מאמר שיטה

שיטת תיוג תעתיקים בתאים בודדים Escherichia coli לניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה

DOI:

10.3791/56600

⸱

21 בדצמבר 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר שיטת תיוג תעתיקים RNA שליח בודדים (mRNA) עם הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH היא שיטת הדמיה המאפשרת זיהוי בו זמנית, לוקליזציה, כימות של יחיד מולקולות mRNA בתאים בודדים קבוע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה מתוארת עבור תיוג RNA שליח בודדים (mRNA) תעתיקים של חיידקים קבוע עבור שימוש בניסויים מולקולה בודדת פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (smFISH) ב- e. coli. smFISH מאפשר מדידת השתנות לתא במספר עותק ה-mRNA של הגנים של עניין, כמו גם המיקום subcellular של התרשימים. הצעדים העיקריים הכרוכים הינם קיבוע של התרבות תא החיידק, permeabilization של קרום התא, הכלאה של התרשימים היעד עם קבוצות של הגששים זמינים מסחרית oligonucleotide קצר עם התווית fluorescently. smFISH יכול לאפשר ההדמיה של התרשימים של גנים מרובים באותו התא, עם מגבלות שהוטלו על ידי ספקטרלי החפיפה בין סמנים שונה פלורסנט. בעקבות השלמת פרוטוקול מאויר להלן, תאים יכולים בקלות לדימות באמצעות מיקרוסקופ בשילוב עם מצלמה מתאימה פלורסצנטיות בעוצמה נמוכה. תמונות אלה, יחד עם קווי המתאר תא שהושג פילוח של שלב ניגודיות מסגרות, או קרום התא מכתים, לאפשר את החישוב של mRNA עותק מספר התפלגות דגימה של תאים באמצעות תוכנת קוד פתוח או שכתוב מותאמת אישית. שיטת תיוג המתוארים כאן גם יסייע לי תמונה תעתיקים עם מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סערה).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stochasticity הוא היבט היסוד, נמנע של ביטוי גנים ונותן עלייה לתא-תא הטרוגניות1, שניהם ברמה של תעתיקים, חלבונים2,3. לכימות ההשתנות בין תאים בתנאים מוגדרים היטב מציעה חלון ייחודי תהליכים בסיסיים העומדים בבסיס ביטוי ובקרת גנים שלה. מקור חשוב אחד של תא-תא הטרוגניות של חיידקים מתרחש ברמת תעתיק. התעתיק מספרי משתנים לא רק בשל את stochasticity של שעתוק, אלא גם לתהליכים post-transcriptional כגון רגולציה על ידי קטן RNAs ו RNAases2. דרך אחת של גישה ישירה זו הטרוגניות בצורה כמותית היא על-ידי תיוג fluorescently בודדים תעתיקים של גן מסוים ב- smFISH. מתודולוגיה זו מאפשרת זיהוי ולוקליזציה subcellular של מולקולות RNA מסוים בתוך תיקנו, תאים חיידקיים בודדים4. mRNAs הם hybridized עם קבוצה של fluorescently-ידי ~ 20 בסיס באורך oligonucleotides שנועדו לאגד באופן סלקטיבי תעתיקים של ריבית5,6. תיוג מרובים מבטיחה זיהוי מעל רקע זריחה, מולקולות mRNA בודדות מופיעות נקודות עקיפה-מוגבלת תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות7 (ראה איור 1). ישנן גישות אחרות עבור תיוג מולקולות mRNA, שבו הגששים אוליגומר משלימים לשאת haptens מצומדת (למשל, ביוטין או digoxigenin) שזוהו באמצעות טכניקות משני כתב שכותרתו fluorescently8.

