מאמר שיטה

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

DOI:

10.3791/56583

⸱

11 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהו פרוטוקול זמן cost effective במבחנה חוקרים על מנגנוני ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, ובגלל זה צורך רפואי קליניות מאוד בניהול סרטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשרים השנים האחרונות ראינו משמרת של תרופות ציטוטוקסיות לטיפול ממוקד לאונקולוגיה רפואית. למרות יישוב סוכני טיפולית הראו יעילות קלינית מרשים יותר תופעות לוואי ממוזער טיפולים מסורתיים, תרופתיים הפך המגבלה העיקרית היתרונות שלהם. מספר מודלים פרה/במבחנה/ויוו של ההתנגדות רכשה סוכני ממוקד בטיפול קליני פותחו בעיקר באמצעות שתי אסטרטגיות: מניפולציה גנטית i) להכנת דגמים אחרים של ההתנגדות רכשה, ii) במבחנה / אין ויוו מבחר דגמים עמיד. בשנת העבודה הנוכחית, אנו מציעים מסגרת המאחד, על חקירת המנגנון הבסיסי אחראי על ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של להשתיק הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא. פשוט הזמן cost effective בגישה זו הוא החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית יישוב בגידול שונים histotypes.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עוקב אחרי התגליות מכריע בביולוגיה מולקולרית, תאית, מספר מולקולות נגד סרטן מסונתז הרומן פותחו באופן סלקטיבי היעד oncogenic איתות המסלולים במגוון רחב של סוגי גידולים. בפרט, שתי קטגוריות של יישוב סוכני טיפולית עם מאפיינים ייחודיים באונקולוגיה, תרכובות כימיות כלומר סינתטי של נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטי, ידועים השיגו הצלחות קליני וטיפול בסרטן שינו באופן דרמטי העשורים האחרונים1,2,3.

ובכל זאת, למרות התגובה הראשונית שלהם מרשים לטיפול, הרוב המכריע של חולי סרטן פיתחו עמידות לתרופות לכל הסוכנים טיפולית יישוב, נוגדנים חד-שבטיים והן מעכבי קינאז. כתוצאה מכך, תרופתיים, המשוכה העיקריים תרופות נגד סרטן קלאסי4, הוא עדיין אתגר גדול עבור טיפולים ממוקדים המתעוררים5,6.

עמידות לטיפול ממוקד עשוי להיות מהותי (קרי, ראשי) או רכשה (קרי, משני). התנגדות פנימית מתאר דה נובו חוסר תגובה לטיפול, בעוד התנגדות משני מתרחשת לאחר תקופת בתגובה סמים טיפול7. האחרון הוא הנגרמת על ידי התפרצויות של גדודים קטן של תאים סרטניים בתוך עיקר הגידול פרימיטיבי או בנויים דיסטלי נישות אנטומי נסתר, מפגין עד 90% עמידות לתרופה אחת או יותר ממוקד סוכני טיפולית. המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח עמידות לטיפול ממוקד בעיקר תוצאה של מוטציות היעד והפעלה מיותר של אחרים פרו-הישרדות איתות המסלולים, ההבנה של מי הוא עדיין רחוק מלהיות שלם8.

בעבודה זאת, הצענו זמן cost effective בגישה לחקור מנגנונים במבחנה של ההתנגדות רכשה סוכני טיפולית ממוקד, החל מהדור של subclones הסלולר עמידים לתרופות על תיאור של שתיקת הליכים המשמשים עבור שחזור הרגישות לחומר המדכא, כלי חיוני המשמש עבור בדיקה ואימות של בהנחות עבודה. בפרט, הגישה שלנו שימש לחקור, סרטן קיבה, מנגנוני ההתנגדות הרצפטין (למשל, הרצפטין), מואנשים חד-שבטיים מיקוד המחשבים חוץ-תאי של החלבון HER29. הרצפטין + כימותרפיה מקובל כטיפול רגיל קו ראשון לסרטן שד גרורתי HER2 חיובי. בזכות מחקרים פרה מציג את האנטי-HER2 טיפולים יש פעילות משמעותית בשני במבחנה , ויוו HER2 חיובי סרטן קיבה מודלים10,11, היה מולקולרית שהתרופות המתוות HER2 בחן בהרחבה בניסויים קליניים, חלקם עדיין בעיצומה, על חולים עם גסטרו סרטן12,13,14,15.

