מאמר שיטה

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

DOI:

10.3791/56628

⸱

2 במרץ 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות המוח האנושי ממשיך דרך סדרה של תהליכים מתוזמר בדיוק, בשלבים מוקדמים מכובד על ידי התפשטות, הגירה, תוצר neurite; ובשלבים מאוחרים יותר מאופיין תוצר האקסון/דנדריט היווצרות סינפסה. בהפרעות התפתחותיות, לעיתים קרובות אחד או יותר של תהליכים אלה הן משובשות, שמוביל חריגות בתוך מבנה המוח ותפקודו. עם כניסתו של האדם pluripotent המושרה תא גזע (hiPSC) טכנולוגיה, חוקרים עכשיו יש אטומטי בשפע של תאים אנושיים, כי יכול להיות מובחן כמעט כל סוג התא, לרבות נוירונים. תאים אלה ניתן ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם בפתוגנזה של המחלה. מספר פרוטוקולים באמצעות hiPSCs ליצור מודל המחלה מנוטלי שימוש סופני הבדיל נוירונים או שימוש תרבות 3D מערכות הנקרא organoids. בעוד ששיטות אלה הוכיחו שלא יסולא בפז לומד פתוגנזה מחלות אנושיות, ישנם מספר חסרונות. הבידול של hiPSCs לתוך הנוירונים דור של organoids ממושך ויקר תהליכים שיכולים להשפיע מספר הניסויים ולא משתנים אשר יכולים להיות מוערך בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בנוסף, בעוד הנוירונים הפוסט-mitotic ו organoids מאפשרים בחקר תהליכים הקשורים למחלות, לרבות תוצר דנדריט, synaptogenesis, הם למנוע בחקר תהליכים מוקדמים יותר כמו התפשטות והעברה. הפרעות התפתחותיות, כגון אוטיזם, שפע ראיות גנטיות, פוסט-מורטם מציינת פגמים בתהליכים התפתחותיים מוקדם. קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסיה מאוד proliferative תא, ייתכן מודל מתאים בו לשאול שאלות על תהליכים ontogenetic, מחלת חניכה. אנחנו עכשיו להרחיב את מתודולוגיות למד מן הלומדים פיתוח בתרבויות קורטיקלית עכבר ועכבר כדי NPCs אנושי. השימוש NPCs מאפשר לנו לחקור פנוטיפים הקשורים למחלות ולהגדיר כיצד משתנים (למשל, גורמי גדילה, סמים) השפעה התפתחותית תהליכים שונים כולל התפשטות, העברה של בידול רק אחרי כמה ימים. בסופו של דבר, כלים זה יכול לשמש באופן הדירים תפוקה גבוהה לזיהוי מנגנוני מחלות ספציפיות והן פנוטיפים בהפרעות התפתחותיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש של אורגניזמים פשוטים ומודלים העכבר יש מבואר על מנגנוני התפתחות המוח בסיסיים, כמו גם בפתוגנזה של המחלה. למרות ההתפתחויות הללו, האטיולוגיה של רבים מנוטלי הפרעות נשאר קשה להבנה, כי לא כל הממצאים אורגניזמים פשוטים הרלוונטיים ישירות היבטים מורכבים של מחלות אנושיות. יתר על כן, למורכבות רבה יותר של המוח האנושי לעיתים קרובות מקשה על מודל ההתפתחות האנושית, הפרעות בבעלי חיים. עם התפתחות, התקדמות הטכנולוגיה האנושית pluripotent המושרה בתאי גזע (hiPSCs), תאים סומטיים יכול להיות מחדש לתוך תאי גזע, ואז הבדיל לתוך תאים עצביים ללמוד מחלות אנושיות. ההתקדמות בטכנולוגיות hiPSCs ו "omic" (גנומיקה, transcriptomics, פרוטאומיקס, גליקומיקס) מבטיח לחולל מהפכה להבנת התפתחות המוח האנושי. טכנולוגיות אלה כעת לבצע אפשרי בגישה "דיוק רפואה" אפיון המחלה מנוטלי על בסיס מקרה לגופו.