ישנן שיטות אחרות המספקים מידע כמותי אודות תעתיקים, בנוסף smFISH. כמה כמו הצפוני כתם או בדיקה הנפח PCR כמותי, ובכך יכול למדוד את מספר העותקים mRNA לא ולא עמדתם בתאים בודדים. לכן שיטות אלה אינם מתאימים לכמת השתנות מתא לתא. המערכת פותחה טכניקה המבוססת על תמונה האחרונות מאפשר כימות של הן מספר עותק RNAs בתוך התאים, כמו גם המיקום תאיים שלהם, שנקרא מרובב פלורסצנטיות שגיאה-חזקה בחיי עיר הכלאה (MERFISH). MERFISH מבוסס על ההקצאה של ברקוד ייחודי המורכב שילוב מוגדר של מספר קבוע של הגששים שכותרתו fluorescently oligonucleotide. ברקודים אלה נקראים סיבובים רציפים של מדידות smFISH, עם photobleaching הבאים בכל סיבוב של הכלאה, ובכך מגדיל את התפוקה על-ידי שני סדרי גודל9,10. טכניקה זו מחייבת של נוזל אוטומטיות טיפול המערכת ואת העיצוב המתאים של ערכת בדיקה.

השילוב של קרינה פלואורסצנטית מרובים תיוג של תעתיקים בודדים, יחד עם טכניקות הרומן סופר-רזולוציה כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)11, מאפשר גידול ten-fold רזולוציה לוקליזציה subcellular של הפרוטוקולים. בסערה, שילוב מתאים של הגששים פלורסנט ומאגר הדמיה מאפשר מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית לכל מולקולה בדיקה (מהבהב). הסערה עשוי לשמש גם תמונה של e. coli transcriptome ולבחון את הגנום כולו הארגון המרחבי של RNA, על-ידי תיוג בו זמנית כל התרשימים של ריבית12.

כל השיטות בתא יחיד שנסקרו לעיל מבוססים על הדמיה תעתיקים בתאים קבוע. לפיכך, הם אינם מספקים מידע כלשהו בדבר המאפיינים קינטי של תעתיקים בתוך התאים. לעקוב תעתיקים תאים חיים13, mRNAs יכול להיקרא על ידי היתוך גרעיני של הגן עניין למערך של איגוד אתרים. ואלו מכן מוכרות על ידי מחייב RNA חלבון, כמו bacteriophage MS2 המעיל חלבון, אשר היא דבוקה חלבון פלואורסצנטי כגון ה14,10,חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)15.

כאן נתאר שיטת תיוג mRNAs בודדים עם סט של הגששים דנ א שכותרתו fluorescently, לשימוש בניסויים smFISH, בפרט ב e. coli. יתר על כן, אנו מראים כי שיטת תיוג אותו עשוי לשמש למדידות סערה עם שינויים מזעריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בדיקה עיצוב

הערה: פרוטוקול זה משתמשת oligonucleotide זמינים מסחרית הגששים כבר מתויג עם fluorophores. הגששים מורכב סט של משלים מטרה ספציפית רצפי mRNA, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת. לחלופין, זה אפשרי לצרף סמני פלורסנט הגששים, כמתואר5,16.

  1. עיצוב smFISH הגששים באמצעות האלגוריתם16 מעצב בדיקה שפותחה על ידי Raj ארג'ון (ואן Oudenaarden מעבדה, המכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס); רצפים של הגששים smFISH בשימוש כתב יד זה מפורטים בטבלה של חומרים.
    הערה: המספר המינימלי של זונדי בערכת אות לזיהוי זה ~ 30. מספרם המדויק עשויים להשתנות בהתאם הגן של עניין, במיוחד אם תעתיקים קצר מאוד נמדדים.
  2. לבחור צבע שמתאים הגדרת אופטי (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: לצבוע Cy3 או של צבע שוות ערך שטיחות עם רגישות נמוכה כדי הלבנת-תמונה מומלצת מאוד. מועמד תיוג כפול הוא Cy5 או שוות ערך שטיחות לצבוע (ראה טבלה של חומרים). צבעים מתאימים עבור סערה הדמיה של mRNA שכותרתו מאופיינים שטמונה בהם מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית. קצת צבע smFISH יכול לשמש עבור הדמיה סערה (ראה טבלה של חומרים). לשיקוף תעתיקים שני (או יותר) המתאים גנים שונים באותו התא, אחד צריך לבחור את הגששים oligonucleotide מצומדת כדי צבעי הספקטרום של מי יש חפיפה קטנה או לא.

