מאמר שיטה

האתר מכוון הנייח של עצם Morphogenetic חלבון 2 משטחים מוצקים על ידי לחץ על כימיה

DOI:

10.3791/56616

⸱

29 במרץ 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer-Institut für Grenzflächen- und Bioverfahrenstechnik (IGB), Translationszentrum Würzburg 'Regenerative Therapien für Krebs- und Muskuloskelettale Erkrankung', Institutsteil Würzburg, 2Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Universitätsklinikum Würzburg, 3Lehrstuhl für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie, Universität Würzburg, 4Lehrstuhl für molekulare Pflanzenphysiologie und Biophysik, Julius-von-Sachs Institut für Biowissenschaften, Universität Würzburg

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomaterials מסטול עם 2 חלבון Morphogenetic (BMP2) עצם שימשו בתור אסטרטגיה טיפולית חדשה ריפוי שברים בעצמות, והמעלית. כדי להתגבר על תופעות לוואי הנובעות שחרור בלתי נשלט של הגורם, אנו מציעים אסטרטגיה חדשה באתר-ישירות לשתק את הגורם, ובכך ליצור חומרים עם יכולות osteogenic משופר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אסטרטגיות טיפוליות שונות לטיפול של ריפוי ללא פגמים עצם נחקרו באינטנסיביות. כעת בשימוש טיפולי נוכח מספר מגבלות שהובילו לכך השימוש biomaterials בשילוב עם גורמי גדילה osteogenic, כגון עצם morphogenetic חלבונים (BMPs). שיטות הקליטה או כימוס נפוץ דורשים כמויות העל-פיזיולוגיים של BMP2, בדרך כלל והתוצאה אפקט שחרור פרץ הראשונית כביכול מעורר מספר תופעות לוואי לוואי חמורות. אסטרטגיה אפשרית כדי להתגבר על בעיות אלה יהיה covalently הזוג החלבון אל הגרדום. יתר על כן, צימוד צריכה להתבצע באופן ספציפי לאתר על מנת להבטיח תוצאה המוצר לשחזור. לכן יצרנו משתנה BMP2, שבה חומצת אמינו מלאכותיים (propargyl-L-ליזין) הוצג לתוך החלק הבוגר של החלבון BMP2 על ידי הרחבת השימוש codon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk היה מצמידים חרוזים functionalized דרך נחושת מזורז אזיד-אלקין cycloaddition (CuAAC). פעילות ביולוגית בשילוב BMP2-K3Plk הוכח במבחנה , הפעילות osteogenic של חרוזים BMP2-K3Plk-functionalized ' הוכח בהתא המבוסס על מבחני. החרוזים functionalized במגע עם תאים C2C12 הצליחו לגרום ביטוי phosphatase אלקליין (ALP) בסמיכות מקומית מוגבלת של החרוז. לפיכך, על-ידי טכניקה זו, פיגומים functionalized יכול להיות מיוצר זה יכול לעורר תאית התמיינות לכיוון השושלת osteogenic. בנוסף, במינונים נמוכים BMP2 מספיקים בגלל הכיוון מבוקרת של האתר מכוון BMP2 בשילוב. בשיטה זו, BMPs נחשפים תמיד שלהם הקולטנים על פני השטח תא בכיוון המתאים, אשר אינה המקרה אם הגורמים הם מצמידים באמצעות טכניקות צימוד בוים אתר. התוצאה המוצר הוא מאוד לשליטה ועצמות, לפיכך, תוצאות בחומרים עם מאפייני הומוגנית, שיפור שלהם הישימות עבור התיקון של גודל קריטי פגמים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הסופית של התחדשות העצם והנדסה רקמת העצם היא להתגבר על חסרונות ומגבלות המתרחשים במהלך הטיפולים הנפוצים של שברים, והמעלית. Auto - או מאפשר-השתלות משמשים בעיקר אסטרטגיות טיפול הנוכחי, אף-על-פי לשניהם יש מספר חסרונות. השתל עצם אידיאלי אמורות לגרום פרכת על ידי osteoinduction, כמו גם osteoconduction, שמוביל osteointegration של השתל לתוך העצם. כיום, הוא רק אוטומטית-השתלת נחשב "תקן הזהב" מאז שהיא מספקת כל מאפייני והנערה אידיאלי. למרבה הצער, הוא גם מציג היבטים שליליים חשובים, כגון ניתוח ארוך פי אתר הטראומה השנייה בדרך כלל כרוך סיבוכים יותר (למשל, כאב כרוני, תצורות שטף דם, זיהומים, פגמים קוסמטיים, וכו '). השתלים allogenic, לעומת זאת יש מאפייני שיוצרת עבור כל ההיבטים כללי1. טכנולוגיות שתל עצם חלופי שופרו בבשנים האחרונות, במטרה לייצר פיגומים כי הם osteoinductive, osteoconductive, מסתיימים, ו- bioresorbable. מאז biomaterials רבים אינם מראים כל אלה מאפיינים osteogenic, גורמי גדילה שונים, בעיקר BMP2, BMP7, כבר שילבו על מנת לשפר את הפוטנציאל osteogenic של לגרדום מסוים2.

