מאמר שיטה

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DOI:

10.3791/56617

⸱

3 בנובמבר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, Medical Faculty Mannheim of the Heidelberg University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) הם נגעים DNA רציני. ניתוח היווצרות ותיקון של DSB רלוונטי, בקשת רחבה של תחומי מחקר כולל גנום שלמות, genotoxicity, קרינה ביולוגיה, הזדקנות, סרטן של פיתוח תרופות. בתגובה DSB, היסטון H2AX הוא phosphorylated-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase ויוצרים foci גרעיני דיסקרטית לזיהוי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. בנוסף, 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא עוד חלבון מגיב DSB חשוב בקידום תיקון של DSB ומצטרף nonhomologous סוף-תוך מניעת רקומבינציה הומולוגית. על פי הפונקציות ספציפית של γH2AX, 53BP1, ניתוח משולב של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות גישה סבירה עבור ניתוח מפורט של DSB. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורטות בתוספת הערות שיטתי על ביצוע הטכניקה. באופן ספציפי, ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הוא הפגינו fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. יתר על כן, הערך של מוקדים γH2AX כמו סמן מתואר רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. לבסוף, אי-יציבות גנטית ייחקר בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדנ א פגום באופן רציף על ידי אנדוגני (למשל, השכפול מתחים, מינים חמצן תגובתי, חוסר יציבות פנימי של ה-DNA), אקסוגני (למשל, רדיקלים כימי, הקרנה) מקורות (איור 1)1,2 3, ,4. בין נזק לדנ א, מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) נגעים רציני במיוחד, עשוי לגרום מוות של תאים או carcinogenesis. כ-50 DSB שעלולים להתעורר לכל מחזור התא ותא.5. בתרבית של תאים, רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות nonhomologous סוף-(NHEJ) פיתח כמו מסלולים עיקריים עבור התיקון של DSB (איור 2). HR מתרחשת בשלב מאוחר S/G2 ומשתמש אחות שלם כרומטידה כתבנית לתיקון פוטנציאלי ללא שגיאות. לשם השוואה, NHEJ הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל מוטגניות כפי בסיסי זוגות ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של הקצוות השבורים. בנוסף, סוף-הצטרפות אלטרנטיבית עשויים להיות עסוקים כמנגנון איטי מוטגניות גיבוי תיקון במקרה של NHEJ מחסור6,7.

DSB לגרום זירחון של היסטון H2AX-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase סביב כל DSB. מוקדים הגרעין ויוצרים נקראים γH2AX מוקדים, ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence8. ΓH2AX מקדמת את גיוס נוסף DSB מגיב חלבונים, ומעורב כרומטין שיפוץ, תיקון ה-DNA, ואת האות התמרה חושית9. כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, כימות של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא אפשרי, אשר הוכח שורות תאים סרטן, דגימות מטופלים10,11, 12 , 13 , 14. 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא חלבון מפתח אחר במתווכים DSB תיקון. . מעורב בלשכת הגיוס של DSB מגיב חלבונים, מחסום איתות את synapsis של DSB קצוות15. בנוסף, 53BP1 ממלאת תפקיד קריטי בבחירת מסלול תיקון DSB. זה מפעיל התיקון של DSB לכיוון NHEJ אמנם HR מנעו16. בהתחשב בפונקציות מקורית של γH2AX ו- 53BP1 תיקון DSB, ניתוח בו זמנית של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח מדויק של היווצרות והתיקון של DSB.

כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע immunofluorescence מיקרוסקופיה של γH2AX ושל 53BP1 בתוך גרעין התא. באופן ספציפי, השיטה מיושמת fibroblasts נורמלי של קו תא NHDF, רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא, תאי CD34 + של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. הפרטים של השיטה הם הצביע בהקשר של התוצאות שהוצגו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ה השני ועדת האתיקה של מנהיים בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. נכתב מדעת הושג מאנשים כל.

