מאמר שיטה

דגם העכבר מתמצקים הנוצרות על-ידי Pentylenetetrazole

DOI:

10.3791/56573

⸱

12 ביוני 2018

 , 
1Synaptic Plasticity Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הצתה כימי עם pentylenetetrazole ומספק דגם העכבר של אפילפסיה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפגיעות פרכוס אינדוקציה, פתוגנזה לאחר התקפים אפילפטיים בעכברים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pentylenetetrazole (PTZ) הוא אנטגוניסט קולטן GABA-A. זריקה בקרום הבטן של PTZ לחיה המניע של התקף אקוטי, חמור במינון גבוה, בעוד זריקות רציפים של מנה subconvulsive שימשו לפיתוח כימית מוצתים, מודל אפילפסיה. זריקה אחת במינון נמוך של PTZ גורם התקף קל ללא עווית. עם זאת, חוזרות זריקות במינון נמוך של PTZ להקטין את הסף לעורר התקף עוויתי. לבסוף, במינון נמוך מתמשך, מינהל PTZ גורם של תפיסה clonic חמורה. שיטה זו היא פשוטה, החלים נרחב לחקור הפתופיזיולוגיה של אפילפסיה, אשר מוגדרת כמחלה כרונית המערבת התקפים חוזרים. הכימי מוצתים פרוטוקול גורמת להתקפים חוזרים אצל בעלי חיים. בשיטה זו, הוערך פגיעות בתיווך PTZ התקפים או מידת ההחמרה של התקפים אפילפטיים. יתרונות אלה הובילו השימוש בשיטה זו לסינון סמים אנטי-אפילפטי, גנים הקשורים אפילפסיה. בנוסף, שיטה זו שימש לחקור נזקים עצביים לאחר התקפים אפילפטיים, בגלל השינויים היסטולוגית במוחם של חולי אפילפסיה להופיע גם במוחם של חיות כימית-כיליון. לפיכך, פרוטוקול זה שימושי להפקת בנוחות מודלים חייתיים של אפילפסיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית כרונית זה מאופיין על-ידי התקפים חוזרים ונשנים ומשפיע כ- 1% של אנשים. המנגנונים שבבסיס הדור epileptogenesis ותפיסה בחולי אפילפסיה לא יכול להיות מובהר מלא במחקרים קליניים. לכן, מודל חיה המתאימה נדרש לצורך המחקר של אפילפסיה1.

מגוון רחב של מודלים חייתיים של אפילפסיה שימשו כדי לחקור את הפיזיולוגיה של אפילפסיה וכדי לזהות תרופות אנטי-אפילפטי2,3. בין אלה מודלים, תפיסת תרופתי אינדוקציה הוא שיטה נפוצה המשמשת ליצירת מודל חיה על החקירה של הפתולוגיה של אפילפסיה4. שיטה זו היא פשוטה וזולה. הצתה בתיווך אלקטרודה היא גם שיטה בשימוש נפוץ, אבל העלויות של הליך זה הן גבוהות יותר, השיטה דורשת מיומנויות כירורגית, חשמליים כדי לגרום להתקפים חוזרים5.

אינדוקציה תרופתי יש יתרון גם כי התזמון ואת מספר התקפים נשלטים בקלות. מודלים העכבר גנטי כי התערוכה התקפים ספונטנית משמשים גם במחקר של אפילפסיה. עם זאת, לחזות מתי ובאיזו תכיפות ההתקפים עולות דגמים גנטיים אלה עשוי להיות אפשרי6. מערכת ניטור נדרש כדי לצפות את ההתנהגות אפילפטיים של עכברים מהונדסים6.

חומצה Kainic, פילוקרפין ו- pentylenetetrazole (PTZ) נמצאים בשימוש נרחב כמו גרימת התקף תרופות7. חומצה Kainic הוא אגוניסט עבור רצפטורים גלוטמט, ומפעילה פילוקרפין קולטנים שימוש. PTZ הוא גמא בוטירית (GABA)-אנטגוניסט קולטני8. PTZ מעלימה את הפונקציה של הסינפסות מעכבות, שמוביל פעילות. עצבית מוגברת. תקנה זו גורמת מוכללת ויהיו בעלי חיים9. זריקה אחת של חומצה kainic, פילוקרפין יכול לגרום להתקפים חריפה, במיוחד סטטוס אפילפטיקוס (SE)10,11 ומקדם kainic חומצה או פילוקרפין-בתיווך SE התקפים ספונטנית ולא חוזרים ונשנים כרונית12 , 13. הקלטות electroencephalographic (EEG) וניתוח התנהגות הראו כי התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית שנצפו חודש אחרי12,13זריקה בודדת. זריקה אחת של מנה עוויתית של PTZ גורם גם התקף אקוטי. עם זאת, התקפים ספונטנית כרונית לאחר זריקה אחת של PTZ קשים לקדם. ממשל כרונית של PTZ נדרש כדי לגרום להתקפים חוזרים14. בשיטה אחת, הדור של התקפים חוזרים הוא מסוגל לגרום מחלה דומה יותר לזה של אפילפסיה האנושית מאשר בדור של התקפים חריפה. במקרה של PTZ, כל זריקה מעורר התקף, חומרת ההתקף הופכת קשה יותר בצורה stepwise עם כל זריקה. לבסוף, זריקה אחת של PTZ במינון נמוך גורם של תפיסה clonic חמורה. בשלב זה, כל זריקה מעורר התקפים חמורים. בנוסף, תפיסת השהיה והמשך גם להשתנות לאורך המסלול של הזריקות. ההשהיה לתפיסה טוניק לעתים קרובות הופך קצר יותר בשלב האחרון של בני15. יתר על כן, עוגמת נפש ההתקף מלווה משך התקף ממושך16. חוקרים את המנגנון המולקולרי המסדיר את חומרת ההתקף, השהיה, ומשך שימושית הקרנת סמים אנטי-אפילפטי17,18,19.