כמו קריטריון מהותי, כגון מערכות אספקה פקטורי גדילה צריך לספק שחרור במינון מבוקר לאורך זמן כדי להקל על האירועים חיוניים כמו גיוס תא, קובץ מצורף, ingrowth תא אנגיוגנזה. עם זאת, BMPs כמו גם גורמים אחרים-צמיחה osteogenic היה נפוץ מתאושש הלא-covalently3. מלכודת וטכניקות ספיחה דורשים השימוש בכמות החלבון עקב שחרור פרץ הראשוני, מה שמוביל חסרונות חמור ויוו, בדרך כלל להשפיע על הרקמות הסובבות על ידי גרימת overgrowth העצם, העל-פיזיולוגיים osteolysis, נפיחות ודלקת4. לפיכך, השמירה של גורמי גדילה באתר משלוח עבור תקופות זמן ארוכות יותר יכולה להיות מושגת על ידי שיטות קוולנטיות הנייח. מבחינה כימית שונה BMP2 (succinylated5, acetylated6 -biotinylated7), הנדסה לאחור heterodimers8, או BMP2 oligopeptides נגזר9 מיועד ומשמש כדי להתגבר על המגבלות הקשורות הקליטה. עם זאת, הביו-הפעילות של מבנים אלה אינה צפוי מאז ההסדר פוטנציאל מעכב את הכריכה של ליגנד קיבוע אל קולטנים הסלולר. כמוצג קודם לכן, זה הכרחי כי כל שרשראות קולטן ארבעה מעורבים היווצרות של ליגנד מופעל-קולטן מתחמי אינטראקציה עם BMP2 קיבוע על מנת להפעיל במלואה כל הזרם איתות cascades10.

כדי להתגבר על הבעיות של תוצאה inhomogeneous מוצר עם מגבלות מבחינת אתריים ויציבות הזמינות הביולוגית של הגורם קיבוע, תיכננו variant BMP מסוגל covalently מחייב פיגומים באופן מכוון באתר. וריאנט זה, הנקרא BMP2-K3Plk, כוללת חומצת אמינו מלאכותי, אשר הוצג על ידי הרחבת codon גנטי11. וריאנט זה בהצלחה נקשר פיגומים באמצעות אסטרטגיה צימוד קוולנטיות תוך שמירה על פעילותו הביולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הפקת BMP2 משתנה BMP2-K3Plk