2. מגיב הכנה

הערה: חשוב לשמור את הדגימות נטולת RNAse באמצעות נטולת RNase מתכלים כגון פיפטה מסוננים טיפים וצינורות, וכדי לשמור בכל סביבת עבודה נקייה. כדי למנוע השפלה של התרשימים היעד, ריאגנטים כל פעם בעקבות קיבוע תא להיות נטול נוקלאז (ראה טבלה של חומרים) או diethylpyrocarbonate (DEPC)- ובא מחוטא.

  1. מאגרים עבור smFISH
    1. להכין ללא RNase PBS 1 x (buffered פוספט תמיסת מלח, פתרון עם ריכוז מאגר פוספט של 0.01 M, ריכוז נתרן כלוריד של 0.154 מ', (pH 7.4)). לדלל נטולת RNase PBS 10 x (ראה טבלה של חומרים) ב נוקלאז ללא מים (ראה טבלה של חומרים) ב 1:10 יחס v/v.
      1. לחילופין להכין שטופלו DEPC 1 x PBS.
    2. להכין ללא RNase 2 x SSC (תמיסת מלח-נתרן ציטראט מאגר, 0.3 M NaCl ב M 0.03 נקודות סודיום ציטרט, (pH 7.0)). לדלל נטולת RNase 20 x SSC (ראה טבלה של חומרים) במים נטולי נוקלאז בעשר: 1 יחס v/v.
      1. לחלופין, להכין 2 שטופלו DEPC x SSC.
  2. Oligonucleotide בדיקה מניות פתרון.
    1. לפזר מחדש את התערובת בדיקה oligonucleotide יבשים ב 200 µL מאגר TE (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) ליצירת מלאי רגש של 25 מיקרומטר. לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז מערבולת, צנטריפוגה בקצרה.
    2. כדי למנוע את פריזר ואת הפשרה של הצינור פתרון מניות, להפוך מספר aliquots של הפתרון מניות, המתאים הסכום צפוי לשמש ניסיוני יחיד להפעיל. לאחסן את הפתרון מניות ב-20 ° C או להלן, להגן מפני אור.
      הערה: ערכה בדיקה של 5 nmol יכול לספק עד 250 ריאקציות הכלאה.
  3. מאגר הכלאה (בעקבות סקינר. et al. 7 ):
    1. הוסף 5 מ ל מים נטולי נוקלאז לרכבת התחתית התחתונה חרוט פוליפרופילן 50 מ. להוסיף 1 g של סולפט לתוספי למים, להמיס על-ידי vortexing נמרצת. מערבבים את התוכן שייקר-מסלולית עד בועות נעלמים (~ 30 דקות).
    2. הוסף µL פתרון 3,530 של formamide יונים, 10 מ ג של e. coli tRNA, 1 מ"ל של 20 x האס, µL 100-200 מ מ vanadyl-ribonucleoside קומפלקס, µL 40 של 50 מ"ג/מ"ל BSA. להביא את עוצמת הקול הסופי 10 מ"ל על ידי תוספת של מים שטופלו DEPC או נוקלאז ללא מים, מערבולת הפתרון עד הוא הומוגני.
      הערה: כדי למנוע את פריזר ואת הפשרה של הפתרון, לבצע מספר aliquots של הפתרון מניות, המתאים הסכום צפוי לשמש ניסיוני יחיד להפעיל. חנות הפתרון מניות ב-20 ° C. הקפד לשחרר את formamide חמים לטמפרטורת החדר לפני פתיחת הבקבוק. כדי להפחית את הרקע, הוא הציע כדי לכייל את ריכוז אופטימלי formamide (10-40% יחס v/v).
      התראה: אזהרה! Formamide הוא רעיל מאוד, teratogen הידוע של. יש להימנע ממגע עם העיניים או העור, שאיפה או בליעה. . להתמודד עם זה ברדס fume בעת לבישת חלוק מעבדה וכפפות מגן
    3. לחטא את הפתרון על ידי העברתו דרך מסנן 0.22-מיקרומטר. לשמור על aliquots, לאחסן ב-20 ° C עד שנה אחת.
  4. הכנת מאגר קיבעון (4.6% פורמלדהיד ב- 1 x PBS) על-ידי הוספת 37% פורמלדהיד (v/v) 1 x PBS (ראו 2.1.1) יחס v/v 1:8, מערבולת.
    אזהרה: אזהרה! פורמלדהיד הוא רעיל מאוד, חומר מסרטן ידוע. . להתמודד עם זה ברדס fume בעת לבישת חלוק מעבדה וכפפות מגן
  5. להכין מאגר לשטוף smFISH (20% formamide 2 x SSC) על-ידי הוספת יונים formamide 2 x SSC (ראה 2.1.2) יחס v/v 1:4 ו מערבולת.
  6. להכין מאגר הדמיה smFISH על-ידי הוספת 5 מ מ cysteamine וחמצן אוכלי נבלות (7 מיקרומטר גלוקוז אוקסידאז, קטלאז nM 56 ו- 10% גלוקוז (w/v)) כדי לשטוף את מאגר (20% formamide 2 x SSC)
  7. מאגרים עבור סערה
    1. להכין מאגר על-ידי הוספת 50 מ"מ טריס-HCl 10 מ מ NaCl נוקלאז ללא מים.
      הערה: החנות RT במשך שנים.
    2. להכין מאגר B על-ידי הוספת 50 מ מ w/v טריס-HCl, 10 מ מ NaCl ו- 10% גלוקוז ללא נוקלאז למים.
      הערה: החנות 4 ° C עד שנה.
    3. להכין מאגר MEA על ידי המסת cysteamine 77 mg ב 1 מ"ל של מאגר A (עושה פתרון 1 מ').
      הערה: ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
    4. להכין מאגר Gloxy על-ידי הוספת 8,440 AU (יחידות שרירותיות) גלוקוז אוקסידאז, קטלאז AU 70,200 מ ל 1 מאגר א
      הערה: גורם 50 x מניות פתרון, ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.
    5. להכין מאגר הדמיה סערה על-ידי הוספת 50 מ מ של מאגר MEA, 1 x Gloxy מאגר אל מאגר ב'
      הערה: המאגר הדמיה סערה מורכב 5 מ מ cysteamine נבלות חמצן (7 מיקרומטר גלוקוז אוקסידאז ו 56 קטלאז ננומטר) ב- 50 מ מ טריס עם 10 מ מ NaCl, גלוקוז 10% ב- pH 8.0. להכין רק לפני הדמיה, יכולים להיות מאוחסנים ב RT המשמש כ 2 h.