התקפים הם בדרך כלל המושרה על ידי ניהול מערכתי יחידה של PTZ, ההחלמה היא מהירה מאוד, במרחק של 30 דקות4,5. לכן, מספר התקפים הוא יותר לשליטה במודל PTZ-הסקה. עם זאת, ניטור EEG ציין כי קוצים מוכללת, ניתן לראות עד 12 שעות לאחר ההתקף בתיווך PTZ20. לכן, בעלי חיים צריכים רצוי להישאר בהשגחה במשך 24 שעות לאחר ההתקף מיוקלונית או טוניק21 לניתוח מדויק יותר של מנגנוני הצתה.

הממשל של תרופות אנטי-אפילפטי, כגון ethosuximide, valproate, פנוברביטל, vigabatrin ו- retigabine3, לפני או אחרי הזרקת PTZ מפחית את הסיכון של העצבים של תפיסת חומרת3,22, 23. באופן דומה, עכברים knockout כי חוסר גנים מעורבים החרפה התקף, כגון מטריקס מטאלו-פרוטאינאז-924, FGF-2225 ו- neuritin26, הוכחו שהפגינו חומרת ההתקף מופחתת לאחר זריקות PTZ מרובים. בנוסף, צופה שינויים histopathological לאחר התקפים אפילפטיים אפשרי בשיטה זו. בחולים עם אפילפסיה, ישנם שינויים היסטולוגית טיפוסי במוח, כגון סיבים מוסי הלבלוב דופאמינרגיים astrogliosis30, גרגר חריג נוירון ההעברה29,27,28 מוות ההיפוקמפוס31,32ולאחר טרשת בהיפוקמפוס33. שינויים דומים הם נצפו בחיות מודל אפילפטיים. בין השיטות הזמינות, בתיווך PTZ הצתה כימי היא שיטה טובה, הדירים זול לייצר במודל חיה של אפילפסיה. במודל בתיווך פילוקרפין SE, תפיסת השליטה קשה, עכברים רבים מתים או לא מצליחים לפתח SE34. לעומת זאת, התמותה, חומרת ההתקף הם יותר לשליטה במודל PTZ. בנוסף, PTZ הוא זול יותר מאשר חומצה kainic, מיומנויות ניתוח מוח העכבר אינם הכרחיים לצורך והתרופות האמריקני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים ניסיוני אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה של טוקיו מטרופוליטן המכון הרפואי למדע. 8 לאחר הלידה - מומלץ בן 16 בשבוע עכברים. כל זן המפגרים מקובל לניסוי. C57BL/6 עכברים הם עמידים יותר בפני PTZ, ואילו עכברים לבקן BALB/c ושווייץ רגישים יותר PTZ. C57BL/6 השתמשו במחקר זה. פגיעות PTZ תלויה גם הגיל של העכבר. בהשוואה לעכברים צעירים, עכברים בוגרים הם יותר דברים מעוותים PTZ35. מספר החיות לשימוש בשיטה זו יכול להשתנות, אבל לפחות 6-10 חיות נדרשים עבור כל תנאי.

1. הכנת PTZ

  1. לפזר 2 מ"ג/מ"ל PTZ סטרילי 0.9% (w/v) NaCl. להכין PTZ ביום של שימוש.