להדק הנוכחי בתחום הדוגמנות-מחלת hiPSC הוא להתמיין לתאים ספציפי יחוברו עצביים ב טפט או לשימוש מערכת תרבות 3D בשם של תא צורב רוצה להתרכז בהיבטים של המוח פיתוח1,2, 3. מערכות אלו היה בעל ערך רב בלימודים, לחשוף את ההיבטים הייחודיים של ההתפתחות האנושית, מחלת4,5,6,7. עם זאת, תרבויות עצביים והן organoids לעיתים קרובות דורשים בכל מקום שבועות עד חודשים בתרבות לפני שהם מוכנים ללמוד. הטבע זמן רב של פרוטוקולים אלה וכמות המשאבים הדרושים כדי לשמור על שמערכות התרבות אלה מגבילים לעתים קרובות מספר ניסויים שניתן לבצע ואת מספר משתנים (כמו גורמי גדילה או תרופות), אשר יכול להיבדק. יתר על כן, מחקרים רבים הנוירונים הפוסט-mitotic וחומר organoids התמקדו תהליכים כגון היווצרות תוצר או סינפסה דנדריט, אשר מתרחשים מאוחר יותר פיתוח. בעוד תהליכים אלה היו מעורבים הפתולוגיה של הפרעות התפתחותיות כגון אוטיזם, סכיזופרניה, קודם התפתחותית אירועים שמתרחשים לפני סופי בידול עצביים חשובים גם עבור מחלת פתוגנזה8 ,9,10,11,12,13. אכן, גנומית מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תקופת אמצע-עוברית, אשר מורכב של התפשטות, תוצר תהליך ההעברה, חשוב במיוחד אוטיזם פתוגנזה11,14. לכן, חשוב ללמוד גזע עצביים אוכלוסיות תאים קדמון כדי להבין טוב יותר תהליכים קודמות אלה. תא צורב מערכות, אשר מסכם את הדברים נחשב טוב יותר התפתחות המוח האנושי בגלל מבנה מאורגן ואופיים תלת-ממד, מכילות בריכת קדמון זה יש כבר מנוצל ללמוד כמה אירועים קודמות אלה. עם זאת, האוכלוסייה קדמון organoids הוא לרוב דליל, יותר כמו תאי גליה רדיאליים מ עצבית גזע או קדמון תאים5,15. לכן, יהיה זה מועיל יש שיטת תפוקה גבוהה ללמוד בשלבים המוקדמים של neurodevelopment באוכלוסיה פעיל proliferative תא.

במעבדה, יצרנו פרוטוקול העושה שימוש hiPSC-derived קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסייה מעורבת של גזע עצביים, ובתאים זה מאוד המקדימות, ללמוד תהליכים התפתחותיות כגון התפשטות, נדידת תאים, ו הרחבת תהליך ראשוני (neurite). מבחני אלה פותחו מתוך טכניקות המשמשות במעבדה שלנו במשך עשרות שנים ללימוד בהצלחה neurodevelopment עכבר ועכבר תרבויות קורטיקלית16,17,18,19,20, 21,22,23. חשוב, זה גם הראו כי פנוטיפים ואת אותות התקינה מוגדרת במערכות תרבות עכבר ועכבר הם מאוד חזוי של מנגנונים כי הם פעיל ויוו, המציינת את הערך של טכניקות אלה16, 17,18,19,24. לאחר הבידול הראשונית של hiPSCs כדי NPCs, שיטות אלה מאפשרים לנו ללמוד תהליכים פיתוחיים חיוני תוך מספר ימים. שיטות אלה יש יתרונות רבים: (1) הן דורשות ציוד מתוחכם יותר, קלים ליישום, משכפל ניסיוני הרבות (2) יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של זמן, מתן אישור מהיר הפארמצבטית של תוצאות, ו- (3) ניתן לבחון את תרבות משתנים כגון מטריצות ציפוי, ההשפעות של גורמי גדילה, פעילות של תרופות במהירות וחסכוני. יתר על כן, אנו מנצלים התפקיד ומבוססת של גורמי גדילה חוץ-תאית כמבקרי קריטי של תהליכים התפתחותיים מגוונים. NPCs נחשפו לבחירת אותות התפתחותית ישירות לעורר אירועים כמו התפשטות, תוצר neurite נדידת תאים, ומצאו שלהם לשפר את היכולת לזהות פגמים שאינם לכאורה תנאי הבקרה19 , 25 , 26 , 27 , 28. כמו כן, להקל על הערכת סמים מספק שדרה חזק לאמץ טכניקות רפואה דיוק כדי לבדוק את היעילות של התערבויות טיפוליות שונות. לפיכך, פרוטוקול זה מקלה על תפוקה גבוהה, לשחזור, ומתודולוגיה פשוטה ללמוד מוקדם התפתחות המוח בפתוגנזה של המחלה, את פוטנציאל ההשפעות המיטיבות של גורמי גדילה וסמים על פנוטיפים התפתחותיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. נהלי בטיחות ותחזוקה אבטחה הקבינט

  1. נהלי בטיחות אבטחה ברמה-2 (BSL-2)
    1. פעל לפי ההנחיות של המוסד על עבודה עם חומרים BSL-2. תשליך BSL-2 חומרים על-פי נוהלי המוסד. מציינים חדרים וציוד המשמשים עבור חומרים BSL-2. ללבוש כל ציוד מגן אישי (PPE), כולל חלוק וכפפות.
  2. אבטחה לארון תחזוקה
    1. השתמש ארון אבטחה מאושר לשימוש בחומרים ברמה BSL-2.
    2. להדליק את האור האולטרה סגול באבטחה הקבינט למשך לפחות 15 דקות ולאחר מכן לרסס משטחים עם אקונומיקה 10% הפתרון. לאפשר הפתרון אקונומיקה כדי לשבת למשך 15 דקות לנקות את הארון, להפעיל את זרימת האוויר לפני השימוש.
  3. Tritiated רדיואקטיבי [3H]-נהלי בטיחות תימידין (טריטיום)
    הערה: טריטיום הוא קטגוריה 5 רדיואקטיבי מקור, 'סביר להיות מסוכן' קטגוריה. ההנחיות של המוסד לעבודה עם קרינה רדיואקטיבית. מוסדות מסוימים עשויים לדרוש אישורי או מאפשר לטפל טריטיום.
    1. מקבלים הכשרה מהמוסד כיצד לטפל כראוי ותיפטר טריטיום. השלך פסולת רדיואקטיבית בתוך כלי קיבול מתאים, בהתאם למדיניות של המוסד. ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי בעת עבודה עם טריטיום.

