Method Article

זיהוי ויזואלי של מספר חומצות גרעין ב מערך נימי

DOI:

10.3791/56597

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 2State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 4Collaborative Innovation Center for Biosafety of GMOs, National Center for the Molecular Characterization of Genetically Modified Organisms, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 5Key Laboratory of Crop Marker-Assisted Breeding of Huaian Municipality, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture and Environmental Protection, 6Department of Biomedical Engineering, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, School of Medicine, Tsinghua University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הזיוף של קלטת קטן, מוכן לשימוש, שניתן להחיל לצורך זיהוי חזותי של מספר חומצות גרעין בבדיקה אחת, קלה לתפעול. בגישה זו, מערך נימי שימש לצורך זיהוי מולטיפלקס ויעיל מאוד של GMO מטרות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרות מרובות, זמן קצר, ומתודולוגיות משאבים-סבירים עבור הגילוי של מספר חומצות גרעין יחיד, קלה לתפעול הבדיקה נדרשים בדחיפות אבחון מחלת, ניטור מיקרוביאלי, זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO), ו בדיקת מז פ. בעבר תארנו פלטפורמת שנקרא שלווה (Capillary Aמבוססי rray Lבתיווך oop איזותרמי הגברה לצורך זיהוי חזותי של ultiplex מ'של חומצות גרעין). במסמך זה, אנו מתארים משופרת ייצור ותהליכים ביצועים עבור הפלטפורמה. כאן, אנו מיישמים קלטת קטנה, מוכן לשימוש נאספו על ידי מערך נימי לזיהוי חזותי מולטיפלקס של חומצות גרעין. המערך נימי הוא התייחס מראש לתוך תבנית הידרופוביות, הידרופילית לפני תיקון בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה) פריימר קבוצות נימים. לאחר הרכבה של מתאם טעינה, תערובת התגובה המנורה טעון, מבודד לתוך כל נים, עקב כוח נימי מאת pipetting צעד אחד. התגובות המנורה מתבצעים במקביל הנימים. התוצאות נקראים חזותית על ידי תאורה עם פנס UV ידניים. באמצעות פלטפורמה זו, נדגים ניטור של 8 לעתים קרובות להופיע ורכיבים של גנים בדגימות GMO ירידה לפרטים גבוהה ורגישות. לסיכום, פלטפורמת המתוארים במסמך זה נועד להקל על הזיהוי של מספר חומצות גרעין. אנו מאמינים שיהיה החלים נרחב בתחומים בהם דרושה ניתוח חומצת גרעין תפוקה גבוהה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכות בעלות נמוכה, מהירה, קלה לשימוש עבור גילוי בו זמנית של מספר חומצות גרעין נחוצים בדחיפות במגוון רחב של תחומים, כגון אבחון קליני1,2,3, זיהוי GMO4, 5,6, חיידקים ניטור7,8,9, בדיקת מז פ10,11, במיוחד בשלב של טיפול בדיקות (POCTs), שבו משאבים הם בדרך כלל מוגבלת12,13,14.

תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), כולל שיטות נגזרות שלו בזמן אמת PCR ו- PCR מולטיפלקס, היא הטכניקה שימושית נרחב ביותר לגילוי בתחומים אלה. עם זאת, שיטות אלה בדרך כלל לזהות רק מטרה אחת מבחן אחד15 והן דורשות חשמל וציוד מקצועי ומתוחכם.