מחקרים אלה הדגישו את המספר העולה מהמטופלים חווים התנגדות הרצפטין16, בדומה אל תצפית על מעכבי טיפולית יישוב אחרים. בפרט, קצב התגובה של הרצפטין היה 47%, חציון ההישרדות הכוללת של חולים על הרצפטין + כימותרפיה היה ארוך יותר לחולים על כימותרפיה לבד172.7 חודשים בלבד. זה הציע כי בעוד הרצפטין העיקרי ההתנגדות היא שכיחה, הרצפטין משני ההתנגדות היא בלתי נמנעת. מסיבה זו, יש צורך דחוף כדי להבהיר את מנגנוני גרימת טיפול ממוקד-HER2 עמידות סרטן קיבה, אשר הוא בעייתי עוד יותר בהתחשב הטרוגניות גנטית אינטרה-tumoral את זה neoplasia18.

בנוסף, מנגנוני עמידות הרצפטין בסרטן קיבה הוכיחו מאתגר להסביר, חלקית עקב הקושי בהשגת במודלים פרה אמין נציג של מצב זה. אושימה. et al. דיווח על שיטת הבחירה ויוו של שורות תאים עמידים הרצפטין סרטן קיבה, המורכב תרבות חוזרות ונשנות של גרורות קטנות הצפק שיורית לאחר הטיפול עם הרצפטין19. עם זאת, הצורך של זיווד, ההתמחות לטיפול בבעלי חיים ספציפיים ועל האישור של ועדת האתיקה חיה תרמו הפיכתה לפעולת לצרוך זמן עלות. הגישה שנתאר בעבודה זו פשוט וקל החלים נרחב, אפשרות להאריך בקלות לחקור את מנגנוני ההתנגדות לסמים אחרים טיפולית גידול שונים histotypes20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה במיוחד הותאם לניתוח של המנגנונים ההתנגדות רכשה הרצפטין של שורות תאים של סרטן קיבה וורויקשייר-חיוביות. כל מכשירי מעבדה הצורך מדווחים בטבלה של חומרים.

1. דור של Subclones עמידים לטיפול ממוקד

הערה: זה הכי קריטי, קשה לתקנן את שלב בפרוטוקול בשל העובדה כי שורות תאים שונים עשוי להפגין רגישויות שונות לחומר המדכא טיפולית יישוב עצמאי של התרכזות histotype או התרופה שלהם הגידול בשימוש.