2. הזרקה של PTZ

  1. ביצוע ניסויים כל בין 9:00 ל- 12:00 (בצהריים).
  2. מודדים משקל הגוף של בעל החיים.
  3. מקם את החיה חדר התצפית עבור habituation.
  4. במהלך תקופת habituation (3 דקות), לחשב את עוצמת הקול של פתרון PTZ הזריקה מבוסס על משקל הגוף של בעל החיים והמנה הזרקת נקבע בעבר.
    הערה: לדוגמה, בעת 35 מ"ג/ק"ג PTZ, 0.875 מ"ג PTZ נדרש לעכבר השוקל 25 גרם (35 מ"ג / ק"ג x 0.025 ק ג = 0.875 מ"ג). לכן, צריך להיות מוזרק 437.5 μL של פתרון PTZ 2 מ"ג/מ"ל (0.875 mg/2 מ"ג / מ"ל = 0.4375 מ"ל). המינון הזרקה של PTZ תלוי גנוטיפ העכבר ואת המתח. עבור פראי-סוג עכברים C57BL/6, מנה של 30-35 מ"ג PTZ/ק"ג משקל גוף מומלץ במשפט הראשון. רגישות PTZ תלוי העכבר זן המשמש36,37. הזרקת מינון משתנה על פי מטרת הניסוי.
  5. להזריק PTZ intraperitoneally עם מזרק 1-mL המצורפת מחט 27-מד לתוך המשולש השמאלי או הימני של הבטן של החיה. הימנע הזרקת בקו האמצע.
    1. הימנע זריקות חוזרות במיקום זהה.
  6. לצפות בהתנהגויות בעלי חיים במשך 30 דקות לאחר PTZ המינהל (איור 1 א'), לסווג, ציון התנהגות חריגה כפי שמוצג להלן. במידת האפשר, לשמור על החיות תחת השגחה 24 שעות ביממה, או לפחות h 6-10 נוספים לאחר זריקה, במיוחד לאחר התוצאה חומרת ההתקף מגיע ל- 3 ומעלה.
    1. הערה כל התקפים קלים או שינויים התנהגותיים בבעלי החיים מעבר למשך 30-מין התבוננות. זה ממושך תצפית תקופה רשאי לפנות בעל השפעה חשובה במיוחד ושלמה של מנה subconvulsive של PTZ דור של התקפים התגרות כרונית של אפילפסיה.
    2. בנוסף, מדד משך ההתקף כל התקף שנצפה כשינויים משך ההתקף מתייחסים חומרת ההתקף. יתר על כן, ההשהיה עד ההתקף הראשון אחרי הזריקה PTZ הוא מדד חשוב נוסף כדי לאסוף. פיקוח על בתדירות ההתקפים, ומשך השהיה הוא קריטי עבור מחקר מולקולרי שאחרי שבץ.
  7. להזריק PTZ בכל יום אחר (איור 1 א'). מספר זריקות תלוי מטרת הניסוי. להלן דוגמאות מייצגות.
    1. כדי ליצור חיות לחלוטין הדולקת בפתחי הבתים, ברגע חיה חווה התקף עם ציון של 5 (תפיסה clonic), לסיים את הזריקה בתוך הממשלים שלושה נוספים. במקרה זה, להגדיל את המינון הזרקת אם הציון התקף אינה מגדילה עבור שלושה הממשלים רצופים. כל בעל חיים יכולים לקבל מנה של זריקות PTZ ומספר שונים.
    2. לתקן את המספר ואת המינון של הזרקת PTZ בכל מצב כדי להעריך את הפגיעות כדי PTZ, כולל הערכות של תרופות נגד אפילפסיה, מחקרים של פנוטיפ של עכברים מהונדסים. לתת כל בעלי מספר זהה של זריקות PTZ; סכום כולל של 8 עד 12 זריקות מומלץ. אם חיים מת, הציון התקף צריך להיות מסומן בתור 6.
    3. לקבוע את המינון הזרקה הדרושים לשמור על התקף גבוהה ציון (4 או 5) לזריקות 10 או יותר ללמוד את השינויים histopathological המתרחשות התקפים אפילפטיים. במקרה זה, המספר הכולל הזרקת צריך לנוע בין 25 ל- 30. להקטין את המינון הזרקת אם הציון התקף מגיע ל- 5. אם הציון התקף יורדת ל- 3 או נמוך יותר, להגדיל את המינון הזרקה.

3. תפיסת ניקוד

  1. לצפות את התנהגות בעלי חיים, להקליט את הציונים.
    1. לסווג, ניקוד ההתנהגויות אפילפטי כפי שמוצג להלן38,39 (איור 1B):
      0: התנהגות נורמלית, אין חריגות.
      1: הנייח, שוכב על הבטן.
      2: ראש מיוקלונוס מהנהן, טיפול פנים, forelimb או hindlimb.
      3: רציף לכל הגוף מיוקלונוס, מיוקלונית jerks, הזנב. החזיק מעמד בנוקשות.
      4: התקף לגידול, טוניק, נופל על צידו.
      5: תפיסה clonic, נופל על גבו, פראי ממהר וקפיצה.
      6: מוות.
  2. לשנות את הקריטריונים התנהגותית המבוססת על ראסין ציון40, בהתאם לתנאי הניסוי.

