כמו המיטוכונדריה הם רק אחוז קטן של תא צמח, הם צריכים טיהור למגוון רחב של מחקרים. המיטוכונדריה ניתן לבודד מתוך מגוון איברי הצמח על ידי המגון, ואחריו דיפרנציאלית וצפיפות צנטריפוגה מעבר צבע כדי לקבל חלק מיטוכונדריאלי נקיים במיוחד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
המיטוכונדריה הם מעורבים מסלולים מטבוליים רבים בצמחים, בייחוד את הייצור של אדנוזין טריפוספט (ATP) מפני החמצון של תרכובות מופחתת כגון nicotinamide אדנין dinucleotide (NADH), פלווין אדנין חיוניים organelles dinucleotide (FADH2). הביאור מלאה של הגנום תודרנית לבנה הקימה אותו כפי הנפוצים ביותר צמח מודל המערכת, ולכן הצורך לטהר את המיטוכונדריה ממגוון רחב של איברים (עלים, שורש או פרח) יש צורך לנצל במלואן את הכלים זה זמינות כעת עבור תודרנית ללמוד ביולוגיה מיטוכונדריאלי. המיטוכונדריה מבודדים המגון של הרקמה באמצעות מגוון של גישות, ואחריו שורה של צעדים צנטריפוגה דיפרנציאלית לייצר גלולה מיטוכונדריאלי גולמי זה נוסף מטוהרים באמצעות הדרגה צפיפות colloidal רציפה צנטריפוגה. Colloidal צפיפות החומר יוסר לאחר מכן על ידי מספר השלבים צנטריפוגה. החל מ- 100 גרם של רקמת העלה הטרי, 2-3 מ"ג של המיטוכונדריה ניתן באופן שגרתי להשיג. הנשימה ניסויים אלה המיטוכונדריה להציג שיעור טיפוסי של 100-250 nmol O2 דקות-1 מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי סה כ-1 (תלויי-NADH שיעור) עם היכולת להשתמש מצעים שונים, מעכבי כדי לקבוע אילו מצעים הינם להיות מחומצן והיכולת של חלופה, ציטוכרום oxidases מסוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה בידוד של המיטוכונדריה מן העלים תודרנית לבנה באמצעות מעברי צבע רציף צפיפות colloidal ומדידות יעיל הנשימה של הצמח מטוהרים המיטוכונדריה.
מבוא
ההיסטוריה של מחקר מיטוכונדריאלי הצמח חוזר מעל 100 שנה1. המיטוכונדריה שלם היו מבודדים לראשונה בתחילת שנות החמישים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. כניסתו של מעבר הדרגתי צפיפות colloidal בשנות ה-80 מותר המיטוכונדריה ולעצבנות ללא סבל osmotic ההתאמה. אמנם המיטוכונדריה מטוהרים הדרגתי מתאים לרוב המטרות, עקב הרגישות של ספקטרומטר מסה, אפילו יחסית ניתן להבחין וגורם לניתוקו עשויה להיות משויכת באופן בלתי הולם מיקום מיטוכונדריאלי2. שימוש של זרימה חופשית אלקטרופורזה יכולה להסיר את שניהם plastidic ו פראוקסיזום זיהום3, אבל חינם לזרום אלקטרופורזה היא טכניקה מאוד מיוחדים והוא לא נדרש עבור הרוב המכריע של מחקרים. יתר על כן, כאשר קביעת המיקום של חלבון שזה צריך להיות זכר את ליבה כפולה או פילוח מרובים של חלבונים מתרחש בתאים. מעל 100 חלבונים יישוב כפול מתוארים מהכלורופלסט/plastids, המיטוכונדריה4, מספר חלבונים ממוקד המיטוכונדריה, peroxisomes ידועים גם5. יתר על כן, המיקום מחדש של חלבונים תחת לגירויים ספציפיים, למשל סטרס חמצוני, הוא נושא המתעוררים תא ביולוגיה6. לפיכך, המיקום של חלבונים צריך להיחשב בהקשר של הביולוגיה למד, מגוון רחב של גישות משמשים כדי לקבוע ולאמת מיקום2.