3. מדגם קיבוע

  1. לגדל תאים חיידקיים (למשל, אי
קולי MG1655) בתקשורת צמיחה של בחירה (למשל, בינוני ליברות) לילה ענאן תפקודי לב / נשימה-260 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לקבוע את הרקע בשל הכריכה לא ספציפית של הגששים, מידות זן שבו נמחק את הגן עניין וצריך להתנהל, בעקבות אותם הליכים (ראה Δgalk ב איור 1 וδsodB ב איור 2).
  • לדלל את בטחונות תרבות לילה בינוני טריים ולמדוד את צפיפות אופטית (OD600) בספקטרופוטומטר כל h ~ 1, עד ערך של 0.2 - 0.4; תרבות 4 מ"ל אמורה להספיק.
    הערה: אם המיקרוסקופ שבחרת לא קיים שלב חדות או התערבות דיפרנציאלית חדות יכולות, e. coli ממברנות החיצוני ניתן שכותרתו עם 2 μM סמן פלורסנט lipophilic (ראה טבלה של חומרים), אשר צריך להוסיף ההשעיה חיידקי 20 דקות לפני קיבוע17. קיבוע וטיפול נוסף מוכשרות כמתואר להלן. חייבים להקפיד לבחור סמן פלורסנט יש ספקטרום פליטה שונה, כדי לצמצם את החפיפה ספקטרלי עם ערכת בדיקה עם התווית.
  • צניפה תאים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g 4,500 ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע לכל הצינורות.
  • להוסיף 1 מ"ל של 1 x PBS כל שפופרת, resuspend בגדר כדי למזער את צבירת מתא לתא. לאחר מכן להוסיף 4 מ"ל של קיבעון מאגר ו מערבולת בעדינות.
  • דגירה בדגימות שייקר מסלולית-סל ד 260 למשך 30 דקות ב- 24 מעלות צלזיוס.
  • צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות, 1000 גרם, 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע. הוסף PBS 1 x 1 מ"ל.
  • להעביר את המתלים 1.8 µL חרוט למטה מיקרו-צנטריפוגה צינורות (ראה טבלה של חומרים) וחזור על שלב 3.6 פעמיים.