4. תפיסת שלאחר ניתוח

  1. ניתוח Immunohistopathological
    1. קיבוע זלוף
      1. הכנה
        1. להמיס 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) במאגר פוספט 0.1 M (pH 7.4). מחממים את הפתרון עד כ 70 ° C עם התוספת של טיפה של NaOH M 1 (כ 1 µL של NaOH M 1 לפתרון PFA 50 מ ל).
        2. להכין 4 קר כקרח % כדורגלן ו באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
        3. להגדיר את משאבת סחרור, עם צינור, המחט. לרוץ כ 20 מ ל מים דרך צינור כדי לנקות את שאריות. אז, במקום את הקצה הפתוח של הצינור ב- PBS קר כקרח.
      2. Transcardial זלוף והכנה של המוח קבוע
        1. עמוק עזים ומתנגד את העכבר עם 50% אתנול isoflurane/50% בצנצנת קטנה.
        2. לשמור את העכבר במצב פרקדן על ידי הצמדת קצות שלהם forelimbs, hindlimbs.
        3. לחתוך האמצע הגחון של הבטן ולחשוף את הסרעפת.
        4. חותכים את הסרעפת לאורך השוליים costal. לאחר מכן, לחתוך משני צדי הצלעות ועל הגוף. קמצוץ הסרעפת מאת המלקחיים נעילה ו אוורט הצלעות. לשמור על המיקום של הסרעפת על-ידי הצמדתה עם מחט או לצבוט את זה עם מלקחיים. לחשוף את הלב.
        5. הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ולעשות חתך ב אטריום ימין באמצעות מספריים. להיות מודע לא לדחוף את המחט רחוק מדי לתוך הלב, כמו זה יכול לחדור קיר פנימי.
        6. מתחילים זרימה קבועה של PBS קר כקרח דרך המחט לשטוף את הדם (כ 15-20 mL/min).
        7. כאשר הדם נוקתה מן הגוף, להעביר את הצינור פתרון paraformaldehyde 4% (כ- 60 מ"ל) ללא התוספת של בועות. אז תפסיק את זלוף.
        8. לחתוך את אחורי הצוואר ועמוד השדרה, קילוף העור הראש ואת החלק הגבי של הגולגולת עם לנתח מספריים.
        9. לחתוך את העצם premaxillary בין מסלולים העין, להסיר לחלוטין את החלק הגבי של הגולגולת.
        10. ליצור פער בין המוח לבין עצם ג'וגל האנסראג מן הצד האחורי וחותכים את המשולש העצבים ואת הצנטר מתחת המוח. בזהירות מסירים את המוח ואז למקם אותו בקבוקון המכיל 4% מחברים. פוסט-לתקן את המוח ב 4 ° C עבור h 12-16.
    2. המוח פרוסה הכנה
      1. להעביר את המוח קבועה 20% סוכרוז/PBS עד המוח שוקעת לתוך הפתרון כדי לאפשר cryoprotection.
      2. לחתוך את המוח קבוע בהתבסס על פרוסה נדרשת התמצאות החלק הנדרש של המוח.
      3. הגדר את cryomicrotome. להגדיר את הלהב בעמדה ולתחזק את הבמה מיקרוטום בטמפרטורה מתחת-20 ° C.
      4. למקם את המוח חתוכות מראש על הבמה, להרגיע את המוח עם 20% סוכרוז/PBS. הפתרון סוכרוז/PBS יהיה להקפיא בהדרגה, המכסים את המוח על הבמה, עד המוח לגמרי שמוטבע קפוא 20% סוכרוז/PBS.
      5. פורסים את המוח (עובי 30 מיקרומטר) על-ידי הזזת הלהב דרך הרקמות. להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשמור אותם ב 4 º C.
    3. אימונוהיסטוכימיה פלורסנט
      1. לשטוף את הפרוסות הדרושות ב- 0.1% X-100/PBS טריטון (PBST) למשך 10 דקות, 3 פעמים בטמפרטורת החדר (RT).
      2. לחסום את הפרוסות על-ידי המקננת בהם ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% שור אלבומין (BSA) עבור h 1-2-RT.
      3. דגירה הפרוסות ב פתרון נוגדנים עם ריכוז נוגדן ראשוני ב- PBST עם 2% עז סרום או 5% BSA מתאימים עבור לינה 1-7-4 מעלות צלזיוס.
      4. לשטוף את הפרוסות ב- PBST 10 דקות, 3 פעמים. ב RT.
      5. דגירה הפרוסות בפתרון נוגדנים משניים עם הריכוז מתאים של נוגדנים משניים ב- PBST עבור 1-2 h ב- RT, המוגן על-ידי אור.
      6. לטעון את הפרוסות על גבי מדרון זכוכית ולכסות עם הרכבה בינונית עם כיסוי זכוכית.
      7. לבחון את הפרוסות עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ.
  2. מבחן 3 תאיים
    1. הכנה
      1. להכין לפחות 2 2 - בת 6 חודשים 129/Sv עכברים מאותו המין כמו עכברים הנושא להיות "העכבר זר". Habituate כל עכברים בכלוב לפני הניתוח. עבור כל אימון, מקם את העכבר בתוך הכלוב ולהשאיר את העכבר למשך 15 דקות.
      2. לפני כל שלב habituation עם העכבר נושא, לנקות את כל המתקן ואת שני כלובים על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.