טכנולוגיה מבטיחה אחרת לגילוי חומצות גרעין הוא בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (מנורה), אשר תוארה לראשונה בשנת 200016. המנורה היא יעילות גבוהה שיטת זיהוי ה-DNA. באופן תיאורטי, זה להגביר את מעותק 1 ל 109 עותקים של amplicons בתוך שעה אחת, כל תרגיל בטמפרטורה קבועה, (דהיינו, בין 60-65 מעלות צלזיוס). הגברה מוצלח לייצר כמות גדולה של רב-תכליתי לוואי לא מסיסים, לגרום לשינוי במצב עכירות17, אשר יכול להיות שנצפו ישירות בעין בלתי מזוינת. שינוי צבע יכול גם להיות שנצפו על ידי התוספת של יונים מתכתיים או צבעי פלורסנט כגון Calcein18, חומצת גרעין לצבוע19הידרוקסיל naphthol כחול20. בגלל היתרונות של רגישות גבוהה ונוחות של המבצע, המנורה מוחל נרחב בזיהוי חומצת גרעין.

כיום, קיימות אסטרטגיות בעיקר שני מבחני המנורה מולטיפלקס. אחת היא לבצע מבחני המנורה מרובים על-ידי המנורה מרובים פריימר מגדיר את שפופרת אחת21,22,23. עם זאת, הריבוי ואת היעילות הגברה מוגבלת על ידי הפרעה פנימית ועל תחרות בין קבוצות שונות פריימר. יתר על כן, זה יכול להיות קשה לזהות מוצרים שונים המנורה אותה התגובה. אסטרטגיה נוספת מבוססת על בידוד פיזי. ערכות פריימר שונים היו מבודדים לתוך תאים בודדים מיניאטורי, וכל מספר תגובות המנורה ואז יבוצעו בו זמנית24,25. גישות אלה, אשר בדרך כלל מבוססים על שבבי microfluidic, מספקים פתרון אפשרי לתגובות המנורה תפוקה גבוהה. אולם, לייצור השבבים ואת הציפוי קדם מולטיפלקס של ערכות פריימר הוא מסובך, אשר עשויים להגדיל את עלויות ולהקטין הפארמצבטית.

לאחרונה, מחקרים אחדים תיארו המנורה ביצוע, בתגובות נימים לעקוף את הזיוף מסובך של שבבי microfluidic, השיגו בעלות נמוכה זיהוי26,27. עם זאת, לגבי ניתוח תפוקה גבוהה, נימים אלה דומים מיניאטורי גירסאות של רצועת המבחנות כי הדגימות ואת התגובה ריאגנטים (כולל ערכות שונות פריימר) חייב להיות בנפרד מוכן להישלח שונים תגובת יחידות בתוך נימים. כדי להשיג במקביל וניתוח מולטיפלקס, ציוד נוסף, לדוגמה משאבת מזרק רב-ערוצי, נדרש לטעינה מקבילים של דוגמאות או נוגדנים.

כדי להתגבר על המגבלות הקשורות השיטות לגילוי מולטיפלקס של חומצות גרעין, פיתחנו פלטפורמה ולמחקר המשלב טכנולוגיה המנורה חזותית עם מערך נימי. פלטפורמה זו היא מטרות מרובות, קומפקטית בגודל, עלות נמוכה, וקל לתפעול28. במסמך זה, אנו מתארים את הפרטים של כיצד לפברק את מערך נימי ולבצע את התגובות המנורה במערך. הפרוטוקול המתואר כאן יש כבר סטנדרטית באמצעות זיהוי אורגניזם מהונדס גנטית (GMO) כמודל. חשוב לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש גם בזיהוי תפוקה גבוהה של מטרות חומצות גרעין אחרות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי העובש פלדת אל-חלד הנושאת את הצורה עבור המיקרו-הערוצים הרצוי ואת את מתאם טעינה שכבר נעשו (קובצי תלת-ממד מסופקים משלימה קבצים 1, 2. ). פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי צמח DNA בידוד כבר בוצעה.