המיטוכונדריה הם בדרך כלל מבודדים רקמות הצמח על ידי המגון, נדרש איזון בין לשבור קיר התא כדי לשחרר את המיטוכונדריה, לא מזיק המיטוכונדריה. באופן מסורתי, עם תפוחי אדמה, כרובית, המגון כולל באמצעות מכשירים ביתיים בלנדר/פאוואר להכין תמצית נוזלית במאגר עם רכיבים שונים כדי לשמור על פעילות. בידוד של המיטוכונדריה מן העלים אפונה, (חומר פופולרי מיטוכונדריאלי בידוד באמצעות שתילים צעירים (~ 10 ימים הישן), מנצל בלנדר כדי lyse תאים כמו החומר העלה הוא רך. עם הזמינות של תודרנית לבנה T-DNA insertional הנוק-אאוט קווים, הצורך להיות מסוגל לטהר את המיטוכונדריה לבצע מחקרים פונקציונלי יש המתחייבות בפיתוח שיטות כדי לבודד המיטוכונדריה עלים, שורש או פרח רקמות. בסך הכל השיטות שפותחו עבור צמחים אחרים עבד טוב7, עם הבונוס שחיקה של החומר צריך להיות מותאם. עבור תודרנית זה ניתן להשיג במגוון דרכים (ראו להלן), ו שונה בין סוגי רקמות (הבסיס לעומת לירות). ניתן למטב את השימוש במעבר מתמשך גם כמו הצפיפות של המיטוכונדריה של איברים שונים או שלבים התפתחותיים אומר שהם יכולים להעביר באופן שונה. לפיכך, להפרדה מקסימלית הצפיפות של מעבר הצבע יכול להיות מעודן כדי להבטיח כדי להשיג הפרדה הכי טוב.
פעם מטוהרים המיטוכונדריה יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים, כולל ניסויים ספיגת חלבונים ו tRNA, מבחני פעילות האנזים, שרשרת הנשימה מדידות וניתוחים תספיג חלבון. המיטוכונדריה מבודד יכול לשמש גם עבור ניתוחים ספקטרומטר מסה של חלבון שפע. יישוב התגובה מרובים ניטור ניתוחים (MRM) מאפשר כימות של המוגדר חלבונים, אך דורשים פיתוח משמעותי וזמינותו. לעומת זאת, כמת על ידי דימתיל או אחרים תוויות איזוטופ8, מספקת גישה גילוי בזיהוי ההבדלים על פני פרוטאום כל יכול לשמש כדי לחשוף תובנות ביולוגי הרומן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה משמש את ניתוקה של המיטוכונדריה ללא פגע מן האיברים תודרנית לבנה גדל על קרקע באמצעות מעברי צבע צפיפות colloidal רציפה. כל הליכים בעקבות אוסף המוזיאון של החומר, מתבצעות ב 4 º C.
1. הכנת השחזה מאגר בינוני, שטיפת ופתרונות הדרגתיות
- הכנת 300 מ של שיוף בינונית (מינוס ascorbate ציסטאין), 200 מ ל x 2 שטיפת מאגר לכל טבלה 1 יום אחד לפני הבידוד, לשמור אותם קר ב 4 º C.
הערה: להוסיף סודיום אסקורבט ו- L-ציסטאין (בסיס חינם) ריכוז הסופי של 17.84 מ"מ ו 20.36 מ"מ, בהתאמה, למדיום שחיקה בבוקרו של הבידוד. אם המיטוכונדריה נועדו לשמש תספיג או מקורי כחול-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ניתוחים, להמציא 2 x שטיפת מאגר ללא BSA. - להכין מילויים הדרגתיים בבוקרו של בידוד מיטוכונדריאלי (איור 1 , טבלה 1).
- להפוך את הפתרונות מעבר צבע קל שני בקבוקונים; 35 מ של כל אחת מספיקה עבור שני צינורות הדרגתיות.
- לשטוף את התאים של המשפך מעבר צבע, צינורות PVC סחרור מים יונים ולהבטיח זרימה דרך הצנרת של כל אבובים.
