תרבות הקדמי עם פיפטה פסטר מלוטשים אש (לפרטים, ראה^8,13) ולהסיר עודפי בינוני מהמכסה.
      הערה: להתאים את רמת של המדיום מעט מתחת לפני השטח הפרוסות כך הפרוסות יכול לקבל אספקה מספקת של גז והן בינוני. דבר זה חיוני עבור תא הכדאיות.
   7. לשמור את הפרוסות במדיום תרבות סרום המכיל ב 37 ° C בסביבת humidified 95% אוויר ו-5% CO₂, והתרבות לבד יום אחד לפני בלוק דפנות התלמוס הוא נלקח והניח לידו.
4. הכנה של דפנות התלמוס בלוקים
   1. לעקר כל מכשירי ניתוח עם אתנול 70% במשך 10 דקות או יותר.
   2. עזים ומתנגד חולדה בהריון (עובריים יום 15) על ידי הזרקת פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג) המכיל הרדמה בקרום הבטן.
   3. לנתח כל העובר מן הקרניים הרחם, למקם את העוברים 100 מ מ פטרי המכיל 100 מ של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס קר.
   4. תחת מיקרוסקופ דו-עינית, מסירים את המוח של העובר כל וחותכים בלוקים דפנות התלמוס המכילים בעיקר את גרעין הברך הצדי, מורכבים ולא לרוחב (כ 0.5 מ מ x 3) ventrobasal⁷ באמצעות מספריים השתלה (ראה איור 1).
5. תרבות ולשמור על organotypic cocultures
   1. באמצעות פיפטה של פסטר, מקם את הבלוק דפנות התלמוס לצד המשטח חדרית של הפרוסה קורטיקלית שהונחה ממברנה מסנן.
   2. לשמור את cocultures במדיום תרבות סרום המכיל ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה של אוויר 95% humidified ו- 5% CO₂.
   3. להחליף חצי של המדיום עם המדיום תרבות ללא סרום אחרי יומיים בתרבות. לאחר מכן, חילופי המדיום כל 2-3 ימים.
      הערה: הרמה של המדיום צריך להיבדק אחרי ההחלפה בינוני, כפי שזה חשוב להישרדות התא.

2. אלקטרופורציה

כל ההליכים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים.

הערה: לבצע אלקטרופורציה יום לאחר הכנת הבלוקים דפנות התלמוס כדי למנוע ניתוק של אבני.

1. פלסמידים
   1. להכין תערובת של פלסמידים כדלקמן: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      הערה: לטהר את פלסמידים הן באמצעות ערכת Maxiprep נטולת אנדוטוקסין ו להמיס תמיסת מלח מאוזנת של הנקס.
2. התקנת ציוד אלקטרופורציה
   צריכים להיות מחוברים כלי הנגינה חשמל כגון ממריץ ו- isolator כפי שמוצג באיור2.
   1. לחבר את ממריץ isolator biphasic.
   2. להתחבר אלקטרודה (חוט כסף 0.2 מ מ קוטר) הטרמינל השלילי isolator.
   3. להתחבר אלקטרודה (חוט כסף 1 מ"מ קוטר) בסדרת ועד 100 Ω הנגד על הטרמינל חיובי isolator.
   4. להתחבר המגבר אוסצילוסקופ לפקח אם זרמים חשמליים הם חלף על פני resistor על ידי מדידת המתח עם המגבר.
3. הכנת פיפטות זכוכית
   הערה: שני סוגים של פיפטות זכוכית משמשים עבור הוצאה של הפתרון פלסמיד ויישום של פולסים חשמליים.
   1. להפוך את פיפטות של נימים זכוכית עם פולר אלקטרודה.
   2. . שבור את הקצה על פיפטה הוצאה (הקוטר טיפ צריך להיות μm 20-50).
   3. טוחנים, לשכלל את קצה פיפטה אלקטרודה עם נייר זכוכית ואחריו (הקוטר הפנימי צריך להיות 50-200 μm) וליטוש אש.
      הערה: קצה האלקטרודה צריך להיות שטוח וחלק, כפי שהוא נוגע ישירות את הרקמה.
4. הליך של אלקטרופורציה
   1. לחבר את הפליטה, אלקטרודה פיפטות המניפולטורים.
   2. הכנס חוט כסף (0.2 מ מ קוטר) פיפטה אלקטרודה.
   3. לצרף את פיפטה הוצאה מזרק 1 מ"ל עם צינור פלסטיק.
   4. תופסים > 5 μL של פתרון פלסמיד לתוך פיפטה הוצאה על ידי שאיבה במזרק.
   5. לשים את coculture על הבמה אלקטרופורציה ולאחר הכנס האלקטרודה בקוטר 1 מ"מ המדיום תרבות.
   6. מניחים את פיפטה הוצאה על explant דפנות התלמוס.
   7. לדחוף את המזרק באופן ידני לאחר הטיפ נוגע השטח של הרחוב דפנות התלמוס.
      הערה: על 0.5 μL של פלסמיד פתרון משמש בדרך כלל עבור כל בלוק אחד דפנות התלמוס.
   8. למקם את פיפטה אלקטרודה על הבלוק דפנות התלמוס מיד לאחר משיכת פיפטה הוצאה.
   9. מספקים פולסים חשמליים (μA 50-400, 3 עד 5 רכבות של פולסים מרובע 200 משך ms 1 ב 200 הרץ). נטר את משרעת ומספר רכבות על אוסצילוסקופ.
      הערה: משרעת של זרמים חשמליים תלוי הקוטר הפנימי של פיפטה אלקטרודה¹³.
   10. . משכי את פיפטה אלקטרודה וחוזרים המנה החממה.
5. התבוננות מיקרוסקופית
   1. לשים את הצלחת תרבות שלב מיקרוסקופיים של מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מצויד עם שתי קבוצות מסנן עבור EGFP (עירור, 488 ננומטר; פליטה, 515 ננומטר) ו DsRed (עירור, 514 ננומטר; פליטה, 565 ננומטר).
   2. קח תמונות של 10-25 סעיפים אופטי בגדלים מיקרומטר-שלב 1-7 עם 20 רב-לעבוד X עדשת מרחק אובייקטיבי. בחר בנפרד ניתן להבחנה אקסונים שכותרתו המבטאות הן DsRed והן SYP-EGFP.
      הערה: האזור הנצפה הינו כ 0.7 x 0.7 מ מ (המקביל 1024 x 1024 פיקסלים, כלומר, 0.68 μm לפיקסל).
   3. לכידת תמונות כל 24 שעות ביממה עבור הדמיה מדי יום. להשלים בתוך 10 דקות בטמפרטורת החדר, וחוזרים התרבויות החממה. לדימות לשגות קצר-מרווח הזמן, לשמור על התרבות כדורים תרבות, השומרת על שהסביבה של humidified 95% אוויר ו-5% CO₂ ב 37 º C.