  1. שיבוט של BMP2-K3Plk על ידי מוטגנזה באמצעות PCR 12
    1. להגביר את האדם BMP2 בוגרת (hmBMP2) של וקטור p25N-hmBMP2 (ראה טבלה של חומרים) עם פריימר לפנים (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') ולהציג פריימר הפוכה (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') (codon של עצירה ענבר לתייג) במיקום של פי ליזין הראשון של חלק בוגר BMP2´s. לבצע את התגובה PCR תוך שימוש µL 33.5 של H2O, 10 µL של תערובת התגובה PCR, µL 1.5 10 מיקרומטר פתרון dNTP מניות, µL 1.5 של פריימר לפנים (10 pmol/µL), µL 1.5 של פריימר הפוכה (10 pmol/µL), µL 1 של p25N-hmBMP2 (10 ng/µL) , ו- µL 1 של ה-DNA פולימראז (ראה טבלה של חומרים) ב הצנטרפוגה תרמי (דנטורציה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב 95 ° C עבור 1 דקות, חישול ב 60 ° C 1 דקות, התארכות-72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה של סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 10 דקות).
    2. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת זמינים מסחרית בעקבות המלצות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
    3. לעכל את המוצר PCR עם האנזים הגבלת NdeI ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות באמצעות µL 16 של H2O, 3 µL מאגר עיכול, µL 10 של ה-DNA (20 ng/µL), ו- 1 µL של אנזים הגבלה. חום-בטל האנזים-65 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לעכל את המוצר PCR עם האנזים הגבלת BamHI ב 37 ° C עבור h 1 באמצעות µL 16 של H2O, 3 µL מאגר עיכול, µL 10 של ה-DNA (20 ng/µL), ו- 1 µL של אנזים הגבלה. חום-בטל אנזים ב 80 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    4. לעכל את הווקטור pET11a-pyrtRNA עם NdeI ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 h ו- 45 דקות באמצעות µL 16 של H2O, 3 µL מאגר עיכול, µL 10 של ה-DNA (20 ng / µL), ו- 1 µL של אנזים הגבלה. חום-בטל ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. לעכל את הווקטור pET11a-pyrtRNA עם BamHI ב 37 ° C עבור h 1 באמצעות µL 16 של H2O, 3 µL מאגר עיכול, µL 10 של ה-DNA (20 ng/µL), ו- 1 µL של אנזים הגבלה. חום-בטל ב 80 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    5. להפריד את הווקטור מתעכל וקטור מעוכל, שרידים לעיכול על ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה (0.8% agarose, 60 דקות ב- 100 וולט). מאתרים ומפסיקים את תותב BMP2-K3TAG מתעכל עם עמוד שדרה pET11a מעוכל-pyrtRNA בטמפרטורת החדר (RT) עבור 2 h באמצעות 100 ננוגרם של עמוד השדרה pET11a-pyrtRNA, 34.5 ng של הוספה BMP2-K3TAG (היחס 1:3 שן טוחנת). תערובת התגובה מכיל עמוד השדרה ה-DNA, הוספה, µL 2 ליגאז המאגר, µL 1 של ה-DNA ליגאז, ו- H2O את הנפח הכולל של 20 µL.
    6. לבצע טרנספורמציה משותף של pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk ו- pSRF-דואט-pyrtRNAsynth בחיידקים BL21(DE3):
      1. להוסיף 50 ng של כל פלסמיד של חיידקים, מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות, הלם החום 42 ° C 50 s, במקום על קרח למשך 5 דקות, להוסיף 500 µL בינוני Lysogeny מרק (LB) ומערבבים אותם לנער-300 סל ד עבור 60 דקות.
      2. להפיץ µL 100 של תערובת חיידקים על גבי kanamycin ומחוממת מראש (µg 50/mL) / צלחות אמפיצילין (100 µg/mL), דגירה בין לילה ב 37 º C.
  2. ביטוי וטיהור של BMP2-K3Plk 13 , 14
    1. הפץ מושבה בודדת לילה ב- 50 מ ל LB בינוני עם 50 µg/mL של kanamycin, µg/mL 100 של אמפיצילין-37 מעלות צלזיוס.
    2. לדלל תרבויות לילה 1:20 לתוך 800 מ ל מרק נהדר (TB) בינוני בתוספת 50 µg/mL של kanamycin ו- µg/mL 100 של אמפיצילין, לגדול ב 37 ° C עד יתר600 של 0.7. להוסיף propargyl-L-ליזין ריכוז סופי של 10 מ מ. לאסוף מדגם µL 100 מתרבות לפני איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) אינדוקציה.
    3. זירוז ביטוי גנים על ידי הוספת IPTG כדי ריכוז סופי של 1 מ מ. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 ש ח בחודש תפקודי לב / נשימה-180 סל ד. לאסוף מדגם 100 µL מתרבות.
    4. Centrifuge כל התרבות ב g x 9000 במשך 30 דקות להשליך את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר חיידקי ב30 מ"ל tbse ב מאגר (10 מ מ טריס, 150 מ מ NaCl, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)) עם 1:1000 (וי/v) מרקפטואתנול (נוסף טריים).