  1. תרבות NCI-N87 תא קו בינוני RPMI בתוספת סרום עגל עוברית (10%) וגלוטמין (2 מ מ, 1%), כמו טפט ב 37 מעלות צלזיוס, זרע זה על 25 ס מ2 תרבות מבחנות.
  2. הוסף למדיום תרבות ב כל הבקבוק 10 µg/mL של הרצפטין המינון ההתחלתי. חושפים את התאים המינון ההתחלתי עד שהם לחדש גדל.
    הערה: המינון ההתחלתי של החומר המדכא טיפול ממוקד צריך להיות 10-fold נמוך יותר ריכוז שיא פלזמה שלה. ריכוז שיא פלזמה היא הרמה הגבוהה ביותר של ריכוז התרופה זוהה דם החולה בדרך כלל בעקבות מספר מינונים של טיפול סטנדרטי. ערך זה ניתן יהיה לאחזר ממחקרים על פרמקוקינטיקה.
  3. לעקוב אחר גדילת תאים עם השיטה הדרה trypan blue; כאשר יתחדש צמיחת תאים (בדרך כלל לאחר תקופה של שבועיים עד שלושה שבועות), חושפים את התאים 10-fold ריכוז מינון גבוה יותר של הרצפטין.
  4. לחשוף לתאים מנה בהדרגה גדל והולך של הרצפטין (מתוך 100 µg/mL כדי µg 400/mL) עד לשמור תאים הגדלים (לאחר כשבועיים) למרות נוכחותם של ריכוז סמים גבוהה (לפחות 2.5 - 4-fold גבוה יותר מאשר הפסגה פלזמה).
  5. ביצוע וזמינותו של clonogenic כדי להעריך את רמת ההתנגדות לטיפול ממוקד-כל שינוי של הריכוז של החומר המדכא טיפול המטרה בטווח הבינוני תרבות, ולהגדיר עמידות יחסית IC50 אינדקס (RR IC50) כדלקמן.
    1. זרע 500 תאים 24 צלחות תרבות רב טוב.
      הערה: בארות 5 צריך להיות מוכן לכל ערכת תנאים.
    2. לחשוף תאים הגדלת יעד טיפול מעכב (הרצפטין) ריכוזים של µg/mL 100 עד 400 µg/mL.
    3. דגירה בתאים חממה2 CO ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים.
    4. לאחר דגירה, לתקן, כתם דגימות כדלקמן.
      1. להסיר תאים בינונית ולאחר מכן לשטוף עם PBS 1 x 10 מ"ל. 1 x PBS להסיר ולהוסיף 2-3 מ"ל של פתרון קיבעון (חומצה אצטית: מתנול, 1:7, (כרך/כרך)). להסיר את הפתרון קיבוע ולהוסיף הפתרון קריסטל ויולט 0.5%. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים
      2. להסיר את הפתרון קריסטל ויולט בקפידה על-ידי כ רפה בעברית עם פיפטה ומשקיעים לוחות במי ברז לשטיפה מכל משקעים הפתרון קריסטל ויולט. מילה נהדרת בטמפרטורת החדר עד 2 ימים.
    5. לספור מושבות של יותר מ- 50 תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (4 X הגדלה).
      הערה: שני משקיפים עצמאיים נדרשים עבור זה.
    6. לחשב RR IC50 כיחס בין ערך50 IC תאי היעד-טיפול עמידים subclone, הערך של התאים המקורי/נאיבי.

2. אימות פרוטוקול עבור המועמד ממוקד בטיפול ההתנגדות ג'ין (R-גן)

הערה: לאחר אפיון גנים, חתימות המשויך ההתנגדות רכשה יעד טיפול וג'ין כל מועמד כמו נהג של התנגדות ייחקר באמצעות: א) RT-PCR, ומערבי ב) כתם ניתוח.