תוצאות

הניסוי המתואר כאן שואף לחשוף את הקשר בין TC האקסון מסעף סינפסה היווצרות. במקביל להמחיש מסלולים עצב, מיקומי אתרי presynaptic, אחד או כמה דפנות התלמוס בתאים organotypic cocultures היו transfected עם פלסמידים 2 קידוד SYP-EGFP ו DsRed באמצעות אלקטרופורציה. במהלך השבוע השני בתרבות, בבירור עם תווית אקסונים TC בנפרד ניתן להבחנה על-ידי DsRed (איור 3). רק האקסונים אשר הציג DsRed ו- SYP-EGFP נבחרו להשגחה. אקסונים TC שכותרתו פלשו הפרוסה קורטיקלית ויצרו סניפים בעיקר בשכב...

דיון

בפרוטוקול הנוכחי הוא גם כלי רב עוצמה כדי ללמוד היבטים התפתחותיים של גידול אקסונים אחר מאשר של ה TC הקרנה¹¹. למשל, שילוב של תרבות פרוסה קורטיקלית, הטכניקה אלקטרופורציה מאפשר להמחיש מורפולוגיה עצב בודדים של נוירונים בקליפת המוח, לטווח ארוך תצפית^9,18.

על-ידי שימוש בפרוטוקול הנוכחי, התפקידים של גנים מעניינים במבנה מסתעף, סינפסה האקסון יכול גם להיות נותחו על ידי שותף ביטוי של חלבונים פלורסנט, הגנים ריבית. בדרך כלל, מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)	Nissui	5905
סרום בקר עוברי (FBS)	Thermo Scientific	SH30396-03	אינסולין היקלון
	סיגמא	I6634
פרוגסטרון	סיגמא	P8783
הידרוקורטיזון	סיגמא& נ.ב.פ;	H0888
נתרן סלניט	Wako Pure תעשיות כימיות	192-10843
טרנספרין	סיגמא	T1147
פוטרסין	Sigma	P5780
גלוקוז	Wako תעשיות כימיות טהורות	16806-25
35 מ"מ פטרי צלחות	פלקון	351008
Millicell-CM להכניס	Millipore	PICMORG50
100 מ"מ פטרי צלחות	BIO-BIK	I-90-20	פטרי צלחת סטרילית
HiPure פלסמיד Maxiprep ערכת	Invitrogen
פיפטות פלסטיק סטריליות חד פעמיות		202-IS	פיפטות העברה סטריליות
נימי זכוכית: OD 1.2 מ"מ	Narishige	קוטר פנימי G-1.2	1.2 מ"מ
חוט כסף: 0.2 ו-1 מ"מ	Nilaco	AG-401265 (קוטר, 0.2 מ"מ), AG-401485 (קוטר, 1.0 מ"מ)מזרק
1 מ"ל	Terumo	SS-01T
סטימולטור	A.M.P.I	מאסטר 8
מבודד דו-פאזי	BAK אלקטרוניקה	BSI-2
nbsp;	A-M Systems	דגם 1800
אוסילוסקופ	היטאצ'י	VC-6723
מניפולטור	Narishige	SM-15
מיקרומניפולטור	Narishige	MO-10
סטריאומיקרוסקופ	מעמד אוניברסלי אולימפוס	SZ40
nbsp;	אור אולימפוס	SZ-STU2
	אולימפוס	LG-PS2, LG-DI, HLL301
	Narishige	PC-10
מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון	ליקוי דיגיטלי C1 לייזר
x20 אובייקט	Nikon	ELWD 20x/0.45
תא תרבות	Tokai Hit	בריטניה A16-U
Sprague-Dawley (SD) חולדה	יפן SLC ומספריים מיקרו-כירורגיים Nihon-Dobutsu
	Natsume	MB-54-1