מאמר שיטה

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

5.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56568

⸱

12 במרץ 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota - Twin Cities, 2Stem Cell Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota - Twin Cities, 4Lillehei Heart Institute, University of Minnesota - Twin Cities, 5Institute for Engineering in Medicine, University of Minnesota - Twin Cities, 6Department of Biology, Jackson State University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.

תקציר

למרות הפלישה 3D מבחני פותחו, האתגר נשאר ללמוד תאים מבלי להשפיע על microenvironment שלהם התקינות. מבחני 3D מסורתיים כגון תא בוידן דורשים כי תאים שנעקרו מהמיקום תרבות המקורי ועבר למעבר לסביבה חדשה. לא רק זה לשבש תהליכים הסלולר הם מהותי microenvironment, אבל לעתים קרובות התוצאה היא איבוד תאים. הבעיות הללו הן מאתגר במיוחד בהתמודדות עם תאים שהם נדירים או רגישים ביותר שלהם microenvironment. כאן, אנו מתארים את התפתחות assay הפלישה תלת-ממד זה מונע שני חששות. זה assay, התאים הם מצופים במרחק קטן. ובכן, מטריקס ECM המכיל chemoattractant מונחת על גבי התאים. זה דורש אין הזחה תא, וזה מאפשר לתאים לפלוש כלפי מעלה לתוך המטריקס. ב הזה assay, הפלישה תא, כמו גם תא מורפולוגיה יכול להידרש בתוך הג'ל קולגן. שימוש assay הזה, נוכל לאפיין את הקיבולת פולשנית של תאים נדיר ורגיש; התאים היברידית הנובע היתוך בין תאים סרטניים בשד MCF7 mesenchymal/multipotent תאי גזע/משתית (MSCs).

מבוא

תא תנועתיות הוא תהליך התפתחותי פיזיולוגי נורמלי של תאים. עם זאת, שינויים התבנית ואת היכולת של תאים נודדים ולאחר לפלוש הקשורים עם מצבים פתולוגיים כולל מחלות דלקתיות, סרטן גרורות1,2,3. גרורות שדפדפן הוא ההיבט ביותר ממעטים להבין סרטן. כדי גרורות, תאים סרטניים חייבים לבזות את המטריצה סלולרית נוספת (ECM), לפלוש את הרקמה המקומית ואת intravasate. פעם אחת בכל מחזור הדם, התאים הסרטניים להפיץ לאתר מרוחק, בורחת ויוצרים גידולים משניים. לכן, היכולת של תאים כדי לבזות את ECM, כדי להעביר, לפלוש קשורה הפוטנציאל גרורתי שלהם. גישות שונות פותחו כדי לנתח ולכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים. הגישות הנפוצה ביותר כוללים את הפצע ריפוי assay, מיקרוסקופיה זמן לשגות ואת וזמינותו קאמרית בוידן. הפצע הריפוי assay4 וזמן לשגות מיקרוסקופ הם מבחני פשוט ונוח שיכול לתת תובנה נדידת תאים ראשוניים. עם זאת, שניהם נמצאים מבחני 2D אשר אינן משקפות את סביבת 3D שבו קיימים תאים ויוו. מחקרים הראו כי התאים מגיבים באופן שונה סביבת 3D לעומת5,אחד62D. יתר על כן, מבחני ריפוי הפצע קשים כדי להתרבות, להניב תוצאות כמותיות-7,-8,-9. וזמינותו תא הדרה, המהווה שינוי תלת-ממדית של הפצע ריפוי assay, וזמינותו רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית אבל זה לא מתאים התאים נמוך במספר כגון תאים היברידית הנובע תא פיוז'ן אירועים10,11 .

וזמינותו קאמרית בוידן הוא assay תלת-ממדי המספק microenvironments הרלוונטי ללימודי הסלולר. עם זאת, זה דורש תאים כדי להסיר את microenvironment המקורי שלהם וכדי לאוגרים התא העליון של מערכת assay בוידן נודדים, לפלוש כלפי מטה לכיוון המדיום המכיל chemoattractant. גישה זו 3D אינו מתאים ולנתח את יכולת העברה ופלישה של תאים לפגיע שלהם microenvironment ו/או מוגבל מספר10,11,12. גישת כדי לנתח נדידת תאים ואת הפלישה הוא microfluidic קאמרית הדרגתיות assay13. למרות מתאים ואמין בלימודי הגירה ופלישה, וזמינותו זה יקר יותר, יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית עבור מעבדה טיפוסי. נתאר כאן וזמינותו פשוטה הפלישה אנכי הפוך זה תואם עם סוגי תאים רבים, כולל תאים רגישים microenvironment שלהם ו/או מוגבלים במספר. Assay הזה היה ממאמרו של הפרוטוקול המוצע על ידי הופר. et al. 14. זה assay, התאים נשארים microenvironment המקורי שלהם, ההגירה שלהם ואת הפלישה מנוטר כפי שהם לנוע כלפי מעלה הג'ל קולגן המכיל של chemoattractant11. זה וזמינותו היא לשחזור, אופטימיזציה, מאומת בצלחת תרבות 35 מ מ. זה יכול להיות מותאם תנאים assay שונים לרבות גדלים התרבות תאים שונים, מטריצות שונות או חוזק הדבקה, chemoattractants שונים. Assay הזה יכול לשמש פלטפורמה במבחנה להקרנה הראשוני בתהליך הגילוי סמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה המתואר מקארדל. et al. 11. ציר זמן מסופק באיור1.

