כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה מתוארת עבור תיוג RNA שליח בודדים (mRNA) תעתיקים של חיידקים קבוע עבור שימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH מאפשר מדידת השתנות לתא במספר עותק ה-mRNA של הגנים של עניין, כמו גם המיקום subcellular של התרשימים. הצעדים העיקריים הכרוכים הינם קיבוע של התרבות תא החיידק, permeabilization של קרום התא, הכלאה של התרשימים היעד עם קבוצות של הגששים זמינים מסחרית oligonucleotide קצר עם התווית fluorescently. smFISH יכול לאפשר ההדמיה של התרשימים של גנים מרובים באותו התא, עם מגבלות שהוטלו על ידי ספקטרלי החפיפה בין סמנים שונה פלורסנט. בעקבות השלמת פרוטוקול מאויר להלן, תאים יכולים בקלות לדימות באמצעות מיקרוסקופ בשילוב עם מצלמה מתאימה פלורסצנטיות בעוצמה נמוכה. תמונות אלה, יחד עם קווי המתאר תא שהושג פילוח של שלב ניגודיות מסגרות, או קרום התא מכתים, לאפשר את החישוב של mRNA עותק מספר התפלגות דגימה של תאים באמצעות תוכנת קוד פתוח או שכתוב מותאמת אישית. שיטת תיוג המתוארים כאן גם יסייע לי תמונה תעתיקים עם מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה).
מבוא
Stochasticity הוא היבט היסוד, נמנע של ביטוי גנים ונותן עלייה לתא-תא הטרוגניות1, שניהם ברמה של תעתיקים, חלבונים2,3. לכימות ההשתנות בין תאים בתנאים מוגדרים היטב מציעה חלון ייחודי תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס ביטוי ובקרת גנים שלה. מקור חשוב אחד של תא-תא הטרוגניות של חיידקים מתרחש ברמת תעתיק. התעתיק מספרי משתנים לא רק בשל את stochasticity של שעתוק, אלא גם לתהליכים post-transcriptional כגון רגולציה על ידי קטן RNAs ו RNAases2. דרך אחת של גישה ישירה זו הטרוגניות בצורה כמותית היא על-ידי תיוג fluorescently בודדים תעתיקים של גן מסוים ב- smFISH. מתודולוגיה זו מאפשרת זיהוי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בדיקה עיצוב
הערה: פרוטוקול זה משתמשת oligonucleotide זמינים מסחרית הגששים כבר מתויג עם fluorophores. הגששים מורכב סט של משלים מטרה ספציפית רצפי mRNA, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת. לחלופין, זה אפשרי לצרף סמני פלורסנט הגששים, כמתואר5,16.
- עיצוב smFISH הגששים באמצעות האלגוריתם16 מעצב בדיקה שפותחה על ידי Raj ארג'ון (ואן Oudenaarden מעבדה, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס); רצפים של הגששים smFISH בשימוש כתב יד זה מפורטים בטבלה של חומרים.
הערה: המספר המינימלי של זונדי בערכת אות לזיהוי זה ~ 30. מספרם המדויק עשויים להשתנות בהתאם הגן של ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנחנו ביצעו smFISH מדידות של הפרוטוקולים galK ו- sodB בתאים e. coli . התמלילים היו hybridized עם סט של רצפים ספציפיים משלים הרצף היעד, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת (ראה טבלה של חומרים). קרינה פלואורסצנטית ושלב חדות תמונות של MG1655 פראי-סוג e. coli זן (WT) או JW0740 (אוסף קאיו)19 שנמחקו galK זן (ΔgalK) נחשפו 2 מ מ D-fucose מוצגות באיור איור 1A ו- 1B. התאים היו קבוע לפחות 3 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לנו יש למדוד במעבדה שלנו המספר תעתיק של גנים שונים ב e. coli תאים באמצעות שיטת smFISH2. בקצרה, ההליך מורכב מהשלבים הבאים: תא קיבעון, permeabilization של ממברנות כדי לאפשר חדירה בדיקה, בדיקה הכלאה, וטעמו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה. נוהל זה מבוסס על אלה שפורסמו בעבר עם כמה שינויים6,7,16. קודם לכן דווח ש-smfish הזה דורש מספר oligonucleotide הגששים לשקר בטווח של 48-72, על מנת לה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדעים 514415 (ל. י. ס) ו- BSF-NSF (MCB) מענק 2016707 (ס). תומך זיגפריד, אירמה אולמן הלימודית הכסא (ס) הוא גם הודה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מלח נתרן דקסטרן סולפט | סיגמא-אולדריץ' | D8906 | |
| אתנול טהור, 99.5%, מגיב ACS, | מלינקרודט בייקר מוחלט - Avantor | 8025.25 | |
| דיאתילפירוקרבונט (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| ללא RNase 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| ללא RNase 10X PBS | Life Technologies/Ambion | מאגר AM9625 | |
| TE (10 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) BioUltra, לביולוגיה מולקולרית | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| מים ללא נוקלאז | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| תמיסת פורמלדהיד לביולוגיה מולקולרית, 36.5-38% במים | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| פורממיד נטול יונים, ללא נוקלאז | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (חומצה ריבונוקלאית, סוג העברה xx מ-escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50 מ"ג/מ"ל) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| קומפלקס ונדיל-ריבונוקלאוזיד, VRC, 200 מ"מ | ניו אינגלנד Biolab | S1402S | |