    • 4. מדגם Permeabilization

    1. הסר בזהירות את תגובת שיקוע. השתמש פיפטות נפח קטן, במידת הצורך להסיר את כל הנוזל החוצה בגדר.
    2. Resuspend 300 µL שטופלו DEPC במים או נוקלאז ללא מים. מוסיפים 350 µL כיתה גבוהה מוחלטת אתנול (99%) ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך ברכבת התחתית. להוסיף עוד 350 µL של אתנול, מערבבים שוב, כדי להגיע ריכוז האתנול הסופי של 70% (יחס v/v).
      אזהרה: אזהרה! אתנול הוא דליק.
    3. לסובב את הדגימה עם שפופרת מסובב ב rpm 20 לשעה בטמפרטורת החדר (RT), או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דוגמאות ניתן לאחסן ב 4 ° C כשבוע.

    5. הכלאה

    1. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה 7 דקות, 750 גרם x, 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
    2. להוסיף 1 מ"ל 20% לשטוף את המאגר כדי הדגימות ולהשאיר במשך מספר דקות או פיפטה להתמוסס בגדר לחלוטין.
    3. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות, ב- 750 x גרם, 4 מעלות צלזיוס.
    4. הסר את תגובת שיקוע בעדינות על ידי pipetting. השתמש פיפטות בנפח מצומצם במידת הצורך להסיר את כל הנוזל החוצה בגדר.
    5. להוסיף החללית oligonucleotide הגדר פתרון מניות aliquot מאגר הכלאה כך הריכוז oligonucleotide הסופי הוא 250 ננומטר; מערבולת נמרצות.
      הערה: אחד יכול תווית mRNAs מטרה שונים שניים או יותר בו זמנית באותו התא. להוסיף ערכות בדיקה של שתי מטרות המאגר הכלאה. חייבים להקפיד לבחור צבעי שיש ספקטרום הפליטה שונים כדי לצמצם את החפיפה ספקטרלי (למשל, Cy3 ו- Cy5). ודא כי דגימות מיועד סערה הדמיה הן hybridized עם בדיקה oligonucleotide להגדיר מצומדת עם צבע מתאים עבור סערה (למשל, בטבלה של חומרים).
    6. להשעות דגימות (ראה שלב 5.4) 50 µL הכלאה מאגר המכיל את הגששים oligonucleotide, תוך הימנעות את הדור של בועות (הפתרון הוא צמיגה למדי).
    7. יוצאים דגימות בן לילה על בלוק חם ב 30 מעלות צלזיוס בחושך.
      הערה: בעקבות זאת, דגימות ניתן לאחסן עד 6 חודשים ב 4 º C.

    6. כביסה

    1. להשתמש שפופרת אחת microcentrifuge חדש עבור כל דגימה על תמונות. להוסיף 1 מ"ל שטיפת מאגר.
    2. להוסיף 10-15 µL בין דגימות hybridized הצינור החדש מכיל את מאגר לשטוף ואת תערובת/מערבולת.
    3. צניפה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 7 דקות, 750 גרם x-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.
      הערה: כדי לצמצם את הרקע, תקופת דגירה של 1 h ב- 30 ° C.
    4. לשטוף פעמיים נוספות (resuspend במאגר שטיפת 1 מ"ל, צנטריפוגה ולהסיר גלולה).
    5. Resuspend במאגר לשטוף µL 25.
      הערה: על מנת להפחית הלבנת-תמונה אחת ניתן להוסיף המאגר שטיפת חמצן ניקוי מערכת (2.6) כדי לשפר את יציבות צבען מולקולה בודדת פלורסצנטיות ניסויים6.

    7. הכנת דוגמאות עבור הדמיה

    הערה: תאים צריך להיות מרותק למיטה על מנת לאפשר הדמיה תקין תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות, שלב-ניגודיות. ניתן להשתמש בשיטות הבאות כדי להכין דוגמאות שבו השדות מבט שונות יכול לדימות-מטוסים מוקד שונים.