1-ייצור של הקלטת מוכנה לשימוש מבוסס על מערך נימי

  1. לנקות את התבנית מפלדת.
    1. שטיפת כייר מפלדת מאת דטרגנט, אתנול ומים יונים כדי להסיר את מזהמים פוטנציאליים. יבש את התבנית על-ידי חנקן.
  2. לנקות את נימי הדם
    1. ללבוש משקפי מגן, כפפות מגן אחיד, כימית במעבדה.
    2. המקום נימים לתוך גביע. לנקות את נימי הדם עם 30 מ ל אצטון עבור 5 דקות כדי להסיר חומר אורגני, ולאחר מכן לשטוף את נימי הדם במים יונים.
      התראה: להתמודד עם אצטון בשכונה fume.
    3. שופכים 10 מ"ל של 2 O H 2 לתוך כשהספל ולאחר מכן להוסיף 30 מ של H 2 כדי 4 לתוך 2 O H 2 עם איטי רועד למניעת התחממות יתר. ודא כי הפתרון (פיראניה פתרון) תופש לחלוטין את נימי הדם במשך לפחות 30 דקות
      התראה: להיזהר בעת טיפול פיראניה פתרון (H 2 אז 4 /H 2 O 2 = 3: 1, וי/v) . אם הפתרון פיראניה ישפך, לשטוף את הפתרון במהירות עם כמות גדולה של מים, לנגב את המשטח עם מגבות נייר.
      הערה: ניקוי יסודי של נימים היא אחת מנקודות המפתח כדי להבטיח ההצלחה של התגובה המנורה. יש צורך לנער את הצילינדר חומצה במהלך העבודה כדי להסיר את הבועות נימים, גם ניתן להאריך את הזמן נקי כאשר הדבר יידרש.
    4. לשטוף את הפתרון פיראניה עם כמות גדולה של מים. רחץ נימים עם אתנול וביו -יונים מים במשך 5 דקות. יבש הנימים בתנור ייבוש.
  3. למזוג polydimethylsiloxane (PDMS)
    1. משקל החוצה ריאגנטים הבסיס, ריפוי PDMS עם יחס של 1:1 בשפופרת 50 מ ל. בדרך כלל, לערבב 5 גר' elastomer הבסיס ל 5 גרם של אלסטומר אשפרה הסוכן.
    2. ומערבבים את התערובת היטב במשך כ- 5 דקות עם מוט זכוכית. מקום ברכבת התחתית עם PDMS בתוך צנצנת ואקום במשך 30 דקות בשביל לבטל את ההמתה.
    3. שופכים את PDMS לאט לתוך הגליל התבנית נירוסטה. לאפשר את PDMS לרפא עבור 3 שעות בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס
      הערה: להיות זהירים כדי למנוע בועות אוויר בעת יציקת PDMS. לאחר PDMS השוטף, לאפשר לו לעמוד במשך 5 דקות טבעית הסרה של בועות מחוץ PDMS.
  4. להסיר את התבנית מן PDMS
    1. לאחר לרפא את PDMS, להסיר את התבנית על-ידי הוצאת את התבנית עם צילינדר. להסיר PDMS הגליל על ידי גזירה את השוליים של עובש עם אזמל.
    2. שטיפת PDMS שלוש פעמים עם אתנול ומים יונים. PDMS היבשה תמיכה עם חנקן-
  5. מתייחסים המשטח התחתון של התמיכה PDMS להיות הידרופובי. להשרות PDMS תמיכה בסופר-הידרופובי מעיל יבש ס' 1 זה 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הוסף את נימי בתומך PDMS
    2. הכנס הנימים נקי 4 מ מ לתוך החורים של התמיכה PDMS ולהשאיר 0.5 מ מ של הנימים מחוץ המשטח העליון של התמיכה PDMS. ודא הקצוות של נימים הם באותה רמה.
  6. לטיפול המשטח החיצוני של הנימים, המשטח העליון של התמיכה PDMS להיות הידרופובי.
    1. 15 להוסיף µL מעיל סופר-הידרופובי על גבי המשטח העליון של PDMS תמיכה. שים לב כי הציפוי מייד מתפשטת על כל המשטח העליון (כולל השטח העליון של התמיכה PDMS משטחים החיצוני של החלק החשוף של הנימים) בכוח נימי.
    2. אוויר יבש את מערך נימי ששונה סופר-הידרופובי.
  7. לתקן פריימר לתוך מערך נימי
    1. להכין פתרון פריימר. משקל החוצה 0.65 g משקם (נוסחה מולקולרית: (6 H ג 11 4) n) להמיס במים 50 מ ל יונים על-ידי התאמת רמת ה-pH ל 4.5-5.5 עם חומצה אצטית להשגת ריכוז משקם של 1.3%. הכנת תחל שילוב רכיבים לפי טבלה 1. ראה טבלה 1 משלים עבור תחל
    2. µL 1.6 להוסיף תערובת של קבוצה אחת של תחל למלא אחד המתאים נים של המערך נימי לפי צו מעוצב מראש.
      הערה: הנימים ריק שני הנותרים נקבעו כפקדי שלילי.
    3. לעגן את המערך בטוב שקוף של צלחת 96-ובכן בתחתית שטוח רגיל ויבש המערך ב 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 2 ח'
< td > 1.0/1.0
המנורה פריימר שילוב רכיבים (ריכוז הראשונית)נפח (μL)
ddH 2 O17.0
משקם (1.3%)1.0
תחל ב- FIP/ביפ (20 μM)2.0/2.0
LoopF/LoopB פריימר (20 μM)
F3/B3 פריימר (20 μM)0.5/0.5
הנפח הכולל25.0