      3. מקם את הכלובים ריק בנבכי דו צדדי המנגנון 3-הקאמרית ופתח את הדלתות בין התאים.
      4. Habituate את העכבר נושא, במקום עכבר הנושא בבית הבליעה מרכז ולאפשר את העכבר כדי לנוע בחופשיות ברחבי המנגנון עד העכבר כי נחקרו שני כלובים, בתוספת חיות נושא 5 דק נוספות שעשויות להיות הנוראית של הכלוב אינם לחקור את הכלוב כעשרים דקות ולא צריך לשמש לניתוח זה. חיות כאלה למנוע את הכלוב ובאים רק לעתים רחוקות מספיק לכלוב.
      5. אחרי החיה נעה אל מרכז החדר, סגור את הדלתות ולתת העכבר לנוע בחופשיות בבית הבליעה מרכז במשך 5 דקות. במהלך תקופה זו, לשים אחד מהעכברים 129/Sv בכלוב כדי habituate לכלוב.
    2. ניתוח sociality
      1. לבצע ניתוח זה מיד לאחר תקופת habituation של העכבר נושא.
      2. למקם את הכלוב המכיל עכבר 129/Sv, כינה "זר 1 בכלוב" באחד התאים בצד ומניחים את הכלוב ריק, כינה "אובייקט בכלוב", בחדר בצד השני.
      3. פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.
      4. לאפשר את העכבר נושא כדי לנוע בחופשיות למשך 10 דקות ולהקליט את הפרמטרים הבאים התנהגותית. אם העכבר נושא מפחד העכבר בכלוב 1 זר, כמצוין על-ידי עכבר הימנעות הכלוב זר 1, נותר בפינה של אחד התאים, צריך החיה לא לשמש לניתוח.
        a) הזמן בילה כל תא, תא 1 זר, אובייקט קאמרית ו מרכז קאמרית.
        b) הזמן בילה חוקרים כל הכלוב, הכלוב זר 1 ועל הכלוב אובייקט. (העכבר מסווג כ חוקר את הכלוב אם העכבר מרחרחת או פרא העכבר או כלוב)
        ג) מספר כניסות לתא כל (אופציונלי)
        ד) המרחק הכולל נסע (אופציונלי)
      5. לאחר העכבר זז אל מרכז החדר, סגור את הדלתות
    3. ניתוח החדשנות החברתית
      1. לבצע ניתוח זה מיד לאחר הניתוח sociality.
      2. נגב שני כלובים עם 70% אתנול.
      3. הנח את העכבר 129/Sv אחר באחד הכלובים, כינה את "כלוב זר 2" ואת הכלוב במקום ה 2 זר באחד התאים. הנח את העכבר 1 זר בכלוב השני, הנקרא "בכלוב זר 1" ולמקם את הכלוב זר 1 בחדר השני.
      4. פתח את הדלת, לפקח על אופן הפעולה של מצביע העכבר נושא.
      5. לאפשר את הנושא העכבר כדי להזיז בחופשיות למשך 10 דקות, ומדידת באותם פרמטרים ההתנהגות המתוארת על הניתוח sociality.
        הערה: העכבר זר 1 ו- 2 זר צריך להיבחר באקראי. תא 1 זר אובייקט קאמרית וכן קאמרית זר 1 ואת 2 זר קאמרית צריך להיקבע באופן אקראי.
  3. פחד הקשרי אפליה
    1. מיזוג
      1. לפני כל משפט מיזוג לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.
      2. הכנס עכבר מנגנון מיזוג עם תנאים מסוימים (המנגנון צורה צבע הקיר, חומר הרצפה, ריח, תאורה, עוצמת הקול רעש רקע מראש ייקבע). לדוגמה, המנגנון מיזוג המשמש כאן היה מנגנון מרובע עם פלקסיגלס ברור קירות, רצפה ברשת מתכת, ריח אתנול, בהירות 100 lux ו רעש לבן רקע 65-dB.
      3. להתנות את העכבר על ידי רגל-הלם בתזמון אקראיים מדומים של 0.1-mA זעזועים חשמליים עבור 2 s x 3 פעמים במשך 5 דקות.
      4. להחזיר את העכבר הכלוב הביתה לאחר מיזוג.
    2. הערכת הזיכרון
      1. לפני כל הערכה, לנקות את המנגנון ניסיוני על ידי ניגוב המשטח עם 70% אתנול.
      2. למחרת מיזוג הבאים, להכניס את העכבר בתוך המנגנון אותו כתנאי הלם ומדידת הזמן קפוא במשך 5 דקות.
      3. מאוחר יותר באותו היום, מקם את העכבר מנגנון הרומן ומדידת זמן הקפאה במהלך הערכה 5-מין. מנגנון משולש עם קירות לבנים פלקסיגלס, צלחת קומה, אין ריח, בהירות לאקס 30 רעש לבן 70-dB שימש כאן.
      4. להשוות את הזמן קופא בין התנאי תנאי הרומן. העכברים עם יכולת זיכרון נורמלי יהיה להקפיא יותר באותו מצב מאשר במצב הרומן. הקפאה היא מוגדרת הקיפאון של החיה עבור יותר מ 2 s.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקה חוזרות של PTZ גורם לעלייה בחומרתן התקף. 6 C57BL/6 עכברים שטופלו PTZ, עוד 6 עכברים שטופלו תמיסת מלח כקבוצת בקרה. המינון PTZ היה 35 מ"ג/ק"ג, 10 זריקות נוהלו. הציון התקף גדל בהדרגה עם זריקות PTZ, ואילו ללא התקפים או התנהגויות חריגות ולעוצמת על ידי זריקות מלוחים (איור 2). אנובה ואחריו Bonferroni הבדיקה הראו הבדל משמעותי בין קבוצת שטופלו PTZ לקבוצת שטופלו תמיסת מלח.