1. הכנה של חומרים

  1. פתרון מניות קרישה: להכין פתרון מניות קרישה של הפארין I.U. 200 לכל מ ב- 0.9% נתרן כלורי. למלא כל אחד הצינורות אוסף (לצייר כרך 9 מ ל) 2 מ של הפתרון מניות קרישה לפני נסיגה של דגימות דם או מח עצם.
  2. פתרון פירוק כדוריות אדומות: הכן 10 x פתרון פירוק כדוריות אדומות עם 82.91 g אמוניום כלוריד, 7.91 ג'י אמוניום ביקרבונט, 2 מ ל תמיסה חומצית ethylenediaminetetraacetic 0.5 M ל pH של 8.0 על ידי המסת הסוכנים ב מזוקק פעמיים מים עבור הנפח הכולל של 1 ל'
  3. קיבוע פתרון: 8.3 להוסיף µL של 1 מ' אשלגן הידרוקסידי פתרון 360 מ"ג paraformaldehyde (PFA) צינור microtiter. ממלאים את הצינור buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לסימון 1 מ"ל של הרכבת התחתית, חום הצינורית בתוך גוש חימום ב 95 ° C כדי לקבל 1 מ"ל של פתרון PFA 36%. להעביר את הפתרון מחברים של 36% 1 מ"ל צינור עם קיבולת של 15 מ"ל. הוסף 8 מ"ל PBS הפתרון PFA 36% 1 מ"ל, להשיג 9 מ של פתרון מניות של כדורגלן 4%. 4% PFA פתרון מלאי החנות ב-18 ° C עד ולהשתמש עבור קיבעון של תאי aliquot.
    התראה: 1) אשלגן הידרוקסידי פתרון הוא מאכל. להיות מודע העין והגנה על העור. 2) כדורגלן הוא מסרטנים. להימנע במגע עם העור אינהלציה. להכין את הפתרון קיבוע ברדס.
  4. Permeabilization פתרון: להוסיף 50 µL Octoxinol 9-50 מ"ל PBS כדי לקבל פתרון כ- 0.1% Octoxinol 9-
  5. חוסם פתרון: להכין 5% 2% חסימת פתרונות על ידי ערבוב הסוכן חסימת חלבון עם PBS, חנות-6 – 8 ° C.