טבלה 1: הרכיבים של המנורה פריימר מתקן ריאגנטים. הרכיבים של המנורה פריימר מתקן ערבוב מפורטים בעמודה השמאלית של הטבלה, הנפח של כל רכיב מופיע בעמודה השמאלית.

  1. להרכיב את הקלטת כדלקמן. לשים מתאם טעינה על החלק העליון של מערך מעוגן. ודא כי המנה של מתאם מכסה רק את החלקים החשופים של כל עשר נימים (ראה איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: קלטת ייצור והרכבה. עובש () נירוסטה ו- PDMS של תומכים. העובש מורכב מ-3 חלקים: גליל, דאם לוח עמוד צלחת. (b) שתתמודדו PDMS תמיכה ייצור והרכבה של קלטת נימי. התהליך כולו מכיל 5 שלבים: 1. PDMS לרדת גשם זלעפות, 2. עובש הסרת, 3. הוספת נים, ציפוי פני השטח, 4. פריימר מתקן ו- 5. קלטת עיגון. 1. שופכים את PDMS לתוך גליל התבנית; 2. לדחוף החוצה הלוח סכר כדי להסיר את התבנית PDMS תמיכה; 3. המעיל השטח למטה של PDMS לתמוך ולאחר מכן להכניס את נימי הדם PDMS תומך, ולבסוף מעיל המשטח העליון של תמיכה PDMS וחשפה את נימים. הקו הכחול עבה מציין את המעיל הידרופובי סופר; 4. לטעון פריימר להגדיר לתוך בודדים נימים. 5. לעגן את מערך נימי בצלחת 96-ובכן אחד ולהתקין מדגם טעינת מתאם אליו. הפרטים תוארו בשלבים פרוטוקול 1.1-1.9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. ביצועים של המנורה התגובה במערך נימי

  1. להכין תערובת התגובה
    1. להכין את תערובת התגובה המנורה לפי T 2 מסוגל.
    2. הוסף ריאגנטים תערובת לפי הסדר שבחרת, כמו שולחן 2 ו מערבולת תערובת התגובה 5 s לאחר הוספת calcein. בעדינות פנימהוורט הצינור 20 פעמים לאחר פולימראז בסט נוסף.
מרכיבים למכשירי תאורה (ראשי תיבות-ריכוז)נפח (μL)
ddH 2 O11.6
MgSO 4 (100 מ"מ)2.0
dNTPs (25 מ מ)1.4 < /t d >
Betaine (5 מ')4.0
מאגר (10 x)2.5
Calcein (1.25 מ מ)0.5
MnCl 2 (25 מ מ)0.5
בסט < /em > פולימראז (U 8/μL)1.5
צמח DNA (10 ng/μL)1.0
הנפח הכולל25.0

טבלה 2: מערכת התגובה של המנורה-המערך נימי. הרכיבים של מערכת התגובה של רכיבי המנורה מערך נימי מפורטים בעמודה השמאלית, ואת הנפח של כל רכיב מופיע בעמודה השמאלית.