1. הכנת לוח תרבות

  1. לשטוף את המנה 35 מ מ תרבות המכילה זכוכית 10 מ מתחתון עם 1 מ"ל של 1 מ' חומצת מימן כלורי (HCl) למשך 15 דקות להוריד את hydrophobicity של הזכוכית-התחתון.
  2. לשטוף את הצלחת תרבות פעמיים עם 1 מ ל תמיסת מאגר פוספט (PBS) כדי להיפטר כל HCl.
  3. לשטוף את הצלחת תרבות פעמיים עם 1 מ"ל אתנול 70%.
  4. לשטוף לצלחת תרבות עם 1 מ"ל של המדיום התרבות תאים ספציפיים (כאן, α שימוש-בתוספת 10% חום MEM להשבית FBS וחומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%).
    הערה: ניתן לאחסן את הצלחת תרבות שטופלו המכיל המדיום תרבות בחממה2 CO עם מכשיר לחות ב 37 ° C עד למחרת.
  5. לגדול התאים (MSCs ו- MCF-7 תרבות משותפת) בתחתית הכוס שטופלו טוב של המנה תרבות 35 מ מ 100% confluency. שיתוף התרבות תאים MSC 35,000, 75,000 MCF7 תאים עבור 24 שעות.

2. הכנה של הג'ל קולגן

  1. אחסן את העצות micropipette משמש pipetting את הג'ל קולגן במקפיא כדי למנוע את פלמור של הקולגן לאחר יצירת קשר.
    הערה: זהו השלב הקריטי ביותר.
  2. לקבוע אמצעי אחסון של קולגן זנב עכבר כדי לשמש מבוסס על הריכוז של המניה קולגן. היכונו µL 100 של קולגן ג'ל זה וזמינותו.
    הערה: ריכוז גבוה של קולגן זנב העכברוש אני מדמין עובד יותר טוב... קבע את עוצמת הקול של 10 x בינוני ששינה הנשר של Dulbecco כדי לשמש כדי לדלל את הקולגן בהתאם.
  3. לשלב על הקרח עכברוש הזנב קולגן אני (3.8 µg/mL במלאי), ששינה הנשר של Dulbecco x 10 בינוני 1 x תא תרבות בינוני בתוספת 2% סרום שור עוברית, את chemoattractant המתאים כדי ריכוז סופי של קולגן של 2.4 mg/mL.
  4. להוסיף התערובת 4.5% של סודיום ביקרבונט פתרון כדי לנטרל את הג'ל קולגן.
    הערה: הנפח של הפתרון סודיום ביקרבונט הוסיף עשויות להשתנות בהתבסס על רמת ה-pH המדויק של ריאגנטים אחרים. מומלץ לבחון את התערובת עם חומציות להבטיח פתרון נייטרלי, או להשתמש מחוון ה-pH בטווח הבינוני תרבות.
  5. שכבה µL 80 של תערובת קולגן מעל התאים בתוך הזכוכית-התחתון טוב של המנה תרבות.
  6. לאפשר את הג'ל קולגן פולימריזציה למשך 30 דקות ב- חממה2 CO עם מכשיר לחות ב 37 º C.
  7. מכסה את הג'ל קולגן עם 2 מיליליטר תא בינוני עם מופחת סרום (2%), דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO עם מכשיר אדים 24, 48 או 72 h.
    התראה: הצלחת שצריך לנהוג בזהירות כדי למנוע את הג'ל קולגן מתנתקת מהחלק התחתון זכוכית.

3. דוגמה הכנה של קולגן ג'ל באמצעות קולגן זנב העכברוש מלאי של 3.8 µg /mL

  1. על קרח, לשלב 114.5 µL של קולגן זנב החולדה, 16.6 µL של 10 x DMEM, µL 33.1 של תרבות בינוני המכיל את chemoattractant.
  2. לנטרל את התערובת קולגן עם µL 14.0 של סודיום ביקרבונט.
  3. המשך כמו שלב 2.5.