  1. בזמן אמת RT-PCR
    1. לחלץ RNA הכולל שורות תאים באמצעות תערובת thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium (ראה טבלה של חומרים).
    2. לבצע תגובות שעתוק במהופך (RT) באמצעות תחל hexamer אקראיים ולהגדיר הצנטרפוגה תרמי כדלקמן: הטרמה 25 ° c במשך 5 דקות, RT ב 46 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ו- RT איון ב 95 ° C עבור 1 דקות.
    3. שימוש 400 ננוגרם של RNA הכולל עבור ריאקציה 20 µL. להכין לתערובת תגובה עבור מדגם כדלקמן: 7 µL RNase חינם H2א, 2 µL cדנ א (10 ng/µL), µL 1 20 x התווית על-ידי פלורסנט בדיקה במטרה ולאחר 10 µL 2 x Mix המכילה מאגר dNTPs, ה-DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים).
    4. להוסיף 20 µL של תערובת התגובה כל צלחת היטב ולהפעיל את התוכנית הבאה: מחזיקים את הבמה ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (מחזור 1); אז 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s ו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.
  2. תספיג חלבון
    1. לשחזר המתלים תא על-ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA פתרון ומאפשר 2-3 דקות עבור טריפסין לעבודה.
    2. להוסיף 2 כרכים בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום כדי לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין) ואת צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דק להשליך supernatant ותאי תשטוף עם PBS קר 1 x.
    3. תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 1,200 עבור 5 דקות וזורקים. Resuspend בגדר תא עם פירוק מאגר, דגירה על כיסא נדנדה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      1. הכמות של פירוק מאגר תלויה מספר התאים (למשל, µL 100 עבור 1 x 106 תאים); הקפד להכין מאגר פירוק טריים בכל פעם. עבור 1 מ"ל של פירוק מאגר הכנה (להשאיר על קרח): שימוש 975 µL M-לכל מאגר lysate בתרבית של מעכבי פרוטאז, פוספטאז µL 15, 10 µL 100 מיקרומטר PMSF מעכבי.
    4. לשחזר את החלבון supernatant על ידי צנטריפוגה lysate תא ב g x 13,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. לקבוע ריכוז חלבון באמצעות שיטת של BCA.
    6. להוסיף 4 x LaemmLi מדגם מאגר דגימות חלבון (לפחות 20-30 µg של חלבון) וחום ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    7. השתמש precast 4-20% ג'ל וטען µg 20-30 של פתרון חלבון LaemmLi ו- 5-10 µL של חלבון סטנדרטית עבור דגימה.
    8. למלא את הטבעת תספיג טריס/GLICYNE /SDS 1 x מאגר ולהפעיל ג'ל-110 V למשך 30-60 דקות (עצירת הזמן בדוק כי לצבוע הגיע לסוף של הג'ל, אחרת להפעיל לכמה דקות נוספות)
    9. Electroblot להעביר את החלבון לתוך קרום PVDF (ראה טבלה של חומרים) באמצעות מערכת חצי יבש.
    10. לחסום את הקרום על-ידי לספוג את הפתרון המתאים חלבון (חלב/BSA 5%) על ניעור בטמפרטורת החדר מאובטח.
    11. להפוך את פתרון 1:400 עם נוגדן anti-IQGAP1 העיקרי בפתרון חלב 5% (ראה טבלה של חומרים).
    12. מקם את הקרום פתרון נוגדן ראשוני על מטרף בחדר קר בן לילה.
    13. למחרת, לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS (1 x T-TBS: 1 x טריס מלוחים מאגר שנוספו על-ידי Tween20 0.1%) על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