  1. לטעון את ריאגנטים. ואטמו את הקלטת
    1. פיפטה 20 µL המנורה תערובת התגובה עם תקן 100 µL עצה. הכנס את הטיפ לים של מתאם טעינה לנעול אותה. להחדיר בעדינות את תערובת התגובה לתוך המנה של מתאם; תערובת התגובה במהירות ממלאים את הכלים ולאחר מכן טעינה הנימים באופן אוטומטי באמצעות נימי כוח.
    2. להסיר את המתאם עם קצה נעול, לאטום היטב על ידי סרט איטום שקוף התואמים ל- PCR-
      הערה: רק הנימים לגעת תערובת התגובה בצלחת הידרופילית יכול להיות מלא. לכן ודא החלק העליון של כל הנימים הם באותו הגובה (ראה איור 2).

figure-protocol-2
איור 2: דיאגרמה לדוגמה-הטעינה באמצעות את מתאם טעינה. התמונה מראה את תהליך הטעינה העסקת פתרון כחול כדוגמה. הכנס את הטיפ לתוך הים, להזריק את הדגימה לתוך המתאם לאט ולאחר מכן הסר את המתאם עם טיפ נעול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. Incubate מערך נימי באינקובטור ב 63 ° C עבור ה 1

3. תוצאות הבדיקה וניתוח נתונים

  1. לרכוש תמונות של פליטת קרינה פלואורסצנטית.
    1. לתקן את פילטר UV על המשטח העליון של פנס UV LED ידניים קטנים לסינון האור.
    2. לרגש את calcein dissociated לפלוט קרינה פלואורסצנטית עם הפנס UV. לכידת תמונות מהחלק העליון של המערך נימי באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון חכם של.
    3. כאשר לוקחים תמונה, לוודא כי המצלמה היא הגדלה על האזור של הנימים ככל האפשר לקבל איכות גבוהה, נקה תמונות.
  2. לנתח את התוצאות
    1. לפתוח את תוכנת ניתוח התמונה על ידי תמונות ולאחר מכן בחר " התמונה > עובש > בגווני אפור > כן " ו- " התמונה > עובש > 16 סיביות > כן ". בחר " קובץ > שמור בשם > עיצוב > TIFF " כדי להמיר את התמונה לתבנית TIFF 16-bit.
    2. לחלץ הערך של עוצמת קרינה פלואורסצנטית
      1. פתח את תוכנת ניתוח microarray. גררו את התמונה בפורמט TIFF 16 סיביות לתוך ממשק התוכנה ולאחר מכן בחר את אורך הגל של " 532 ננומטר " וצבע של " ירוק " כדי להציג את התמונה.
      2. צור בלוק חדש כדי לאתר את המכשיר פלורסצנטיות מן הנימים. בחר " כלי > בלוקים חדשים " ולהזין את מספר העמודות והשורות כמו " 1; 1 " ו- " 2; 5 " ב ' רחובות ', ' תכונות ' הממשקים בנפרד.
      3. מיד לחץ על ובחר " תכונות " מודל ולאחר מכן התאם את המיקום ואת קוטר כדי להתאים את האזור זריחה של נימים. בחר " ניתוח " לשליפת הערך של עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
      4. בחר " קובץ > לשמור הגדרות כמו " כדי להציל את המסמכים בלוקים בחר " קובץ > להציל את תוצאות כמו " כדי להציל קרינה פלואורסצנטית עוצמת התוצאות. לחשב את SNR להגדיר אם המנורה מבוצעת בהצלחה בנימים.
        הערה: אותות של הנימים התקבלו על ידי הקלטה שערכי אפור של כתמים, אות רעש יחסי (SNRs) הוגדרו יחסי כלומר הערכים של הקידמה אותות של המטרות לערכים רשע הממוצע של הקידמה אותות של שני השליליים פקדים. החיתוך כדי לקבוע אותות חיוביים הוגדר בתור SNR > 2-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה זו, חשוב למניעת זיהום צולב בין נימים שונים במהלך הטעינה הדגימה. לענין זה, הוצג משקם, אשר יכול לשמר את תחל בנימים בודדים. כדי לבדוק אם זה עבד או לא, מראש תיקנו את פריימר (הפניה אנדוגני ג'ין תירס) ADH1 להגדיר את הקלטת נימי עם התבנית של "T" ו- "U", כמופיע ב איור 3a. כצפוי, רק פריימר נימים הכיל מגדיר הצגה חיובית אותות (איור 3b).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמת רגוע המודגמות כאן, אשר משלבת את הטכנולוגיה המנורה עם מערך נימי, מאפשרת זיהוי מטרות מרובות הקשורות GMO גן יחיד, מאוד יעיל וקל לתפעול מבחן בו זמנית.