      התראה: לטפל מרקפטואתנול מתחת למכסה המנוע fume. להימנע ממגע עם העור והעיניים. למנוע שאיפת אדים או ערפל. בצע את כל השלבים resuspension עם אנשים רגילים המכילים מרקפטואתנול מתחת למכסה המנוע fume.
    5. שוקל של גביע ריק צנטריפוגה ולהעביר בגדר resuspended לתוך כשהספל ריק. צנטריפוגה-6,360 g x עבור 20 דק. להשליך תגובת שיקוע ולשקול את. הספל עם בגדר. להפחית את נטל הספל הריק כדי לחשב את משקל בגדר.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. להקפיא בגדר ב-20 ° C בטווח הקצר או ב- 80 ° C בטווח הארוך. בעת חידוש הפרוטוקול, להפשיר את צניפה-RT.
    6. Resuspend בגדר במאגר סטי (10 מ מ טריס pH 8.0; 150 מ מ NaCl; 1 מ"מ EDTA, מ מ 375 סוכרוז 1:1000 (וי/v) מרקפטואתנול (נוסף טריים)). השתמש 200 מ ל STE מאגר עבור כל 10 גרם של גלולה.
    7. Sonicate התליה על קרח (10 דקות עם דופק s 40, הבלם 20 ו 30% משרעת). צנטריפוגה-6,360 g x עבור 20 דק. להשליך תגובת שיקוע, שוקל בגדר. חזור על השלבים sonication, צנטריפוגה 4 פעמים.
    8. Resuspend בגדר ב- 100 מ של TBS מאגר (10 מ"מ. טריס, 150 מ מ NaCl). צנטריפוגה-6,360 g x עבור 20 דק. להשליך תגובת שיקוע, שוקל גלולה.
    9. Resuspend בגדר במאגר נוקלאז (100 מ"מ. טריס, 1 מ"מ EDTA, MgCl 3 מ מ2) עם טרי הוסיף 80 U/mL נוקלאז (למשל, Benzonase) באמצעות 10 מ"ל/g של גלולה. דגירה ההשעיה ללון במלון RT על צלחת מלהיב (30 סל ד).
    10. להוסיף מאגר טריטון (60 מ מ EDTA, 1.5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) phenyl-פוליאתילן גליקול) כדי ההשעיה. הנפח של טריטון מאגר להוסיף מקביל חלק נפח 0.5 ההשעיה. תקופת דגירה של 10 דקות ב RT (ללא ערבוב). צנטריפוגה-6,360 g x עבור 20 דק. להשליך תגובת שיקוע, שוקל בגדר.
    11. Resuspend בגדר במאגר TE (100 מ"מ. טריס, 20 מ מ EDTA) באמצעות 8 מ ל/g של גלולה. צנטריפוגה-6,360 g x עבור 20 דק. להשליך תגובת שיקוע, שוקל בגדר.
    12. Resuspend בגדר על-ידי הוספת 4 מ"ל/g של 25 מ מ NaAc pH 5.0 ו- 5 מ"ל/g של 6 מ' GuCl עם 1 מ dithiothreitol (DTT) (נוסף טריים). דגירה ההשעיה בן לילה ב 4 ° C על צלחת מלהיב (30 סל ד).
    13. צנטריפוגה-g x 75,500 עבור 20 דקות. תגובת שיקוע מכילה כעת את החלבון BMP2 monomeric פרש. לאסוף את תגובת שיקוע ולהתרכז זו תמצית 20 OD/מ ל באמצעות ניתוק (MWCO) משקל מולקולרי 3 kDa קרום להתרכז תא (ראה טבלה של חומרים).
    14. הוסף את מונומרים מרוכז בטיפות יחיד למאגר Renaturation (2 מ' LiCl, 50 מ מ. טריס, חברים 25 מ"מ, 5 מ"מ EDTA, 1 מ מ גלוטתיון דיסולפידי (GSSG), 2 מ מ גלוטתיון (GSH)) תוך כדי ערבוב (30 סל ד). תקופת דגירה-RT של h 120 בחושך.
      הערה: במהלך תקופת דגירה refolding occours. הפתרון משלב זה ואילך מכיל את מקופל dimeric BMP2-K3Plk.
    15. להתאים את ה-pH של התמיסה 3.0 באמצעות מרוכז HCl. Dialyze הפתרון נגד 1 מ"מ HCl. תתרכז הפתרון dialyzed באמצעות קרום ניתוק (MWCO) 10 kDa משקל מולקולרי בתא להתרכז.
    16. Equilibrate את הפתרון על-ידי הוספת מאגר (20 מ מ NaAc, 30% אלכוהול איזופרופיל). להוסיף נפח של מאגר A המקביל נפח 30% של הפתרון. Centrifuge הפתרון ב g x 4700 למשך 15 דקות.
    17. Equilibrate את העמודה עבור יונים על חלבון מהיר כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC) מערכת15 עם 150 מ ל מאגר א טען הפתרון חלבון אל העמודה equilibrated. Elute שברים בעזרת שיפוע ליניארי של מאגר B (20 מ"מ NaAc, 30% אלכוהול איזופרופיל, 2 M NaCl) באמצעות 100 מ של מאגר ב לאסוף 2 מ"ל שברים.
      הערה: לרכז את החלבון לפני טעינת אל העמודה לפי עמודה הכולל אמצעי האחסון. אמצעי האחסון החלבון הסופי צריך להיות < 5% של אמצעי האחסון הכולל עמודה.
    18. ניתוח µL 20 של כל שבר מאת מרחביות לזיהוי ג'ל (12%) אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) 16 ו Coomassie מבריקים כחולים מוכתמים17 (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: Coomassie מבריק כחול מוכתם שברים מראה של ג'ל מרחביות-דף המכיל הדימרים (26 kDa) ושברים המכיל מונומרים (13 kDa).
    19. מאגר המכיל דיימר שברים. Dialyze הבריכה של דיימר המכילים שברים בן לילה ב 4 ° C נגד 1 מ"מ HCl (נפח 5 ליטר). להתרכז המוצר הסופי באמצעות kDa 10 של ריכוז יחידת צנטריפוגלי מסנן (ראה טבלה של חומרים). לנתח את המוצר הסופי לזיהוי מרחביות (12%) בג'ל (מרחביות-עמוד), צביעת Coomassie כחול מבריק.
      הערה: הלהקה על Coomassie מבריק כחול צבעונית מרחביות-דף ג'ל צריך להראות להקה אחת בלבד-26 kDa. זה המוצר הסופי BMP2-K3Plk.