    14. להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.
    15. להפוך את פתרון העכבר המשני-נוגדן 1:10,000 על-ידי הוספת נוגדן המערבי הסטנדרטי כתם זיהוי (ראה טבלה של חומרים) ומניחים את הקרום על מטרף; יוצאים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
    16. לבטל את הפתרון נוגדן ומשרים בפתרון 1 x T-TBS על מטרף בטמפרטורת החדר במשך 7 דקות.
    17. להתעלם T-TBS 1 x והחלפה של פתרון. חזור על 3 פעמים.
    18. להשרות קרום עבור 5 דקות פתרון chemiluminescent ולאחר תמונה הקרום על imager chemiluminescence.

3. שחזור רגישות מעכב היעד-טיפול על ידי המועמד R-גן דפיקה למטה

  1. הכנה תא
    1. הכן תא בודד השעיה על ידי trypsinization. לבצע תרביות תאים ביום בו התאים אינם מצופים.
      1. לשטוף NCI-N87 תאים עם PBS, דגירה ב 37 ° C עם פתרון טריפסין/EDTA 0.05% 5-10 דקות להוסיף 2 נפח של RPMI בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום לנטרל טריפסין (למשל, 2 מ ל בינונית עבור כל 1 מ"ל של טריפסין).
      2. ספירת תאים hemocytometer באמצעות צביעת trypan blue. זרע 2.5 10x5 תאים (60% הנהרות) לתוך בקבוקון2 ס מ T25 עבור כל תנאי.
        הערה: מספר מתאים של תאים עבור זריעה נקבעת לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי וכן את משך הזמן של הניסוי. המטרה היא להשיג את היעד גן דפיקה למטה משך כל זמן הניסוי. תשעה T25 ס מ2 מבחנות הינם אידיאליים עבור תנאים תקנים ואת וזמינותו clonogenic (3 מבחנות עבור פקדים, 3 מבחנות עבור פקדים שלילי תרביות תאים, 3 מבחנות עבור ג'ין-יעד תרביות תאים).
  2. תרביות תאים הפוכה
    1. הכן ג'ין-מטרה ושלילי שליטה מיקס תרביות תאים עבור כל הבקבוק2 ס מ T25 כדלקמן.
      1. לדלל µL 12.5 כל פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA או שליטה שלילי oligonucleotides siRNA במדיום תרביות תאים חיוניים מינימלי (יחס 1:55; ראה טבלה של חומרים).
      2. הוספת ריאגנט תרביות תאים ליפוזום cationic (יחס 1:1 עם פילוח ג'ין oligonucleotides siRNA; ראה טבלה של חומרים). דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
        הערה: הנפח הכולל של המיקס תרביות תאים הוא 700 µL.
      3. להוסיף 700 µL של תרביות תאים לערבב את הבקבוק2 ס מ לכל T25. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-3 ימים.
    2. ודא ג'ין דפיקה למטה על-ידי ה-RT-PCR וניתוח תספיג חלבון. בדוק היטב את השפעת בשם R-גן הדפיקה למטה על שחזור רגישות לסוכן טיפולי ממוקד באמצעות ניסויים היווצרות המושבה (חזור על שלב 1.5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מתווה במסגרת ההליך ניסיוני. שלושה סרטן קיבה-שורות תאים המבטאים רמה גבוהה של HER2, רגישות הרצפטין (IC50 < שיא רמת הפלסמה של התרופה, 2A איור, גרף השמאלי) גדלו במדיום תרבות המכיל את הסוכן טיפולית יישוב. מנה 10-fold נמוכים מריכוז הפלסמה שיא של הרצפטין (10 µg/mL) היה לקבוע את המינון ההתחלתי, בהדרגה ל 400 µg/mL על פני תקופה של 8-12 חודשים. לאחר מכן, השגנו שלוש subclones מאופיין הפנוטיפ ההתנגדות יציב עם IC50