- מניחים 2 צנטריפוגה צינורות (50 מ"ל) בזווית קלה על הקרח עם שקעים ממברנות לצנרת PVC מודבקות בתוך הצינורות כדי להבטיח שהפתרון הדרגתיות רץ במורד הצד של הצינורות.
- סגור את הקשר בין התאים הפנימיים והחיצוניים (שחור הידית למטה). במקום המשפך מעבר צבע על פגים עם בר קטן מערבבים בתוך החדר הפנימי.
- שופכים את הפתרון הדרגתיות כבד מ"ל 35 אל החדר הפנימי (קאמרית עם אבובים עודפים). לוותר על הפתרון הדרגתיות כבד לתוך צנטריפוגה שני הצינורות המוטלות על הקרח עד חצי נשאר עם קצב משאבת סחרור מוגדר מהר (300 מ ל/h).
- שופכים את הפתרון מעבר צבע בהיר מ"ל 35 אל החדר החיצוני (קאמרית ללא צינור עודפים). לפתוח את הקשר בין התאים (ידית דחיפה שחור למעלה באמצע הדרך) ולאפשר פתרונות לערבב בעדינות. מערבבים את הפתרונות באמצעות של פגים.
- לאפשר את הפתרונות לפעול באיטיות (60 מ ל/h) עד כל המיקס הדרגתיות ויתרה מן התאים וכתוצאה מכך שני 0 - 4.4% (w/v) פוליוינילפירולידון (PVP) מילוי צינורות. לשמור על מעברי צבע על הקרח עד מוכן לשימוש ב- 2.12 שלב.
הערה: לאחר מעבר הצבע הוכן, למהול 2 x שטיפת בינוני 1 x עם מים prechilled-יונים, לשמור על קור-4 מעלות צלזיוס.
2. המגון ובידוד מיטוכונדריאלי
- רוזט כל רקמות מצמחים תודרנית 4 - בן שבועיים גדל על קרקע עם מספריים לחתוך, צמחים 80 לפחות יהיה צורך הכנה 1.
הערה: בת 10-14 יום מים תרבויות, מינימום 5 סירים/הכנה, או 2 - בן שבועיים בשתילים שגדלו על פלטות אגר Murashige & Skoog הבזליים מלח תערובת (MS), מינימום של 4 צלחות, עשוי לשמש גם. - מניחים מחצית החומר צמח כי נחתך לחתיכות קטנות ב טרום מקורר-4 ° C גדול ומכתש עם 75 מ של שחיקה בינוני (טבלה 1), לטחון בהרחבה למשך מספר דקות עד אין חתיכות גדולות של רקמות הם עזבו.
- טרום רטוב 4 שכבות של חומר סינון (22-25 µm גודל הנקבוביות) עם טחינת בינוני ולסנן homogenate דרך 4 שכבות של חומר סינון דרך משפך פלסטיק לתוך בקבוקון חרוט 500 מ"ל.
- לטחון את החצי הנותר של הרקמה עם עוד 75 מ"ל של שחיקה בינוני.
- לשלב homogenates את החומרים סינון וסינון ככל האפשר homogenate דרך.
- לטחון הרקמה הנותרת שנותרו על חומר סינון שוב עם mL 150 הנותרים של שחיקה בינוני, מסנן שוב לתוך הבקבוק חרוט 500 מ"ל.
- Centrifuge את homogenate מסוננים 8 צינורות פלסטיק צנטריפוגה טרום מקורר 50 מ ב g 2,500 x ב 4 ° C ברוטור זווית קבועה במשך 5 דקות.
- שופכים את תגובת שיקוע לתוך צנטריפוגה נקי צינורות (50 מ ל; להימנע מהפרעה בגדר ירוק), צנטריפוגה ב g x 17,500 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ברוטור זווית קבועה.
- למחוק הכל מלבד < 3 מ"ל של תגובת שיקוע על ידי השאיפה (או יוצקים בעדינות את מבלי להפריע בגדר). בעדינות resuspend בגדר, תגובת שיקוע שיורית תוך שימוש במכחול בסדר קטן.