2. אופטימיזציה של נחושת (I)-מזורז אלקין-אזיד תנאים Cycloaddition (CuAAC)

  1. ההשפעה של סודיום אסקורבט (NaAsc) ו- (II) נחושת סולפט (CuSO 4 ) על סוג בר BMP2 (BMP2-WT)
    1. דגירה מיקרומטר 20 BMP2-WT עם יחס שונה של NaAsc CuSO4. השתמש 0.5 מ מ NaAsc ו- 0.5 מ מ CuSO4 (החל ריכוז) באמצעי אחסון 50 µL. להמשיך היחס הבא של NaAsc CuSO4: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), שמירה על ריכוז4 CuSO קבוע ב- 0.5 מ מ והזזת את הריכוז של NaAsc בהתאם. לבצע את התגובה H2O על מערבל מסתובב (20 סל ד) בן לילה-RT.
    2. להכין דגימות מופחת על-ידי הוספת טעינת מאגר המכיל 5% מרקפטואתנול, דגירה מדגם ב 95 ° C עבור מופחת למינימום 6 ניתוח דגימות-מופחתת על ידי מרחביות לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (12%) (מרחביות-עמוד), צביעת Coomassie כחול מבריק. Coomasie צבעונית מרחביות-דף ג'לים להראות להקות בטווח של 13 kDa (שעימו מופחתת) 26 kDa, משקל מולקולרי גבוה יותר (תנאי שאינו מופחת).
  2. ההשפעה של Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) אמין (THPTA) התגובה CuAAC
    1. דגירה מיקרומטר 20 BMP2-K3Plk עם יחס שונה של THPTA CuSO4. השתמש 5 מ מ NaAsc, ולשמור על 200 מיקרומטר 3-Azido-7-hydroxycoumarin (NaAsc ו- 3-Azido-7-hydroxycoumarin קבוע). השתמש 50 מיקרומטר THPTA ו 0.5 מ מ CuSO4 כמתחילה ריכוזים. השתמש יחסים שונים של THPTA CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). לבצע תגובה H2O (הנפח הכולל של 50 µL) במשך 24 שעות ביממה במלון RT על מערבל מסתובב (20 סל ד).
    2. על זוגיות, 3-Azido-7-hydroxycoumarin הופך הפלורסנט. להכין דוגמאות תנאי מופחתת-מופחתת ולנתח אותם על ידי עמודים מרחביות. דמיינו את ג'לים תחת בערוץ עירור עם הגל ספציפי עבור 3-Azido-7-hydroxycoumarin (λabs = 404 ננומטר; λem = 477 ננומטר).