    1. הכנת ג'ל Agarose
      1. להוסיף 150 מ"ג agarose למאגר x SSC 10 מ ל 2. אל תוסיף 2 x SSC כדי agarose, אחרת זה לא יתמוסס כראוי.
      2. מיקרוגל עבור s 10-15 בכל פעם עד בועות גדולות מתחילים להיווצר. להפריש להתקרר כמה דקות.
      3. המקום מסגרת סיליקון הפרדת בשקופית כך המרכז של השקופית נשאר חשוף.
      4. במקום טבעת נוקשה 10 מ מ רחב (1-2 מ מ עובי) במרכז השקופית, להפקיד כמות קטנה של ג'ל בו עבור איטום. המתן מספר דקות בשביל זה להקשיח.
      5. הוסף ג'ל נוסף עד נוצרת צורת כיפה גבוהה. חכה 10 דקות בשביל זה להקשיח, ולהסיר את הטבעת (באמצעות פינצטה בסדר או כל שיטה אחרת).
      6. להפקיד ~ 10 μL של שטף תאים חיידקיים (ראה 6.5) על ג'ל, חותם עם מגלשת coverslip #0.
    2. הכנת הדוגמא קאמרית עבור smFISH
      1. לחילופין (לשלב 7.1) הכין דוגמיות הדמיה על ידי שיתק את שטף תאים חיידקיים (ראה 6.5) על פולי-D-ליזין-מצופה זכוכית תחתון חד פעמיות מפלסטיק צלחות פטרי.
      2. דגירה בדגימות בחושך, בטמפרטורת החדר, בין לילה לפני להדמיה כדי לאפשר הדבקה של תאי השטח. לפני ויזואליזציה לשטוף פעם עם שטיפת מאגר (. 5); שמור את הדגימה רטוב עם שטיפת מאגר buffer(2.5) או הדמיה עבור smFISH (2.6).
    3. תא הדגימה לקראת סופה
      1. להכין דגימות סערה עבור הדמיה על פולי-D-ליזין-מצופה זכוכית תחתון חד פעמיות מפלסטיק צלחות פטרי.
      2. דגירה בדגימות בחושך, ב RT, בן לילה. לפני ויזואליזציה לשטוף פעם עם שטיפת המאגר עבור smFISH (2.5); ולהוסיף מאגר הדמיה עבור סערה (2.7.5).

    8.התעתיק ויזואליזציה

    1. תמונה תאים עם מיקרוסקופ שדה רחב פלורסצנטיות מצויד שלב ממונע (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: עבור השינוי סערה, השתמש תאים עם תוויות עם צבע מסוגל מספר מחזורים של פליטת קרינה פלואורסצנטית. תמונת מדגם באמצעות מערכת הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה סופר (למשל, עיין בטבלה של חומרים).
    2. שימוש (מומלץ) 60-100 x N.A > 1.3 שמן טבילה שלב ניגודיות המטרה עדשה עם מקור אור חזק, כגון כספית או מטאל-הליד; מקורות אור מבוססי LED גם הם מומלצים.
    3. שימוש רגיל מקורר מצלמת CCD, אידיאלי אופטימיזציה עבור הדמיה ברמה נמוכה-אור יותר מאשר מהירות (אנו משתמשים מצלמה עם 16 גודל פיקסלים מיקרומטר) (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: השימוש של EMCCD מקורר (אלקטרון הכפלת חיוב מצמידים התקן) מצלמה CCD מצלמה יש צורך להפחית את הרעש תרמית המונעת זיהוי, במיוחד של מולקולות יחיד.
    4. שימוש במסנן מגדיר מתאים fluorophores שבחרת.
    5. כדי לקבוע כראוי תא לגבולות התא, לרכוש תמונות של שדות מבט שונות בכל מדגם עם אופטיקה חדות שלב, או על-ידי תיוג fluorescently קרום התא החיצוני. לרכוש תמונות-מטוסים מוקד שונים (z-מחסנית) עבור כל הערוצים (בדרך כלל הפרוסות 13 מופרדים 250 ננומטר נלקחים).
      הערה: השלב ממונע של המיקרוסקופ, מערכות סינון של צריכה להיות נשלטת על ידי מסחרי (ראה טבלה של חומרים) או תוכנה שבאתר ניתן ללכוד ערימה של תמונות ברצף.