פרכוס שחוזרת על עצמה מקדמת aberr...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול נגישים נרחב להקמתה של מודל בעלי חיים תרופתי של אפילפסיה. בתיווך PTZ הצתה כימי היסטוריה ארוכה, הוא מודל שהנוהג המקובל עבור המחקר של פתולוגיה histopathology וסלולר של אפילפסיה41. הדגם הצתה כימי של אפילפסיה נצפה בעבר על-ידי Suzdak ג'נסן, 199542. אינדוקציה פרכוס תרופתי, במיוחד עם PTZ, היא שיטה פשוטה וקלה עבור לעורר התקפים חמורים. שינויים המינון הזרקת לתאם עם חומרת ההתקף. לפיכך, זיהוי את המינון המתאים לאורך כמה מחקרים על-ידי שינוי המינון PTZ, בחינת ההתנה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו חלקית נתמך על ידי מספרים גרנט JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536, ו- 17 K 07086, מספרים גרנט MEXT KAKENHI 25110737, 23110525, AMED גרנט מספר JP18ek0109311, ואת קרן מחקר רפואי SENSHIN את יפן אפילפסיה של קרן המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
PentylenetetrazoleSigma-AldrichP6500
נתרן כלוריMANAC7647-14-5
עכברCLEA יפןC57Bl/6NJcl, לאחר לידה 8 שבועות,
מזרק זכר (1 מ"ל)מחט TerumoSS-01T
(27G x 3/4 אינץ') (0.40 x 19 מ"מ)TerumoNN-2719S
משקלשקילהMettlerPE2000פריט זה הוא מוצר שהופסק. כמעט שווה ערך ל-FX-2000i עם FXi-12-JA מבית A& פלוגה ד'.
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
נתרן הידרוקסידnacalai tesque31511-05
משאבה פריסטטיתATTOSJ1211
סוכרוזnacalai tesque30404-45
MicrotomeYamatoREM-700פריט זה הוא מוצר שהופסק. כמעט שווה ערך ללהב מיקרוטום REM-710
נוצהS35
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'X-100
נוגדן נגד סינפטופוריןמערכות סינפטיות102 002
נוגדנים אנטי-ZnT3מערכות סינפטיות197 002
אנטי-דאבל קורטיןסנטה קרוזSC-8066פריט זה הוא מוצר שהופסק. לא בדקנו מוצר שווה ערך (sc-271390).
מנגנון בדיקת אפליית פחד קונטקסטואליO'hara
מכשיר בדיקה תלת-קאמריתMuromachi