3. קוולנטיות צימוד בטכניקה של BMP2-K3Plk כדי אזיד Functionalized Agarose חרוזים

  1. תקופת דגירה 20 מיקרומטר של BMP2-K3Plk או BMP2-WT (משמש כפקד שלילי) עם µL 20 של חרוזי agarose מופעל אזיד הנפח הכולל של 500 µL במאגר התגובה (0.1 M HEPES pH 7.0, אוריאה 3.9 מ', CuSO 50 מיקרומטר4, 250 מיקרומטר THPTA, 5 מ מ סודיום אסקורבט) של 2 h ב- RT-rotati ng מערבל (20 סל ד). לעצור את התגובה על ידי הוספת 5 מ מ EDTA (ריכוז סופי).
  2. דגירה-RT למשך 15 דקות על מערבל מסתובב (20 סל ד). Centrifuge דוגמאות ב g 20,000 x עבור 1 דקות ב- RT. לאסוף את supernatants.
  3. לשטוף את גלולה המכילה את החרוזים שלוש פעמים עם µL 1,000 HBS500 מאגר (50 מ מ. HEPES, 500 מ מ NaCl), שלוש פעמים עם µL 1,000 מ' 4 MgCl2, ועם שתי פעמים µL 1,000 תמיסת פוספט buffered (PBS). על כל צעד כביסה, צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 1 דקות ב- RT ולאסוף supernatants. החנות בשילוב חרוזי µL 1,000 ל- PBS ב 4 º C.
    אזהרה: נא לא להפריע בגדר חרוז בעת הסרת את תגובת שיקוע.

4. אימות את הנוכחות ואת פעילות ביולוגית של קיבוע BMP2-K3Plk באמצעות טקסס אדום עם התווית BMP קולטן אני Ectodomain (BMPR-IA EC )

  1. דגירה 50 µL של חרוזים BMP2-K3Plk functionalized עם 1 מיקרומטר של טקסס אדום הנקרא BMPR-IAEC עם µL 150 HBS500 מאגר (50 מ מ. HEPES, 500 מ מ NaCl) ב RT עבור 1 h במיקסר מסתובב (20 סל ד).
  2. Centrifuge את החרוזים-g x 20,000 עבור 1 דקות ב- RT. להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את החרוזים עם 1000 µL HBS500 המאגר. חזור על השלב כביסה נוספים 3 פעמים. צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 1 דקות ב- RT לאחר כל רחצה שלב.
  3. Resuspend את החרוזים ב µL 500 ל- PBS, פיפטה µL 50 בשקופית כיסוי זכוכית. להגדיר את המסנן מיקרוסקופ בין 561 או 594 ננומטר. לאתר טקסס אדום – BMPR-IAEC– BMP2-K3Plk functionalized חרוזים באמצעות תמונות מיקרוסקופ ולקחת פלורסנט.

5. מדידת phosphatase אלקליין (ALP) ביטוי כדי להוכיח את Bioactivity ב חוץ גופית של המיוצר BMP2-K3Plk לפני, אחרי צימוד התגובה.