2. הכנת הדגימות

  1. Fibroblasts בתרבות תא: מטפחים fibroblasts האנושי של הקו תא NHDF ב 5% humidified האווירה 2 CO ב 37 מעלות צלזיוס בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 4 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    1. הכנת שקופית מיקרוסקופ עם חסיד fibroblasts
      1. הסר המדיום הבקבוק (אזור הצמיחה של 2 75 ס מ) עם שמתקדמות NHDF fibroblasts. להוסיף 10 מ"ל PBS הבקבוקון. לשטוף את fibroblasts חסיד בעדינות ע י ניעור באופן ידני את הבקבוקון עבור מינימלית 1
      2. להסיר את PBS ולהוסיף טריפסין 1 מ"ל לתוך הבקבוק. לנער את הבקבוק בעדינות כדי לוודא כי כל תאים חסיד מכוסים על ידי טריפסין. הסר את טריפסין הבקבוקון. לשים את הבקבוק לתוך החממה במשך 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      3. לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהוסיף 10 מ"ל RPMI 1640 בינוני לתוך הבקבוק. Pipette של המדיום לאורך מספר פעמים כדי לפזר את fibroblasts.
      4. פיפטה 0.3 מיליליטר fibroblasts מפוזרת על גבי כל אחד מהשדות שני של השקופית מיקרוסקופ ולשים את השקופית לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה כך fibroblasts לדבוק השקופית. עבור immunostaining של γH2AX ו 53BP1 ב הגרעינים של fibroblasts, נעבור לשלב 3.1.
  2. דגימות החולה
    1. ודגימות הדם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה ולהוסיף 7 מ ל דם לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3).
    2. דגימות מח עצם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה (שלב 1.1) ולהוסיף מח עצם 7 mL לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3). השתמש CD34 גרגרי וסלולרי ההפרדה עמודות עבור הבידוד של תאי CD34 +.
    3. בידוד תאי תאי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
      הערה: תאי תאים מבודדים דגימות מח עצם ודם על ידי צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות 17 , 18 , 19.
      1. Dilute את דגימת הדם heparinized על יחס של 1:1 עם PBS ולדגום את מח העצם heparinized על יחס של 1:3 עם PBS. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים.
      2. להוסיף נפח של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור טריים. בעדינות שכבת דם מדולל או מח עצם על המדיום הדרגתיות צפיפות. הקפידו לא לערבב שתי שכבות.
      3. Centrifuge הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, 400 x ג להרחיק את השכבה העליונה פלזמה עם פיפטה. ואז בזהירות לקצור תאי תאי השכבה שמעל המדיום הדרגתיות צפיפות. העברת תאי תאי לתוך צינור טריים.
      4. להוסיף לפחות שלושה כרכים של PBS תאי תאי בצינור. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים. Centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400
      5. לאחר הספין להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של 4 ° C, 1 x פתרון פירוק כדוריות אדומות. Resuspend התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים, ולמקם את הצינורית על קרח למשך 5 דקות. ואז להוסיף 30 מ ל PBS ב 4 ° C, centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400
    4. הכנת cytospins
      1. להכין שני cytospins עם תאי תאי של הדגימות החולה (קרי, cytospin אחד עבור צביעת immunofluorescence γH2AX, cytospin אחד עבור γH2AX ו- 53BP1 משולב immunofluorescence מכתים) על ידי צנטריפוגה (x 300 גרם, 10 דקות) של 1.0 x 10 5 תאים עבור כל הכנה ( איור 3 ו-4)-

3. γH2AX, צביעת Immunofluorescence 53BP1

  1. קיבעון, permeabilization: לתקן את התאים עם 200 µL של 4% PFA למשך 10 דקות. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. ואז permeabilize את התאים עם 200 µL של 0.1% Octoxinol 9 עבור 10 דקות לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של 5% פתרון חסימה למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. לחסום את התאים 30 מ של טרי 5% חסימת פתרון עבור ה 1
  2. הדגירה עם נוגדנים
    1. דגירה בתכשיר אחד של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) והכנות אחרות של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) ו- a נוגדן anti-53BP1 ארנב polyclonal (שבערך) בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס
    2. לאחר דגירה לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים עם 30 מ של 2% חסימה פתרון עבור כל 5 דקות על מטרף המעבדה.
    3. להסיר הפתרון חסימה, דגירה ההכנה הראשונים של התאים עם עז Alexa488 מצומדת אנטי-העכבר המשני נוגדן (שבערך) והכנת השני את התאים עם (נוגדן אנטי עכבר משני עז מצומדת-Alexa488 שבערך) ואת החמור Alexa555 מצומדת ארנב אנטי משני נוגדן (שבערך) לשעה בטמפרטורת החדר.
  3. הרכבה בינונית: לשים את השקופית הכוללת התאים בקערה ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS עבור כל 5 דקות על המעבדה מטרף. הסר את PBS והר התאים הרכבה בינונית המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole. בזהירות לשים את coverslip על המדיום הרכבה כך אין בועות אוויר משובץ. לחכות לפחות 3 h עבור התקשות של המדיום הרכבה לפני ניתוח בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

4. ניתוח של γH2AX ושל 53BP1 מוקדים

  1. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה: לנתח את מוקדים γH2AX ו 53BP1 ב גרעינים תא עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד מסננים דאפי, 488 אלקסה של Cy3 במהלך דימות-מטרה X 100 ההגדלה. שיא תמונות עם מצלמה ולעבד את התמונות עם תוכנת הדמיה המתאימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים הוא המדויק ביותר בין שלב G0/G1 לשלב G2 כאשר מוקדים γH2AX מופיעים כנקודות פלורסנט ברורים (איור 5A). לעומת זאת, ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים במהלך שלב S הינו מסובך γH2AX פאן-גרעיני התפזרו ספאקלס הנגרמת על ידי תהליך השכפול (איור 5B).