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד אישית ממוקדת טיפולים יש elicited ההתלהבות גוברת, אלה טיפולים "חכם" כביכול עם הפנים את המשוכה הגדולות באותה תרופות כימותרפיות המסורתי, כלומר, רכישת תרופתיים מהירה ובלתי צפויים. כדי לשפר את התוצאות של טיפול ממוקד, צריך יהיה לפתור בעיות תרופתיים דרך הבנה טובה יותר של המנגנונים שגורמים להם. כאן, הצגנו מתודולוגיה נגישים נרחב במבחנה כדי לחקור את מנגנוני ההתנגדות רכשה לסמים טיפול ממוקד במודלים קו תאי סרטן.

הדור של יישוב subclones עמידים לטיפול הוא הכי קריטי, קשה לתקנן בשלב של פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות ד ר ורוניקה זאנוני לעריכת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Trizol ReagentInvitrogen15596026TRIzol Reagent הוא ריאגנט לבידוד RNA כולל באיכות גבוהה או בו זמנית לבידוד RNA, DNA וחלבון ממגוון דגימות ביולוגיות
ערכת סינתזה ISCRIPT CDNABio-Rad1708891ערכת סינתזת cDNA iScript היא ערכת סינתזת cDNA רגישה וקלה לשימוש לניתוח ביטוי גנים באמצעות qPCR בזמן אמת.
בדיקת ביטוי גנים של TaqManLife Technologies4331182Applied Biosystems מבחני ביטוי גנים של TaqMan מורכבים מזוג פריימרים PCR ללא תווית ובדיקה של TaqMan עם תווית צבע FAM או VIC של Applied Biosystems בקצה 5' וקלסר חריץ מינורי (MGB) ומרווה לא פלואורסצנטי (NFQ) בקצה 3'.
מגיב מיצוי חלבון יונקים M-PERThermo Scientific78501Thermo Scientific M-PER מגיב מיצוי חלבון יונקים נועד לספק מיצוי חלבון מסיס כולל יעיל ביותר מתאי יונקים מתורבתים.
קוקטייל מעכב עצירת פרוטאז ופוספטאז (100X)Thermo Scientific78440קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז תרמו סיינטיפיק (100X) מספק את הנוחות של פתרון יחיד עם הגנה מלאה על דגימות חלבון עבור ליזטים של תאים ורקמות.
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCAThermo Scientific23225ערכת בדיקת החלבון Thermo Scientific Pierce BCA היא ריאגנט בדיקה דו-רכיבי, דיוק גבוה ותואם לחומרי ניקוי שנקבע למדידת ריכוז החלבון הכולל (A562nm) בהשוואה לתקן חלבון.
4x Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747השתמש ב-4x Laemmli Sample Buffer להכנת דגימות עבור SDS PAGE. להפחתת דגימות, הוסף חומר הפחתה כגון 2-מרקפטואתנול למאגר לפני הערבוב עם הדגימה.
4– 20% ג'ל חלבון טרומי Mini-PROTEAN TGXBio-Rad456-1094ג'ל TGX (Tris-Glycine eXtended) בעל אורך חיים ארוך יש נוסחה חדשה וניתן להשתמש בהם הן להפרדות חלבון דנטורציה סטנדרטיות והן לאלקטרופורזה טבעית.
תקני Precision Plus Protein WesternC Blotting StandardsBio-Rad1610376Precision Plus Protein Prestained זמינים בפורמטים Dual Color, All Blue, Kaleidoscope ו-Dual Xtra. לכל הארבעה יש את אותם דפוסי נדידת ג'ל, עם 3 רצועות ייחוס בעוצמה גבוהה (25, 50 ו-75 kD).
10x Tris/Glycine/SDSBio-Rad161073210x Tris/glycine/SDS הוא חוצץ רץ מעורבב מראש להפרדת דגימות חלבון על ידי SDS-PAGE.
חבילות העברה של Trans-Blot Turbo Mini PVDF חבילות העברהשל Bio-Rad1704156Trans-Blot Turbo Mini PVDF להעברה מהירה ויעילה של חלבונים ממיני ג'לים באמצעות מערכת Trans-Blot Turbo Transfer System. כל חבילת העברה אטומה בוואקום ומוכנה לשימוש מכילה שתי ערימות מאגר יונים רוויות חוצץ וממברנת PVDF רטובה מראש.
חלבון מדויק StrepTactin-HRP מצומדBio-Rad1610381StrepTactin-חזרת פרוקסידאז (HRP) מצומד לזיהוי כימילומינסנט או קולורימטרי של תקני חלבון לא מוכתמים של Precision Plus Protein או Precision Plus Protein WesternC Standards על כתמים מערביים.
תמיסת Immun-Star WesternCBio-Rad5572Immun-Star WesternC, שיטה לזיהוי חלבונים, מזהה כמויות חלבון באמצע הפמטוגרמה.
ל-Invitrogen12935300בקרה שלילית בקרהשלילית אין דמיון משמעותי ברצף לרצפי גנים של עכבר, חולדה או אדם. הבקרה נבדקה גם במסכים מבוססי תאים והוכחה כחסרת השפעה משמעותית על התפשטות התאים, כדאיות או מורפולוגיה.
opti-MEM Glutamax MediumThermo Fisher Scientific51985026Opti-MEM Medium הוא מדיום חיוני מינימלי (MEM) משופר המאפשר הפחתה של תוספי סרום בקר עוברי ב-50% לפחות ללא שינוי בקצב הגדילה או במורפולוגיה.
משתיק קול בחר מעוצב מראש & הפרעות 4390824 RNA (RNAi) מאומתות של siRNAAmbion(RNAi) היא הדרך הטובה ביותר להפיל ביעילות את ביטוי הגנים כדי לחקור את תפקוד החלבון במגוון רחב של סוגי תאים.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentInvitrogen13778075Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent מציע פתרון מתקדם ויעיל להעברת siRNA. אף מגיב טרנספקציה ספציפי אחר ל-siRNA אינו מספק אספקת siRNA קלה ויעילה כל כך במגוון רחב של קווי תאים, כולל סוגי תאים נפוצים, תאי גזע ותאים ראשוניים, כמו גם סוגי תאים קשים להעברה באופן מסורתי.