- להוסיף 10 מ ל 1 x מאגר לשטוף כל שפופרת, לשלב 4 צינורות לתוך צנטריפוגה נקי 1 שפופרת (קרי, והתוצאה 2 צינורות).
- למלא את הצינורות האלה 1 x מאגר לשטוף עד 50 מ"ל וחזור על שלבים 2.7-2.9.
- בריכת כדורי מיטוכונדריאלי גס 1 צינור באמצעות טפי ומעוררים אחיד במכחול בסדר (כמות קטנה של שטיפת המאגר עשוי לשמש אבל עוצמת הקול הסופי צריך להיות פחות מ- 3 מ"ל כדי להתאים על גבי המילוי ההדרגתי). בעדינות שכבה ההשעיה מיטוכונדריאלי עם טפטפת על גבי 2 רציפים 0 - 4.4% (w/v) PVP מעברי הצבע.
- לאזן את צינורות לפי משקל (באמצעות 1 x מאגר לשטוף), צנטריפוגה ב 40,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ודא ההפסקה מבוטלת. המיטוכונדריה להגר להקה ליד החלק התחתון של הצינור, או עשויים להיות נוכח הפתרון כבד בחלק התחתון של הצינור (המזוהה על-ידי להקת בהיר, צהבהב; איור 2).
- הסר בזהירות את 5 ס מ העליון של פתרון מעל הלהקה מיטוכונדריאלי על ידי השאיפה.
- להפיץ את הפתרון הנותרים המכילים המיטוכונדריה לתוך 2 צינורות נקי ומלא עם 1 x מאגר לשטוף. פזר באופן שווה צפיפות colloidal הדרגתי של המיטוכונדריה על ידי כיסוי הפה של הצינור עם סרט פרפין פלסטיק, היפוך מספר פעמים. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב x 31,000 g ב 4 ° C עם בלימה איטי.
הערה: לפני צנטריפוגה, ודא כי המיטוכונדריה, מעבר הצבע צפיפות colloidal הנותרים מפוזרים באופן אחיד. אחרת, מעבר הצבע צפיפות colloidal יכול להתרכז בתחתית הצינורית ולמנוע pelleting של המיטוכונדריה. - הסר את תגובת שיקוע על ידי מילוי ברכבת התחתית עם שטיפת 1 x מאגר עד 50 מ ל, היפוך שוב כדי להבטיח ערבוב, שאיפה. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב g x 31,000 ב 4 ° C עם בלימה איטי.
- וארוקן את תגובת שיקוע ולאסוף כדורי מיטוכונדריאלי לקטן אמצעי אחסון (~ 500 µL) ככל האפשר בעזרת פיפטה ששונה טיפים µL 200 (לחתוך את הקצה קצת מעל סופו כדי להגדיל את הפתח שלה). מקום המיטוכונדריה לתוך צינור 1.5 mL ולשמור בקירור לשימוש מיידי או חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: אם המיטוכונדריה ישמש עבור נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), בסון-דף, או ניתוחים immunoblot, להשתמש 1 x שטיפת מאגר ללא BSA עבור מנקי הסופי (קרי, שלב 2.15 2.16). - לקבוע ריכוז חלבון של המיטוכונדריה באמצעות שיטת ברדפורד.
הערה: עבור aliquots צנטריפוגה בסון-דף 4 ° C, וכן חנות גלולה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש. למדידות צריכת חמצן, המיטוכונדריה טרי מבודד היחיד יכול לשמש.
3. מדידות צריכת חמצן
הערה: צריכת חמצן על ידי טרי מבודדים צמח המיטוכונדריה ניתן לנתח עם אלקטרודה חמצן קלארק-סוג, המאפשרים קביעת intactness מיטוכונדריאלי, ציטוכרום c מסלול פעילות, והפעילות מסלול חלופי.
- התקנת תוכנה
- התקן מורשה חמצן ניטור תוכנה במחשב המשמש למדידות צריכת חמצן.
- הכנה של נשימה בינוני, מצעים, פתרונות כימיים מניות האלקטרודה חמצן מסוג קלארק
- להכין את הנשימה בינוניים (300 מ"מ סוכרוז, 10 מ מ NaCl, 5 מ מ ח'2PO4, 2 מ מ MgSO4, 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA), 10 מ מ מלון טס (pH 7.2)) המשמש עבור מבחני צריכת חמצן.