קיבוע התאים בוצעה עם 4% מחברים (10 דקות), permeabilization עם 0.1% Octoxinol 9 (10 דקות). מתנול ניתן להשתמש עבור ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח היווצרות ותיקון של DSB, בקשת רחבה של תחומי מחקר. פרמטרים קריטיים המשפיעים על התוצאה של הניסויים הם השלב של מחזור התא, הסוכנים המשמש את הקיבעון ואת permeabilization של התאים, הבחירה של הנוגדנים, ורכיבי חומרה ותוכנה של המיקרוסקופ זריחה.

ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הודגם על ידי שמתקדמות נורמלי fibroblasts של הקו תא NHDF. מוקדים γH2AX הופיע כנקודות פלורסנט נפרדות בתוך ה-G0/G1 G2 שלבים לעומת ספאקלס התפזרו ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט נתמך על ידי קרן לוקמיה קאררס חוסה (DJCLS 14 R/2017) הגרמני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום RPMIסיגמא-אולדריץ'R0883מדיום לתרבית תאים
יחס נתרן הפריןPZN 3029843  הפרין 5,000 יחב"ל / מ"ל
תמיסת נתרן כלורי 0.9%B. בראוןPZN 1957154רכיב בתמיסת המלאי נוגד הקרישה
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02מדיום לבידוד תאים חד-גרעיניים
תמיסת טריפסין 10Xסיגמא-אולדריץ'59427Cאנזים לדיסוציאציה של פיברובלסטים בתרבית תאים
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702בידוד של תאי אב מיאלואידים CD34+
שקופיות מיקרוסקופ אבחוןThermo ScientificER-203B-CE24שקופיות מיקרוסקופ
מגפוגה 1.0 RHeraeus75003060  צנטריפוגה שולחנית 
ציטוספין
מכסהHeraeus76003422מכסה לעבודה ללא מיקרו צינורות
מיכל Cyto מיכלHeraeus75003416Cyto עם 2 קדחים חרוטיים
מנשאקליפ Heraeus75003414מנשא להחזקת מיכל cyto ומגלשה
הכנס תמיכהHeraeus75003417תמיכה הכנס עבור אוחז במנשא קליפ
Triton X-100 (Octoxinol 9)Thermo Scientific85112חומר ניקוי לחדירות קרומי התאים
תמיסת אשלגן הידרוקסיד 1MMerck Millipore109107הכרחי להכנת תמיסת הפרפורמלדהיד
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'P6148חומר קיבוע
פוספט חוצץמלח סיגמא-אולדריץ'D8537תמיסת מלח מאוזנת
ChemiblockerMerck Millipore2170סוכן חוסם
עכבר חד שבטי אנטי וגמא; נוגדן H2AX (JBW301)Merck Millipore05-636נוגדן ראשוני לזיהוי &גמא; H2AX
נוגדן ארנב פוליקלונלי נגד 53BP1 (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-304נוגדן ראשוני לזיהוי 53BP1
Alexa Fluor 488-מצומד עז נגד עכבר נוגדןInvitrogenA-11001נוגדן משני
Alexa Fluor 555-חמור מצומד נוגדן נגד ארנבInvitrogenA-31572נוגדן משני
Vectashield הרכבה בינוניתמעבדות וקטורH-1200מכילה DAPI לצביעה של DNA
Axio Scope.A1Zeiss490035מיקרוסקופ פלואורסצנטי
קובייה מגניבה 1 מצלמת CCDMetasystemsH-0310-010-MSמערכת מצלמה להקלטה
דיגיטלית תוכנת IsisMetasystemsלא ישימהתוכנת מיקרוסקופ
מכשיר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994).
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Gamma H2AX53BP1Permeabilization SolutionCD34Gamma H2AXNonhomologous End Joining

מאמרים קשורים