כדי לבצע בהצלחה את התגובות המנורה מולטיפלקס בקלטת, שלוש נקודות קריטיות צריך להיות לב. ראשית, להשגת באותו גובה בחלק העליון של הנימים, התבנית הידרופיליות, הידרופוביות של המערך נימי הם קריטיים עבור טעינת בו-זמנית ריאגנטים לתוך כל הנימים. הנימים ליישר על-ידי צלחת לאחר הוספת הראשונית בתומך PDMS כדי להבטיח כל אחד מהם יכול לגעת תערובת התגובה טעון ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה היה מומן בחלקו על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין מענקים (31370813, 3147670, 31670831, 31600672,), הטרנסגניים צמח מיוחד הקרן (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), תוכנית עבור כשרונות חדשים של מצוינות המאה ב האוניברסיטה הלאומית למחקר מפתח, פרוייקט פיתוח של סין (2016YFA0500601) ו סין-דוקטורט למדע (2016 ז 591667).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UltraEverDry (מעיל סופר הידרופובי)UltraTech4001ספק: Exiron כימיה (סין) ושות', בע"מ
PDMSDow Corning8332557
Bst פולימראזניו אינגלנד BioLabsM0275L
בטאיןסיגמא-אולדריץ'B0300-1VL
סיגמא-אולדריץ'C0875-5G
MnCl2Sigma-AldrichMKBP0495V
MgSO4New England BioLabsB1003S
dNTPsשנחאי סנגוןB804BA0022
צ'יטוזןשנחאי סנגוןLJ0805S309J
תוכנת פוטושופ 7.0Adobe Systems Inc., CA, ארה"בניתוח תמונה
GenePix Pro 6.1מכשירים מולקולריים, קליפורניה, ארה"בתוכנת ניתוח מיקרו-מערך
AutoCADAdobe Systems Inc.תוכנת בנייה תלת מימדית
מסנן UV (ZWB2)YXSensingספק: taobao

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).
  2. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  3. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
  4. Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
  5. Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
  6. Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
  7. Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how? J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
  8. Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
  9. Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
  10. Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
  11. Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
  12. Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
  13. Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
  14. Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
  15. Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
  16. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  17. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  18. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  19. Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
  20. Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
  21. Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
  22. Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
  23. Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
  24. Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
  25. Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
  26. Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
  27. Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
  28. Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
  29. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
  30. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  31. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary ArrayNucleic Acid DetectionLoop Mediated Isothermal AmplificationMultiplex Visual DetectionGMO DetectionCapillary Force LoadingUV Flashlight ImagingFluorescence Intensity AnalysisCapillary Array CassetteLAMP Primer Sets

Related Articles