- הכינו מצעים, מעכבי ו effectors למדידת נשימה מיטוכונדריאלי (טבלה 2). אלה ניתן להכין קודם לכן, המאוחסנים ב-20 ° C.
הערה: לנטרל את ה-pH של פתרונות חומציים כגון חומצות אורגניות ל pH 7.0 באמצעות NaOH לפני השימוש. - חמים המדיום נשימה עד טמפרטורה זהה כמו תא assay (25 ° C).
- להרכיב האלקטרודה חמצן קלארק-סוג כמפורט בפרוטוקול של היצרן.
- מקום 1 מ"ל אוויר רווי מים (מים אוויר רווי מתקבל ע י ניעור נמרצות כמות קטנה של מים יונים בבקבוקון חרוט גדולים) לתא המדידה. כדי לעבור על בחישה את, לחץ על לחצן "מערבב מהירות". לחץ על לחצן "על" ולהגדיר את מהירות קדירות 65 סל ד. לחץ על "אישור" כדי להמשיך. מערבבים את המים באופן רציף ב 25 º C.
- כיול של אלקטרודה חמצן
- חממו את המים אשר ישמשו לצורך כיול עד טמפרטורה זהה כמו תא assay (25 ° C).
- המתן הנוכחי לייצב לכייל את אלקטרודה חמצן.
- כדי להפעיל את כיול של האלקטרודה חמצן, לחץ על לחצן "כיול", בחר "כיול שלב נוזלי" ולאחר מכן "אוויר רווי מים."
- חלון חדש ייפתח (חמצן כיול (שלב נוזלי) - שלב 1 מתוך 5). בחר את הערוץ כדי לכייל (הערוץ שתיבת בקרת אלקטרודה מחוברת) והזן משתנים (ערכה "טמפרטורה הקאמרית" עד 25 ° C, "לחץ אטמוספרי" כדי 101.32 kPa). לחץ על "אישור" כדי להמשיך.
- למחרת שלב (שלב 2 מתוך 5), הגדרת המהירות בחישה (65 סל ד) ולחץ על "אישור" כדי להמשיך.
- בשלב 3 של 5, חכו לאות להגיע מישור. המונח "מישור הגיע, לחץ על אישור כדי להמשיך" יופיע בתיבה. לחץ על "אישור" כדי להמשיך.
- בשלב 4 של 5, להקים אפס החמצן בתא על-ידי הוספת 5 מ"ג נתרן dithionite. לחץ על "אישור" כדי להמשיך.
הערה: ירידה בריכוז חמצן צריך להיות גלוי האיתור, כדאי להגיע 0. - בשלב האחרון של כיול (שלב 5 5), חכו לאות להגיע מישור. המונח "מישור הגיע, לחץ על אישור כדי להמשיך" יופיע בתיבה. לחץ על "אישור" כדי להמשיך.
- לחץ על "שמור כיול" כדי להציל את הכיול. חלון חדש ייפתח. לחץ על "אישור" כדי לאשר כדי להציל את הכיול החדש עבור תיבת בקרת החמצן.
הערה: לאחר כיול מוצלחת, תיוג "החמצן (nmol/mL)" יופיעו בציר ה-y. - לאחר כיול, לנקות את התא מדידה על ידי שטיפה לחדר עם מים (לפחות 5 - 10 פעמים) כדי להבטיח ניקוי נאות. מקום 1 מ"ל של נשימה בינוני לתוך מדידת קאמרית ולאפשר את הממברנה כדי equilibrate לכמה דקות עד המעקב צריכת החמצן היא לינארית.
- להתאים את קנה המידה של צריכת חמצן המעקב כדי לזכות בשדה ראייה טוב במדרון. לחץ על "XY זום" ולהזין משתנים (מוגדר "חמצן" 0 - 300 ו "ציר הזמן" 0 - 45 min).
- קביעת תקינות מיטוכונדריאלי
- עם הבוכנה פתוח, להוסיף 970 µL נשימה אוויר רווי בינוני תא התגובה.