4. הדמיה של תאים

  1. הסר בעדינות את המדיה מתוך קערה.
  2. יש לשטוף בעדינות את הג'ל עם 1 מ"ל ל- PBS.
  3. לתקן את התאים עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde למשך 15 דקות.
  4. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל ל- PBS.
  5. כתם התאים עם פתרון דאפי (100 ng/mL) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי במקומות שונים ולקחת 400 תמונות z-מחסנית מיקרומטר של כל מיקום 16 שלבים מיקרומטר. המיקרוסקופ משמש יש דיסק סריקה יחידה המאפשרת הדמיה קונאפוקלית באמצעות של אור לבן, מקור עירור קשת. השתמש עדשה X 20 מנוצל עם מספרי הצמצם של 0.75.
  7. לשקם תמונות.
    1. לפתוח תמונות עבור ג'ל נתון (כ 25 תמונות) וליצור אוסף תמונות על ידי לחיצה על תמונה ← ערימות ← תמונות לערום. התמונה הראשונה התכתב לתחתית של הג'ל (z = 0 מיקרומטר), התמונה השניה תאמו הצעד הראשון בכיוון z (z = 16 מיקרומטר), בתמונה השלישית התכתב לשלב השני בכיוון z (z = מיקרומטר 32). להעריך כל גרעין בעומק התמונה כל ולייעד את העומק שבו הגרעין היה בפוקוס החדה כמו עומק חדירה לתא מסוים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השתמשנו לצלחת תרבות 35 מ מ עם קולגן הזנב הזכוכית התחתונה ועכבר כדי לפתח, לייעל את פלישה במבחנה 3D assay פרוטוקול. שימוש assay הזאת, הראנו את השד תאים סרטניים MCF7, MSC תאים יכול לפלוש לתוך הג'ל קולגן מרחק ממוצע של 0.04 ± 1.8 מיקרומטר ו 41.3 ± 76.0 מיקרומטר בהתאמה לאחר 48 שעות כאשר IGF1 (18.6 ng/mL) שימש chemoattractant (איור 2). וחשוב מכך, הראינו כי fusion מוצרי מתאי MSC ו MCF7, אשר הם תאים נדיר, יכול לפלוש לתוך הג'ל קולגן וכן... מרחק ממוצע של פלישה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים וזמינותו פשוט הפוך הפלישה אנכי אשר נוח עבור מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאים שהם נדירים ו/או תלויים microenvironment שלהם. זה assay הפלישה תלת-ממד, תאים נשארים microenvironment המקורי שלהם, מכוסים על ידי הג'ל קולגן המכיל של chemoattractant. לאחר מכן, התאים נודדים, לפלוש ב הקולגן. זה assay, התאים יכולים להיות מוכתם, פיקוח בקלות בתוך הג'ל. הפשטות ואת הפארמצבטית של assay זו הופכת כלי נוח ללמוד נדידת תאים סרטן ופלישה במערכת תלת-ממד. עם זאת, chemoattractants חזק נראה להיות נדרש כדי לשבור את הזיקה תא לתחתית של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים הכריזו כי אין עניין מתחרים קיימים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIMHD-G12MD007581) דרך RCMI-המרכז לבריאות הסביבה ג'קסון סטייט, ארה ב. משרד הביטחון, בפרס Idea 11-1-0205.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
MatTek P35G-1.5-10CMatTek Corporation, אשלנד, MAP35G-1.5-10-Cכלי תחתית זכוכית מטק
קולגן זנב עכברוש Iקורנינג, קורנינג, ניו יורק, ארה"ב354236ג'ל קולגן
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO 63178 ארה"בH1758HCl
פוספט חוצץ מלחThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, ארה"ב10010023PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's MediumSigma-Aldrich, סנט לואיס, MO 63178 ארה"בD242910X DMEM
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO 63178 ארה"בS5761NaHCO3
Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוס אמריקה, סנטר ואלי, פנסילבניה, ארה"באולימפוס IX81Confocal  מיקרוסקופ
מוגדר סרוםבקר עובריGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, יוטה, ארה"בSH30070.03FBS
Ti: מיקרוסקופ סריקת לייזר רב-פוטוני ספירPrarie Technologies, סו פולס, SD, ארה"ב40x NA 0.8 אובייקטיביMPLSM
Imaris תוכנהBitplane Inc. ציריך, CHImaris 7.5.2Imaris software
DAPISigma-Aldrich, סנט לואיס, MO 63178, ארה"בD9542DAPI
ParaformaldehydeThermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA50980487PFA
α-מדיום חיוני מינימליSigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USAM0894
MDA-MB-231ATCC; מנסס, וירג'יניה, ארה"בHBT-22
MSCTrivedi and Hematti, 2007
עדשת 20X UPLAPOאולימפוס אמריקה, סנטר ואלי, פנסילבניה, ארה"ב36-064אולימפוס UPLSAPO 20X מטרה

מקורות

  1. Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
  2. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  3. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
  4. Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
  6. Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
  7. Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198(2008).
  8. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
  9. Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
  10. Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
  11. McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
  12. Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
  13. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
  14. Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
  15. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ECM

מאמרים קשורים