עכבר anti-IQGAP1Invitrigen33-8900ריכוז עבודה: 1:400 בתמיסת חלב 5%
עיזים נגד עכבר IgG-HRP: sc-2005Santa Cruzsc-2005ריכוז עבודה: 1:10000 בתמיסת חלב 5%
PMSFSigma AldrichP 7626זהו מעכב של פרוטאזות סרין ואצטילכולין אסטראז
תרמו-ציקלר למחקר RT-PCRMJ מחקרMJ PTC-200 Thermal Cyclerהוא מאפשר הומוגניות טמפרטורה ומהירות הגברה של עד 3° ג/שנייה ניתן לבצע את הפרוטוקול גם עם מחזורים תרמיים אחרים
מכשיר RT-PCR בזמן אמתמערכת Applied Biosystems7500 RT-PCR זוהיפלטפורמה בעלת חמישה צבעים המשתמשת בריאגנטים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי פלואורסצנציה כדי לספק כימות יחסי באמצעות סוג בדיקה השוואתי CT. ניתן לבצע את הפרוטוקול גם עם מחזורים תרמיים אחרים
ספקטרופוטומטרים Microvolume ThermoScientificNanodropהוא מספק מדידת גרעין חומצה מדויקת ומהירה תוך שימוש בנפח קטן של מערכת ספיגת הדגימה
Bio-RadTrans-Blot Turbo מערכת הואמבצע העברה יבשה תוך מספר דקות
מערכת רכישת תמונה ותיעוד ג'לBio-RadChemidoc מערכתקל לשימוש לזיהוי כימילומינסנט
ל-siRNA תמונת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerber, D. E. Targeted therapies: a new generation of cancer treatments. Am Fam Physician. 77 (3), 311-319 (2008).
  2. Zhang, J., Yang, P. L., Gray, N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer. 9 (1), 28-39 (2009).
  3. Nelson, A. L., Dhimolea, E., Reichert, J. M. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 767-774 (2010).
  4. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  5. Gilbert, L. A., Hemann, M. T. Chemotherapeutic resistance: surviving stressful situations. Cancer Res. 71 (15), 5062-5066 (2011).
  6. Izar, B., Rotow, J., Gainor, J., Clark, J., Chabner, B. Pharmacokinetics, clinical indications, and resistance mechanisms in molecular targeted therapies in cancer. Pharmacol Rev. 65, 1351-1395 (2013).
  7. Ellis, L. M., Hicklin, D. J. Resistance to Targeted Therapies: Refining Anticancer Therapy in the Era of Molecular Oncology. Clin Cancer Res. 15 (24), 7471-7478 (2009).
  8. Asić, K. Dominant mechanisms of primary resistance differ from dominant mechanisms of secondary resistance to targeted therapies. Crit Rev Oncol Hematol. 97, 178-196 (2016).
  9. Arienti, C., et al. Preclinical evidence of multiple mechanisms underlying trastuzumab resistance in gastric cancer. Oncotarget. 7 (14), 18424-18439 (2016).
  10. Tanner, M., et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 16 (2), 273-278 (2005).
  11. Bang, Y. J., et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet. 376 (9742), 687-697 (2010).
  12. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01130337. A Study of Capecitabine [Xeloda] in Combination With Trastuzumab [Herceptin] and Oxaliplatine in Patients With Resectable Gastric Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01130337 (2017).
  13. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/show/NCT01748773 (2017).
  14. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from: http://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01472029 (2017).
  15. ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01196390. Radiation Therapy, Paclitaxel, and Carboplatin With or Without Trastuzumab in Treating Patients With Esophageal Cancer. , Available from: http://clinicaltrials.gov/show/NCT01196390 (2017).
  16. Shimoyama, S. Unraveling trastuzumab and lapatinib inefficiency in gastric cancer: Future steps (Review). Mol Clin Oncol. 2 (2), 175-181 (2014).
  17. Kelly, C. M., Janjigian, Y. Y. The genomics and therapeutics of HER2-positive gastric cancer-from trastuzumab and beyond. J Gastrointest Oncol. 7 (5), 750-762 (2016).
  18. Wong, S. S., et al. Genomic landscape and genetic heterogeneity in gastric adenocarcinoma revealed by whole-genome sequencing. Nat Commun. 5, 5477(2014).
  19. Oshima, Y., et al. Lapatinib sensitivities of two novel trastuzumab-resistant HER2 gene-amplified gastric cancer cell lines. Gastric Cancer. 17 (3), 450-462 (2014).
  20. Pignatta, S., et al. Prolonged exposure to (R)-bicalutamide generates a LNCaP subclone with alteration of mitochondrial genome. Mol Cell Endocrinol. 382 (1), 314-324 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TrastuzumabHER2IC50IQGAP1

מאמרים קשורים