| פולי-L-ליזין | סיגמא | P4707 | |
| ציסטמין וחמצן | סיגמא-אולדריץ' | 30070 | |
| גלוקוז אוקסידאז מ- Aspergillus niger, סוג VII, 50KU | סיגמא-אולדריץ' | G2133 | |
| קטלאז | סיגמא-אולדריץ' | C40 | |
| D-גלוקוז | סיגמא-אולדריץ' | G8270 | |
| D-פוקוז | סיגמא-אולדריץ' | F8150 | |
| Vybrant DiO חיי פתרון תיוג תאים | טכנולוגיות | V2286 | |
| Agarose, מגיב התכה נמוך | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| מבודד סיליקון דבק 24-2 מ"מ קוטר. X 1.8 מ"מ עומק JTR24R-A2-2.0 | גרייס ביו-לאבס | JTR24R-A2-2.0<טווח> 666208 | |
| תחתית זכוכית מצופה פולי-D-ליזין זכוכית תחתון כלי תרבות תחתון זכוכית | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| כפפות בדיקה ללא אבקת ניטריל סופר לייף | Supermax | TC-N-9889 | |
| סרט חממת עיקור מותג | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| 1.8 מ"ל) | Axygen - Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים פלקון (14 מ"ל) | BD Biosciences | 352059 | |
| צנטריפוגה תחתונה חרוטית פוליפרופילן שפופרות (50 מ"ל) | קורנינג | 430828 | |
| פיפטות סרולוגיות (קורנינג 5 מ"ל) | קורנינג מדעי החיים | 4051 | |
| פיפטות סרולוגיות (קורנינג 10 מ"ל) | קורנינג מדעי החיים | 4488 | |
| פיפטות סרולוגיות (קורנינג 25 מ"ל) | קורנינג מדעי החיים | 4251 | |
| ספקטרופוטומטר קובטות | סארשטדט | 67.742 | |
| קצות פיפטה ללא RNase 0.2 - 20 μ l | ללא RNase של FroggaBio | FT20 | |
| 10 - 200 μ l | Axigene/corning | TF-200 | |
| קצות פיפטה ללא RNase 100 - 1000 μ l | FroggaBio | FT1000 | |
| קצות פיפטה ללא RNase 100 - 1000 μ l | Sorenson | 14200 | |
| מזרק חד פעמי 10 מ"ל מחט G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um מסנן מזרק | Sartorius | 16534 K | |
| מכשירי ניקון מיקרוסקופ סוג A שמן טבילה A, 8 סמ"ק | ניקון | MXA20233 | |
| מיקרוסקופ שקופיות 76 x26, 3"x1" x1 מ"מ | תרמו פישר סיינטיפיק | 421-004ET | |
| #0 שקופית כיסוי 24x60 | תרמו פישר סיינטיפיק/מנזל | BNBB024060A0 | |
| שייקר אורביטלי | M.R.C | TOU-50 | |
| בלוק חם | M.R.C | ||
| וורטקס | מטוגן חברת חשמל | G-560-E | |
| מיקרוצנטריפוגה | אפנדורף | 5427R | |
| צנטריפוגה | אפנדורף | 5810R | |
| נייד Pipet-Aid XP2, בקר פיפטה | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 ספקטרופוטומטר לשיעורי גידול חיידקים דילולפוטומטר | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD מצלמה | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti מיקרוסקופ | ניקון | MEA53100 | |
| תוכנית CFI אפוכרומט DM 100X שמן אובייקטיבי למבדה PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LP | Nikon | 49005 | |
| סט מסננים (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR תוכנת מחקר אוטומטי | Nikon | MQS31000 | |
| STORM מיקרוסקופ | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 טבילה במים אובייקטיבי<טווח> | אולימפוס | ||
| SRX תוכנת רכישת וניתוח תמונות | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD | מצלמהפוטומטריקה | ||
| Stellaris® בדיקות FISH, בדיקה מותאמת אישית עם CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5< | |
| strong>רצף בדיקה עבור galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgccaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagattt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaaccg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgccaggcagtgaac | |||
| ggcgttttcagtcagttaat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| Gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctttttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® בדיקות FISH, בדיקה מותאמת אישית עם Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| רצף בדיקה עבור sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgccaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagattt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaaccg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgccaggcagtgaac | |||
| ggcgttttcagtcagttaat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| Gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctttttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
מקורות
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