- להוסיף 30 המיטוכונדריה µL מבודדים או 150 µg של חלבון מיטוכונדריאלי הכולל כפי שנקבע לאחר בידוד המיטוכונדריה (חלבון סה כ צריך להיכלל חישובים לאחר מכן) לתא תגובה באמצעות פיפטה עם טיפ לחתוך.
- מערבבים את המתלים מיטוכונדריאלי באופן רציף באמצעות של פגים בר (65 סל ד) 25 ° c אוויר-עיתוני הפתרון.
- לאטום את התא עם הבוכנה, לחץ על "התחל הקלטה" כדי להקליט את צריכת החמצן, לאפשר מעקב צריכת חמצן לייצב (1-2 דקות).
- לקבוע את שיעור צריכת החמצן באופן ידני לאחר הוספת ascorbate 10 מ מ ו- 25 מיקרומטר ציטוכרום c 5 דקות לקבל את שיעור "לפני שהוא עושה".
הערה: כדי להדביק תווית התוספת של מצעים, מעכבי effectors ישירות בהאיתור, לחץ על לחצן "הוסף סימן אירוע" והזן ייעוד תווית התואם. לחץ על "אישור" כדי להמשיך. - לקבוע את שיעור צריכת החמצן באופן ידני עבור 3 דקות לאחר הוספת חומרי ניקוי 0.05% (v/v) לתת שיעור "אחרי שהוא עושה". לחץ על "עצור הקלטה".
- לחץ על לחצן "המחירים של שינוי טבלה". 2 סמנים תופיע קווים אנכיים על המסך גרף. לחץ וגרור את הזוג של קצב סמנים למיקומים הנדרשים ב המעקב כדי להגדיר את מרווח הזמן של קצב. הזז את מרווח הזמן קצב לאורך המעקב באמצעות הסמן השמאלי קצב. להגדיר את מרווח הזמן של קצב עצמו באמצעות הסמן התעריף המתאים. החמצן ניטור תוכנה אוטומטית משרטט קו של מיטבית בין שני סמנים בעת הזזת את סמנים מרווח קצב לאורך המעקב.
- ברגע קצב הנסיעה מרווח והמיקום הוגדרה, להזין את הקצב הטבלה עם קליק ימני על 1 של סמנים 2, בחר "הוסף תעריף לשולחן". לחץ על הלחצן 'הוסף' כדי לאשר כדי להציג את הקצב על השולחן הראשי קצב.
- לחשב מיטוכונדריאלי תקינות על-ידי חלוקת הקצב "לפני שהוא עושה" מאת "אחרי דטרגנט" הקצב, המבוטא באחוזים, ולחסר זה מ- 100.
- הנחישות של הנשימה מיטוכונדריאלי
- עם הבוכנה פתוח, להוסיף µL 970 נשימה אוויר רווי בינוני תא התגובה. להוסיף 500 ATP מיקרומטר ו 30 µL מבודדים המיטוכונדריה או µg 150 סך החלבון מיטוכונדריאלי באמצעות פיפטה עם טיפ לחתוך למדיום נשימה בבית הבליעה התגובה.
- מערבבים את המתלים מיטוכונדריאלי באופן רציף באמצעות של פגים בר (65 סל ד) ב 25 º C.
- סגור את הבוכנה, לחץ על "התחל הקלטה" כדי להקליט את צריכת החמצן, ולהמתין עד 1-2 דקות עבור קצב צריכת החמצן לייצב (כאשר המעקב צריכת חמצן לינארית). הוסף 5 מ מ succinate. להקליט שיעור צריכת החמצן למשך כ 2 דקות.
הערה: כדי להדביק תווית התוספת של מצעים, מעכבי effectors ישירות בהאיתור, לחץ על לחצן "הוסף סימן אירוע" והזן ייעוד תווית התואם. לחץ על "אישור" כדי להמשיך. - להוסיף 1 מ"מ אדנוזין diphosphate (ADP). להמשך ההקלטה קצב צריכת החמצן למשך 2 דקות.