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Löscher, W., Brandt, C. Prevention or Modification of Epileptogenesis after Brain Insults: Experimental Approaches and Translational Research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
  2. Loscher, W. Animal Models of Seizures and Epilepsy: Past, Present, and Future Role for the Discovery of Antiseizure Drugs. Neurochem Res. , (2017).
  3. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  4. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  5. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. Models of Seizures and Epilepsy. , Academic Press. xvii(2006).
  6. Yang, Y., Frankel, W. N. Genetic approaches to studying mouse models of human seizure disorders. Adv Exp Med Biol. 548, 1-11 (2004).
  7. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  8. Squires, R. F., Saederup, E., Crawley, J. N., Skolnick, P., Paul, S. M. Convulsant potencies of tetrazoles are highly correlated with actions on GABA/benzodiazepine/picrotoxin receptor complexes in brain. Life Sci. 35 (14), 1439-1444 (1984).
  9. Tourov, A., et al. Spike morphology in PTZ-induced generalized and cobalt-induced partial experimental epilepsy. Funct Neurol. 11 (5), 237-245 (1996).
  10. Furtado Mde, A., Braga, G. K., Oliveira, J. A., Del Vecchio, F., Garcia-Cairasco, N. Behavioral, morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 43, Suppl 5. 37-39 (2002).
  11. Hosford, D. A. Animal models of nonconvulsive status epilepticus. J Clin Neurophysiol. 16 (4), discussion 353 306-313 (1999).
  12. Medina-Ceja, L., Pardo-Pena, K., Ventura-Mejia, C. Evaluation of behavioral parameters and mortality in a model of temporal lobe epilepsy induced by intracerebroventricular pilocarpine administration. Neuroreport. , (2014).
  13. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  14. Schmidt, J. Changes in seizure susceptibility in rats following chronic administration of pentylenetetrazol. Biomed Biochim Acta. 46 (4), 267-270 (1987).
  15. Angelatou, F., Pagonopoulou, O., Kostopoulos, G. Changes in seizure latency correlate with alterations in A1 adenosine receptor binding during daily repeated pentylentetrazol-induced convulsions in different mouse brain areas. Neuroscience Letters. 132 (2), 203-206 (1991).
  16. Löscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research. 50 (1), 105-123 (2002).
  17. Ilhan, A., Iraz, M., Kamisli, S., Yigitoglu, R. Pentylenetetrazol-induced kindling seizure attenuated by Ginkgo biloba extract (EGb 761) in mice. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 30 (8), 1504-1510 (2006).
  18. Emami, S., Kebriaeezadeh, A., Ahangar, N., Khorasani, R. Imidazolylchromanone oxime ethers as potential anticonvulsant agents: Anticonvulsive evaluation in PTZ-kindling model of epilepsy and SAR study. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (2), 655-659 (2011).
  19. Klitgaard, H. Levetiracetam: The Preclinical Profile of a New Class of Antiepileptic Drugs? Epilepsia. 42, 13-18 (2001).
  20. Kellinghaus, C., et al. Dissociation between in vitro and in vivo epileptogenicity in a rat model of cortical dysplasia. Epileptic Disord. 9 (1), 11-19 (2007).
  21. Koutroumanidou, E., et al. Increased seizure latency and decreased severity of pentylenetetrazol-induced seizures in mice after essential oil administration. Epilepsy Res Treat. 2013, 532657(2013).
  22. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  23. White, H. S. Preclinical development of antiepileptic drugs: past, present, and future directions. Epilepsia. 44, Suppl 7. 2-8 (2003).
  24. Mizoguchi, H., et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to kindled seizure development in pentylenetetrazole-treated mice by converting pro-BDNF to mature BDNF in the hippocampus. J Neurosci. 31 (36), 12963-12971 (2011).
  25. Lee, C. H., Umemori, H. Suppression of epileptogenesis-associated changes in response to seizures in FGF22-deficient mice. Front Cell Neurosci. 7, 43(2013).
  26. Shimada, T., Yoshida, T., Yamagata, K. Neuritin Mediates Activity-Dependent Axonal Branch Formation in Part via FGF Signaling. J Neurosci. 36 (16), 4534-4548 (2016).
  27. Parent, J. M., et al. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hippocampus. J Neurosci. 17 (10), 3727-3738 (1997).
  28. Sutula, T., He, X. X., Cavazos, J., Scott, G. Synaptic reorganization in the hippocampus induced by abnormal functional activity. Science. 239 (4844), 1147-1150 (1988).
  29. Parent, J. M., Elliott, R. C., Pleasure, S. J., Barbaro, N. M., Lowenstein, D. H. Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy. Ann Neurol. 59 (1), 81-91 (2006).
  30. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  31. Arzimanoglou, A., et al. Epilepsy and neuroprotection: an illustrated review. Epileptic Disord. 4 (3), 173-182 (2002).