  1. Assay phosphatase אלקליין (ALP)
    1. התרבות התאים C2C12 promyoblastic (בקרת האוויר CRL-172) בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) עם 10% סרום עגל עוברית (FCS), U/mL 100 פניצילין G ו- 100 µg/mL סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified ב 5% CO2.
    2. זרע תאים C2C12 על צפיפות של 3 × 104 תאים/היטב לתוך microplate 96-ובכן. תן תאים לצרף בן לילה. הסר בינוני, דגירה C2C12 תאים בנוכחות 0.5-200 ננומטר של BMP2-WT או BMP2-K3Plk 100 µL/היטב של DMEM (FCS 2%, U/mL 100 פניצילין G ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL) ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified ב 5% CO2 עבור 72 h.
    3. הסר בינוני ולשטוף תאים עם µL 100 ל- PBS לכל טוב. Lyse תאים ב RT עבור h 1 עם µL 100/טוב של פירוק מאגר (1% NP-40, גליצין 0.1 M, pH 9.6, 1 מ MgCl2, ZnCl 1 מ2) על רועד צלחת (220 סל ד).
    4. הוסף µL 100/טוב של מאגר ALP (0.1 M גליצין, pH 9.6, 1 מ MgCl2, 1 מ ZnCl2) עם p 1 מ"ג/מ"ל-(טרי נוסף) nitrophenylphosphate תא lysate.
    5. למדוד את הקליטה-405 ננומטר, קורא multiplate לאחר הוספת המאגר ALP, ו כל 5 דקות עד להשלמת הפיתוח של הצבע. ליצור עקומות תגובת המינון וערכים EC50 באמצעות מודל לוגיסטי, y = A2 + (A1-A2) / (1 + (x/x0)p).
  2. צביעת phosphatase אלקליין (ALP)
    1. התרבות התאים C2C12 promyoblastic (בקרת האוויר CRL-172) של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום עגל עוברית (FCS), U/mL 100 פניצילין G ו- 100 µg/mL סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified ב 5% CO2.
    2. זרע תאים C2C12 על צפיפות של 3 × 104 תאים/באר microplate 96-ובכן. תן תאים לצרף בן לילה. הסר בינוני ומוסיפים µL 20/טוב של BMP2-K3Plk בשילוב חרוזים. BMP2-K3Plk בשילוב חרוזים נמצאים 1000 µL של השעיה PBS.
    3. להכין פתרון של 0.4% agarose נקודת ההיתוך הנמוכה ב- DMEM. להמיס במיקרוגל (600 W למשך 3 דקות) ולתת לו להתקרר באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C עד השימוש.
    4. הוסף 20 µL של 0.4% נקודת ההיתוך הנמוכה agarose בכל טוב (כיסוי חרוזים ותאים). צנטריפוגה ב 2000 x g עבור 5 דקות ב 20 º C. מוסיפים 80 µL DMEM (2% FCS, U/mL 100 פניצילין G ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified ב 5% CO2 עבור 72 h.
    5. הסר בינוני, נזהר שלא לנתק את agarose 0.4% הקרושה. להוסיף 100 µL/טוב של 1-צעד NBT/פתרון המצע BCIP (ניטרו-כחול tetrazolium כלוריד, 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-טולדין מלח).
    6. לנתח phosphatase אלקליין מכתים באמצעות מיקרוסקופ אור מיד לאחר ההכתמה סגול הופך נראית לעין. השתמש מיקרוסקופיית שדה בהיר, לצלם תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה, אנו מתארים שיטה כדי covalently כמה גרסה חדשה BMP2, BMP2-K3Plk, כדי אזיד זמינים מסחרית functionalized agarose חרוזים (איור 1). Bioactivity של variant BMP2-K3Plk המיוצר שהוכח על ידי נסיונות אינדוקציה של phosphatase אלקליין (ALP) ביטוי גנים בתאים C2C12. הבדיקה במבחנה מראה דומה רמות הביטוי של ALP, המושרה על ידי סוג בר BMP2 (BMP2-WT) ו- BMP2-K3Plk (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת חלבון מתויג גרסאות על ידי התרחבות codon גנטית מאפשרת המבוא של תחליפי חומצת אמינו הלא טבעי שונים בעיקר על כל מיקום של רצף החלבון העיקרי. במקרה של BMPs כמו BMP2, משותף מתייג כגון תג 6-היסטידין (שלו) יכול להיות רק הציג N-סופני, כיוון הסוף protein´s C-מסוף קבור בתוך מבנה שלישוני חלבון, ולכן אינו נגיש מבחוץ. על העמדות האחרות, הגודל של התג הציג עלול לגרום סביר מאוד שינויים מבניים אשר כתוצאה מכך כשבזזו והרסו את bioactivity BMP´s. עוד, היכרות עם מוטציה לתוך הרצף BMP2 יכולה להשפיע על יעילות refolding, ניתן גם לשנות פרמטרים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה ד ר מ' Rubini (קונסטנץ, גרמניה) מספקים את פלסמיד קידוד pyrrolysyl-tRNA ועל מתן pRSFduet-pyrtRNAsynth קידוד של המעביר aminoacyl-tRNA המתאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר
1 שלב NBT/BCIPתרמו פישר34042הוסף תמיסה לתאים
3-Azido-7-hydroxycoumarinBaseClickBCFA-047-1כימיקל המשמש לתגובת קליק
נקודת התכה נמוכה של אגרוזBiozym840101Agarose לבדיקת ALP 
חרוזי אגרוז אזידJena BioscienceCLK-1038-2חרוזים המשמשים לתגובה
BamHI (אנזים עיכול מהיר)Thermo Fisher ScientificFD0054אנזים הגבלה
קולטן BMP IA (BMPR-IAEC)-----מיוצר במעבדה שלנו
Coomassie Brilliant Blue G-250 DyeThermo Fisher Scientific20279כימיקל המשמש לצביעה כחולה מבריקה של SDS PAGE
נחושת (II) סולפט נטול מים (CuSO4)AlfaAesarA13986כימיקל המשמש לתגובת
לחיצה DNA פולימראז ומאגר תגובה KapabiosystemsKK2102KAPA HiFi PCR ערכת
Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM) GlutaMAXGibco61965-026מדיה לתרבית תאים
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)Sigma Aldrich GmbHE5134-1kgכימיקל המשמש לעצירת תגובת קליק
איזופרופיל ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Carl Roth GmbH2316.5אינדוקציה של חיידקים (ריכוז סופי של 1 מ"מ) 
NdeI (אנזים עיכול מהיר)Thermo Fisher ScientificER0581אנזים הגבלה