    9. ניתוח נתונים

    1. להמיר את אוספי תמונות לתבנית מתאימה לניתוח נתונים.
    2. להעריך את עותק מספר היעד mRNA בעצימות הכולל של מוקדים פלורסנט בתא, ולא סופר דיסקרטית 'כתמים' כמו פרוטוקולים אחרים הזמינים כרגע.
    3. לבצע ניתוח תמונות עם תוכנת קוד פתוח18 או עם תוכנית לפי הזמנה. לפרטים על נתונים הדמיה וניתוח ראו סקינר. et al. 7

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנחנו ביצעו smFISH מדידות של הפרוטוקולים galK ו- sodB בתאים e. coli . התמלילים היו hybridized עם סט של רצפים ספציפיים משלים הרצף היעד, כל בדיקה להיות מצומדת כדי פלורסנט מולקולה בודדת (ראה טבלה של חומרים). קרינה פלואורסצנטית ושלב חדות תמונות של MG1655 פראי-סוג e. coli זן (WT) או JW0740 (אוסף קאיו)19 שנמחקו galK זן (ΔgalK) נחשפו 2 מ מ D-fucose מוצגות באיור איור 1A ו- 1B. התאים היו קבוע לפחות 3 ...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    לנו יש למדוד במעבדה שלנו המספר תעתיק של גנים שונים ב e. coli תאים באמצעות שיטת smFISH2. בקצרה, ההליך מורכב מהשלבים הבאים: תא קיבעון, permeabilization של ממברנות כדי לאפשר חדירה בדיקה, בדיקה הכלאה, וטעמו הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה. נוהל זה מבוסס על אלה שפורסמו בעבר עם כמה שינויים6,7,16. קודם לכן דווח ש-smfish הזה דורש מספר oligonucleotide הגששים לשקר בטווח של 48-72, על מנת לה...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים אין לחשוף.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    עבודה זו נתמכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדעים 514415 (ל. י. ס) ו- BSF-NSF (MCB) מענק 2016707 (ס). תומך זיגפריד, אירמה אולמן הלימודית הכסא (ס) הוא גם הודה.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    מלח נתרן דקסטרן סולפטסיגמא-אולדריץ'D8906
    אתנול טהור, 99.5%, מגיב ACS,מלינקרודט בייקר מוחלט - Avantor8025.25
    דיאתילפירוקרבונט (DEPC)Sigma-AldrichD5758
    ללא RNase 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
    ללא RNase 10X PBSLife Technologies/Ambionמאגר AM9625
    TE (10 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) BioUltra, לביולוגיה מולקולריתSigma-Aldrich93283
    מים ללא נוקלאזThermo Fisher Scientific10977035
    תמיסת פורמלדהיד לביולוגיה מולקולרית, 36.5-38% במיםSigma-AldrichF8775
    פורממיד נטול יונים, ללא נוקלאזThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
    E. coli tRNA (חומצה ריבונוקלאית, סוג העברה xx מ-escherichia)Sigma-AldrichR1753-500UN
    UltraPure BSA (50 מ"ג/מ"ל)Thermo Fisher Scientific/AmbionAM2616
    קומפלקס ונדיל-ריבונוקלאוזיד, VRC, 200 מ"מניו אינגלנד BiolabS1402S
    פולי-L-ליזיןסיגמאP4707
    ציסטמין וחמצןסיגמא-אולדריץ'30070
    גלוקוז אוקסידאז מ- Aspergillus niger, סוג VII, 50KUסיגמא-אולדריץ'G2133
    קטלאזסיגמא-אולדריץ'C40
    D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
    D-פוקוזסיגמא-אולדריץ'F8150
    Vybrant DiO חיי פתרון תיוג תאים טכנולוגיותV2286
    Agarose, מגיב התכה נמוךSigma-AldrichA9414
    מבודד סיליקון דבק 24-2 מ"מ קוטר. X 1.8 מ"מ עומק JTR24R-A2-2.0גרייס ביו-לאבסJTR24R-A2-2.0<טווח> 666208
    תחתית זכוכית מצופה פולי-D-ליזין זכוכית תחתון כלי תרבות תחתון זכוכיתMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
    כפפות בדיקה ללא אבקת ניטריל סופר לייףSupermaxTC-N-9889
    סרט חממת עיקור מותגSigma-AldrichBR61750
    1.8 מ"ל)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
    צינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים פלקון (14 מ"ל)BD Biosciences352059
    צנטריפוגה תחתונה חרוטית פוליפרופילן שפופרות (50 מ"ל)קורנינג430828
    פיפטות סרולוגיות (קורנינג 5 מ"ל)קורנינג מדעי החיים4051
    פיפטות סרולוגיות (קורנינג 10 מ"ל)קורנינג מדעי החיים4488
    פיפטות סרולוגיות (קורנינג 25 מ"ל)קורנינג מדעי החיים4251
    ספקטרופוטומטר קובטותסארשטדט67.742
    קצות פיפטה ללא RNase 0.2 - 20 μ lללא RNase של FroggaBioFT20
    10 - 200 μ lAxigene/corningTF-200
    קצות פיפטה ללא RNase 100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
    קצות פיפטה ללא RNase 100 - 1000 μ lSorenson14200
    מזרק חד פעמי 10 מ"ל מחט G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
    Minisart 0.2 um מסנן מזרקSartorius16534 K
    מכשירי ניקון מיקרוסקופ סוג A שמן טבילה A, 8 סמ"קניקוןMXA20233