- להוסיף 1 מ"מ NADH. לרשום את שיעור צריכת החמצן למשך 4-8 דקות. שיעור זה הוא הקיבולת של נשימה דרך ציטוכרום אוקסידאז.
- להוסיף 1 מ"מ אשלגני (KCN) (או 2.5 מיקרומטר myxothiazol או 5 מיקרומטר antimycin A) כדי לעכב את המעבר ציטוכרום c , ולהמשיך להקליט למשך כ 2 דקות להתבונן צריכת חמצן דרך אוקסידאז חלופי.
- הוסף 5 מ מ dithiothreitol (DTT) ו 10 מ מ פירובט להפעיל באופן מלא את אוקסידאז חלופי. להמשיך להקליט למשך 5-7 דקות: זה הקיבולת של אוקסידאז חלופי.
- הוסף מספר n-propyl 500 מיקרומטר (npg ב), להקליט למשך 2 דקות. זה מעריך קצב צריכת החמצן שיורית, זה לא יכול להיות מעוכבים מבחינה כימית. הפחתה בקצב הזה מן השיעורים אחרים הקליטו, כפי שהוא לא עשוי להיות מיטוכונדריאלי במקורם. צריכת החמצן שעדיין המתרחשים לאחר עיכוב של ציטוכרום c , AOX השביל (על-ידי KCN ו npg ב) סביר מאוד לבוא מן ההווה כמו מזהמים המיטוכונדריה מבודד9peroxidases.
- לחץ על "עצור הקלטה".
- לחץ על לחצן "המחירים של שינוי טבלה", להזין את הקצב הטבלה עם קליק ימני על אחד של שני סמנים, ובחר "להוסיף את טבלת תעריפים". לחץ על הלחצן 'הוסף' כדי לאשר כדי להציג את הקצב על השולחן הראשי קצב.
הערה: בעת הוספת effectors מומס ממיסים אורגניים (למשל., antimycin A, npg ב, myxothiazol), החדר ואת הבוכנה חייבים לשטוף עם אתנול ומים אז כדי להבטיח ניקוי נאות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות פרוטוקול זה, היינו מסוגלים לזהות חלבונים מיטוכונדריאלי שונה על-ידי מרחביות-דף immunoblotting. כפי שמוצג באיור 3 א, חלבון מבודד מרקמות תרבות מים מספיקה לזהות להקה חלש (2 µg). עוצמת האות מגדילה באופן יחסי כמויות טעון. עבור המיטוכונדריה מבודד מן הרקמות גדל על צלחות (איור 3B), התגובה מלחיצה אור ניתן לנתח טיפול שונים אחרים על-ידי immunodetection עם נוגדנים אוקסידאז חלופי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בדרך כלל, בידוד של המיטוכונדריה מ תודרנית יוצא תשואות עד 3 מ ג של המיטוכונדריה כ 80-100 3 - 4 - בן שבועיים צמחים, למרות התשואות של יותר מ 5 מ"ג לעיתים קרובות תושג עם טחינת יסודית. התשואה משתנה עם תנאי הגידול ומקטינות באופן דרמטי עלים senesce, למרות המיטוכונדריה מבנה שנראה טוב להישמר במהלך הזדקנות ביולוגית9. אחת התכונות הכי קריטי כדי להשיג תשואה טובה הוא השיטה של שחיקה כדי lyse תאים לשחרר את המיטוכונדריה. בעוד מספר מכשירים שחיקה מכנית הינם זמינים לרכישה, עבור תודרנית טחינת ב ומכתש משיגה תוצאות טובו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי אוסטרליה מחקר המועצה מרכז של מצוינות הצמח אנרגיה הביולוגיה CE140100008, אוסטרליה מחקר המועצה העתיד לאגודה (FT130100112) MWM, פיודור Lynen מחקר לאגודה (אלכסנדר פון הומבולדט קרן, גרמניה) כדי JS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| אנטימיצין | A סיגמא-אולדריץ' | A8674 | כימיקל, מתמוסס בנוגדני אתנול |
| AOX | מ- Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| אלבומין סרום בקר כימי (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | |
| Chemical Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | |
| קריטריון כימי ג'לים טרומיים ללא כתמים 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | כימי |