לייף טכנולוגיותT6134המופעל על ידי NHSבשילוב עם קולטן
P- ניטרופניל פוספטסיגמא אולדריץ' GmbHN4645-1Gפוספטאז אלקליין
p25N-hmBMP2 ----פלסמיד מסופק באדיבות מוולטר זבאלד לג'יי ניקל
pET11a-pyrtRNA----סופק על ידי הקתדרה לרוקחות וביו-רוקחות, אוניברסיטת וירצבורג
פרופרגיל-ליזין (Plk)----סופק על ידי הקתדרה לרוקחות וביו-רוקחות, אוניברסיטת וירצבורג
pSRFduet-pyrtRNAsynth----מסופק על ידי הקתדרה לרוקחות וביו-רוקחות,
ערכת מיצוי ג'ל QiagenQiagen28704טיהור ג'ל
Qiagen PCR ערכת טיהורQiagen28104PCR 
נתרן L-אסקורבטSigma Aldrich GmbHA7631-100Gכימיקל המשמש לתגובת לחיצה
T4 DNA LigaseThermoScientificEL0011Ligation 
tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA)BaseClickBCMI-006-100כימיקל המשמש לתגובת לחיצה
4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)פניל-פוליאתילן גליקולSigma Aldrich GmbHX100-1Lטריטון X 100 
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
<חזק>ציוד
עמיקון תא ריכוז 400 מ"ל Merck KGaA UFSC40001יחידת ריכוז
Amicon Ultra-15 יחידות סינון צנטריפוגליותMerck KGaAUFC901024ריכוז יחידה צנטריפוגלית
Ä KTA avant FPLCÄ KTA-מכונת FPLC
Avanti J-26XPבקמן קולטר 393124 צנטריפוגה לתרבית חיידקים
חממת טלטול חיידקיםInfors HTטלטול אינקובטור לתרבית חיידקים
FluorChem Qמערכת Proteinsimple--מערכתהדמיה וניתוח עבור SDS-PAGE
מיסקרוסקופ פלואורסצנטיKeyenceBZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M)Merck KGaA116882חומר עמודה כרומטוגרפיה להחלפת יונים
Greiner CELLSTAR®   96 צלחות בארסיגמאM5811-40EA96 צלחות באר לתרבית תאים (בדיקת ALP)
Heraeus Multifuge X1RThermoScientific---צנטריפוגה
M-20 מיקרופלייט מתנדנד דלי רוטורThermoScientific75003624רוטור למיקרוצנטריפוגה לצלחת במהלך צביעת ALP
מיקרוצנטריפוגה - 5417REppendorf--Centrifuge
OriginPro 9.1 G OriginLab-תוכנה לניתוח סטסטי של נתוני בדיקת ALP
שקופיות פוליזין שקופיותמיקרוסקופThermoScientific10143265
רוטור JA-10בקמן קולטר --רוטור לצנטריפוגה Avanti J-26XP
רוטור JLA 8.1בקמן קולטר --רוטור לצנטריפוגה Avanti J-26XP
רוטור JA 25.50בקמן קולטר --רוטור לצנטריפוגה Avanti J-26XP
Tecan אינסוף M200 קורא רב-צלחותTecan Deutschland GmbH-קורא Multiplate לבדיקת ALP
Thermocycler - שיפוע LabcyclerSensoQuest GmbH-PCR
TxRed - מסנן מיקרוסקופמסנן Keyenceלמיקרוסקופ פלואורסצנטי 
דיסקי תאית מחודשת אולטרה-סינון 3 kDaMerck KGaA PLBC04310בשימוש עם תא ריכוז אמיקון 400 מ"ל
אולטרה-סינון דיסקי תאית מחודשת 10 kDaMerck KGaA PLGC04310בשימוש עם תא ריכוז אמיקון 400 מ"ל
טקסס רד של אוניברסיטת Wuerzburg מערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
  2. Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations. Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).
  3. Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
  4. Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).
  5. Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2. Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).
  6. Uludag, H., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).
  7. Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity. Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).
  8. Aono, A., et al. Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer. Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).
  9. Suzuki, Y., et al. Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo. J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).
  10. Knaus, P., Sebald, W. Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily. Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).
  11. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).
  12. Costa, G. L., Weiner, M. P. Rapid PCR site-directed mutagenesis. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  13. Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2. FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).
  14. Tabisz, B., et al. Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds. Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).
  15. Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein. Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).
  16. Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
  17. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
  18. Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II. EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).
  19. Hein, J. E., Fokin, V. V. Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides. Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).
  20. Alborzinia, H., et al. Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists. J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).
  21. Paarmann, P., et al. Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling. Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).
  22. Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BMP2CuAAC

מאמרים קשורים