    מיקרוסקופ שקופיות 76 x26, 3"x1" x1 מ"מתרמו פישר סיינטיפיק421-004ET
    #0 שקופית כיסוי 24x60תרמו פישר סיינטיפיק/מנזלBNBB024060A0
    שייקר אורביטליM.R.CTOU-50
    בלוק חםM.R.C
    וורטקסמטוגן חברת חשמלG-560-E
    מיקרוצנטריפוגהאפנדורף5427R
    צנטריפוגהאפנדורף5810R
    נייד Pipet-Aid XP2, בקר פיפטהDrummond Scientific Company4-000-501-I
    OD600 ספקטרופוטומטר לשיעורי גידול חיידקים דילולפוטומטרMidsciOD600-10
    iXon X3 EMCCD מצלמהAndorDU-897E-CS0-#BV
    Eclipse Ti מיקרוסקופניקוןMEA53100
    תוכנית CFI אפוכרומט DM 100X שמן אובייקטיבי למבדה PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
    (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LPNikon49005
    סט מסננים (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660PNikon49009
    Nis-elements AR תוכנת מחקר אוטומטיNikonMQS31000
    STORM מיקרוסקופVutaraSR-200
    NA 1.2 טבילה במים אובייקטיבי<טווח> אולימפוס
    SRX תוכנת רכישת וניתוח תמונותVutara
    Evolve 512 EMCCDמצלמהפוטומטריקה
    Stellaris® בדיקות FISH, בדיקה מותאמת אישית עם CAL Fluor® Red 590 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5<
    strong>רצף בדיקה עבור galK mRNA:
    gtgttttttctttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtc
    tgataatcaatcgccaggg
    gtggtgcacaactgatcacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgattttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagattt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacac
    gggtacgtttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaaccg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgccaggcagtgaac
    ggcgttttcagtcagttaat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    Gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    ggatcagcgcgacgatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctttttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    Stellaris® בדיקות FISH, בדיקה מותאמת אישית עם Quaser Fluor® Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
    רצף בדיקה עבור sodB mRNA:
    gtgttttttctttcagactc
    tagccaaatgcgttggcaaa
    ctgaatggtgtgagtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    acgaaaccgtcgttgtagtc
    tgataatcaatcgccaggg
    gtggtgcacaactgatcacg
    acgcgaactttacggtcatc
    gctgattttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagattt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacac
    gggtacgtttgaagttactg
    gtgttgtattcgctgccaac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaaccg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgccaggcagtgaac
    ggcgttttcagtcagttaat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    Gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    ggatcagcgcgacgatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctttttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    צינורות מיקרוצנטריפוגה ( קצות פיפטה סט מסנני

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
    2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
    4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
    5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
    6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
    7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
    8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
    9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
    10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
    11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
    12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
    13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
    14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
    15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
    16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
    17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
    18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
    19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
    20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

    מאמרים קשורים