  32. Represa, A., Niquet, J., Pollard, H., Ben-Ari, Y. Cell death, gliosis, and synaptic remodeling in the hippocampus of epileptic rats. Journal of Neurobiology. 26 (3), 413-425 (1995).
  33. Blumcke, I. Neuropathology of focal epilepsies: a critical review. Epilepsy Behav. 15 (1), 34-39 (2009).
  34. Buckmaster, P. S., Haney, M. M. Factors affecting outcomes of pilocarpine treatment in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 102 (3), 153-159 (2012).
  35. Nokubo, M., et al. Age-dependent increase in the threshold for pentylenetetrazole induced maximal seizure in mice. Life Sci. 38 (22), 1999-2007 (1986).
  36. Ferraro, T. N., et al. Mapping Loci for Pentylenetetrazol-Induced Seizure Susceptibility in Mice. The Journal of Neuroscience. 19 (16), 6733-6739 (1999).
  37. Kosobud, A. E., Cross, S. J., Crabbe, J. C. Neural sensitivity to pentylenetetrazol convulsions in inbred and selectively bred mice. Brain Res. 592 (1-2), 122-128 (1992).
  38. Shimada, T., Takemiya, T., Sugiura, H., Yamagata, K. Role of Inflammatory Mediators in the Pathogenesis of Epilepsy. Mediators of Inflammation. 2014, 1-8 (2014).
  39. Itoh, K., et al. Magnetic resonance and biochemical studies during pentylenetetrazole-kindling development: the relationship between nitric oxide, neuronal nitric oxide synthase and seizures. Neuroscience. 129 (3), 757-766 (2004).
  40. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  41. Bialer, M., White, H. S. Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nat Rev Drug Discov. 9 (1), 68-82 (2010).
  42. Suzdak, P. D., Jansen, J. A. A review of the preclinical pharmacology of tiagabine: a potent and selective anticonvulsant GABA uptake inhibitor. Epilepsia. 36 (6), 612-626 (1995).
  43. Seyfried, T. N., Glaser, G. H. A review of mouse mutants as genetic models of epilepsy. Epilepsia. 26 (2), 143-150 (1985).
  44. Upton, N., Stratton, S. Recent developments from genetic mouse models of seizures. Current Opinion in Pharmacology. 3 (1), 19-26 (2003).
  45. Rao, M. S., Hattiangady, B., Reddy, D. S., Shetty, A. K. Hippocampal neurodegeneration, spontaneous seizures, and mossy fiber sprouting in the F344 rat model of temporal lobe epilepsy. J Neurosci Res. 83 (6), 1088-1105 (2006).
  46. Hellier, J. L., Patrylo, P. R., Buckmaster, P. S., Dudek, F. E. Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 31 (1), 73-84 (1998).
  47. Turski, L., et al. Seizures produced by pilocarpine: neuropathological sequelae and activity of glutamate decarboxylase in the rat forebrain. Brain Res. 398 (1), 37-48 (1986).
  48. Itoh, K., Watanabe, M. Paradoxical facilitation of pentylenetetrazole-induced convulsion susceptibility in mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Neuroscience. 159 (2), 735-743 (2009).
  49. Deng, Y., Wang, M., Wang, W., Ma, C., He, N. Comparison and Effects of Acute Lamotrigine Treatment on Extracellular Excitatory Amino Acids in the Hippocampus of PTZ-Kindled Epileptic and PTZ-Induced Status Epilepticus Rats. Neurochemical Research. 38 (3), 504-511 (2013).
  50. Kupferberg, H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsia. 42, Suppl 4. 7-12 (2001).
  51. Berg, A. T., Plioplys, S. Epilepsy and autism: is there a special relationship? Epilepsy Behav. 23 (3), 193-198 (2012).
  52. Robinson, S. J. Childhood epilepsy and autism spectrum disorders: psychiatric problems, phenotypic expression, and anticonvulsants. Neuropsychol Rev. 22 (3), 271-279 (2012).
  53. Tuchman, R. Autism and Cognition Within Epilepsy: Social Matters. Epilepsy Curr. 15 (4), 202-205 (2015).
  54. Takechi, K., Suemaru, K., Kiyoi, T., Tanaka, A., Araki, H. The alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptor modulates autism-like behavioral and motor abnormalities in pentylenetetrazol-kindled mice. Eur J Pharmacol. 775, 57-66 (2016).
  55. Abdel-Zaher, A. O., Farghaly, H. S. M., Farrag, M. M. Y., Abdel-Rahman, M. S., Abdel-Wahab, B. A. A potential mechanism for the ameliorative effect of thymoquinone on pentylenetetrazole-induced kindling and cognitive impairments in mice. Biomed Pharmacother. 88, 553-561 (2017).
  56. Jia, F., et al. Effects of histamine H(3) antagonists and donepezil on learning and mnemonic deficits induced by pentylenetetrazol kindling in weanling mice. Neuropharmacology. 50 (3), 404-411 (2006).
  57. Pahuja, M., Mehla, J., Reeta, K. H., Tripathi, M., Gupta, Y. K. Effect of Anacyclus pyrethrum on pentylenetetrazole-induced kindling, spatial memory, oxidative stress and rho-kinase II expression in mice. Neurochem Res. 38 (3), 547-556 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Pentylenetetrazole KindlingPTZ

מאמרים קשורים