| ציאניד | סיגמא-אולדריץ' | 60178 | כימי |
| ציטוכרום c | סיגמא-אולדריץ' | C3131 | כימי |
| Difco אגר, מגורען | BD Biosciences | 214530 | כימי |
| דיתיוטרייטול | סיגמא-אולדריץ' | D0632 | כימי |
| EDTA מלח דיסודיום | סיגמא-אולדריץ' | E5134 | כימי |
| גמבורג B-5 בסיסי בינוני | Austratec | G398-100L | כימי |
| תמיסת ויטמין Gamborg (1000x) | Austratec | G219-100ML | |
| עיזים כימית נגד עכבר IgG (H + L)-HRP מצומד | מעבדות Bio-Rad | 1706516-2 מ"ל עיזים | כימיות |
| נגד ארנב IgG (H + L)-HRP מצומד | מעבדות ביו-ראד | 1706515-2 מ"ל | |
| כימי L-ציסטאין | סיגמא | C7352-100G | כימי |
| מגנזיום גופרתי | סיגמא-אולדריץ' | 230391 | כימיקלים |
| מוראשיג & Skoog Basal Salt Blend (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, מתמוסס באתנול |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | |
| Chemical Ndufs4 נוגדן | מ-Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, מתמוסס באתנול |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | שיפוע כימי, צפיפות קולואידית |
| פוליוויניל פירולידון (PVP40) | סיגמא-אולדריץ' | PVP40 | כימי |
| אשלגן ציאניד | סיגמא-אולדריץ' | 60178 | אשלגן פוספט |
| כימי מונו-בסיסי (KH2PO4) | סיגמא-אולדריץ' | P5655 | כימי |
| פירובט | סיגמא-אולדריץ' | P2256 | |
| נתרן כלורי | Chem-Supply | SA046 | |
| נתרן דיתיוניט | סיגמא-אולדריץ' | 157953 | כימי |
| נתרן L-אסקורבט | סיגמא | A4034-100G | כימי |
| סוקסינט | סיגמא-אולדריץ' | S2378 | |
| כימי סוכרוז | כימי SA030 | כימי | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | כימי |
| טטרסודיום פירופוספט (Na4P2O7 · 10H2O) | סיגמא-אולדריץ' | 221368 | כימי |
| טרנס-כתם טורבו RTA Midi ערכת העברת ניטרוצלולוזה | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | |
| כימי טריטון-X 100 | סיגמא-אולדריץ' | X100 | כימיקלים, חומר ניקוי |
| מגיב חוסם מערבי | סיגמא | 11921681001 | |
| איזון | מטלר טולדו | XS204 | ציוד |
| כוסות | Isolab | 50 מ"ל | |
| צנטריפוגה | בקמן קולטר | Avanti J-26XP | ציוד |
| צינורות צנטריפוגה | Nalgene | 3117-9500 | ציוד |
| סירקולטור | Julabo | 1124971 | מצורף ל תא אלקטרודה חמצן |
| בקבוק חרוטי | Isolab | 500 מ"ל | |
| טפטפת | 3 מ"ל | ||
| רוטור זווית קבועה | בקמן קולטר | JA25.5 | |
| משפך | לכל Alimenti | 14 ס"מ | לסינון |
| שיפוע מזיגה | Bio-Rad | 165-4120 | להכנת שיפועים |
| בוחש מגנטי ATE | VELP Scientifica | F20300165 | ציוד |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | חומר סינון |
| טיט ועלי | ג'יימי אוליבר | גרניט, ציוד 6 אינץ' | |
| O2view | Hansatech Instruments | תוכנת ניטור חמצן | |
| Oxygraph Plus מערכת | Hansatech Instruments | 1187253 | אלקטרודת חמצן מסוג קלארק |
| אמן מכחול | בחירה ראשונה | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | סרט פרפין מפלסטיק |
| משאבה פריסטלטית | Gilson | F155001 | להכנת שיפועים |
| צינורות פריסטלטיים PVC | Gilson | F117930 | להכנת שיפועים |
| אמבט מים | VELP Scientifica | OCB ציוד |
מקורות
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