2. העצבית אינדוקציה של iPSCs

הערה: כדי להפוך NPCs, גירסה קצת שונה של פרוטוקול המלווה ערכת אינדוקציה עצבית זמינים מסחרית עקבו. הקיט מורכב Neurobasal (NB) מדיה של 50 x עצבית תוספת אינדוקציה (ש ח), אשר נמצא בשימוש כדי להפוך 1 x אינדוקציה עצבי בינוני (נים). ש ח משמש גם כדי להפוך 100% הרחבה בינונית (ראו סעיף 3.1). קישור לפרוטוקול נמצא על חומרים, ציוד, הפניות סעיף43.

  1. המעבר iPSCs כאשר הם הופכים confluent 70-80%.
  2. IPSCs צלחת 300,000 1 טוב של hESC-מוסמך חוץ-תאית מטריקס-לחקות הצלחת 6-ובכן ג'ל (ECM-לחקות ג'ל) מצופה המכיל 2 מיליליטר iPSC נטולת מזין בינוני עם 5 μM של רוק מעכב. ראה סעיף 3.2 להוראות ציפוי וולס עם ג'ל ECM-חיקוי.
  3. יום אחד מאוחר יותר, הסר את iPSC בינוני + iPSCs מעכב, שטיפת רוק פעם אחת עם 1 x PBS. להוסיף 2 מ של נים iPSCs.
    הערה: 50 מ של נים נעשית על-ידי הוספת 1 מ"ל של 50 ש ח ו- 250 µL (50 יחידות/mL, μL 5/mL) של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) 49 מ של NB מדיה.
  4. שינוי מדיה האינדוקציה עצבית כל יומיים על ידי כ רפה בעברית בילה בהחלפה עם 2 מ של נים ובינוניות עד תאים להפוך confluent (בסביבות 4-5 ימים). לשנות מדיה מדי יום, ברגע תאים confluent.
  5. מעבר תאים לאחר 7 ימים נים, צלחת לתוך ג'ל ECM-לחקות מצופה צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ ל 100% התרחבות המדיה והמעכב רוק 5 μM. התאים נחשבים מעבר 0 (P0) NPCs בשלב זה. עיין בסעיף 3.1 להלן לקבלת הוראות לעשות 100% התרחבות המדיה.
  6. מעבר תאים באמצעות השיטות המתוארות בסעיף 3.4. לחכות עד התאים הגיעו P2 הם confluent לפני בריא כתם NPC סמנים, ציפוי לניסויים (איור 1).

3. תרבות המדיה, ציפוי ותחזוקה של NPCs

  1. הכנה מדיה עבור תחזוקת NPCs (מדיה 100% הרחבה):
    1. להפוך 50 מ של 100% הרחבה מדיה על-ידי שילוב 24.5 מ של DMEM/F12 עם 24.5 מ של NB.
    2. להוסיף 1 מ"ל של 50 ש"ח x DMEM/F12 + פתרון NB. להוסיף 250 μL של P/S פתרון המדיה.
      הערה: המדיה יכול להיות בקירור (4 ° C), המשמש עבור עד 2 שבועות. כרכים קטנים של המדיה יכול להתבצע על-ידי התאמת הכרכים של DMEM / F12 + NB + ש ח באמצעות את יחס זהה עבור אמצעי האחסון 50-mL.
  2. הכנת ג'ל ECM-לחקות מצופה לוחות תרבות לתחזוקה NPC
    1. Aliquot ג'ל ECM-לחקות את אמצעי האחסון הדרושים כדי לעשות 6 מ של הפתרון עובד. חישוב נפח aliquot מלהסתכל האישור של ניתוח גיליון מאז ECM-לחקות ג'ל דילול גורם משתנה האצווה כדי אצווה והרבה הרבה כדי.
    2. להפשיר aliquot ג'ל ECM-לחקות על קרח, להתמוסס אל תוך 6 מ של מדיה DMEM/F12 קר.
    3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון ה-ECM-לחקות ג'ל/DMEM/F12 כל טוב של צלחת טוב 6. דגירה לצלחת 6-ובכן עם ג'ל-פתרון ECM-לחקות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. תשאף פתרון ה-ECM-לחקות ג'ל לאחר 30 דקות של דגירה, להחליף 100% הרחבה מדיה או להכניס למקרר צלחות (4 ° C, עד שבוע 1) מבלי כ רפה בעברית ECM-לחקות ג'ל-פתרון.
  3. תחזוקת NPCs
    1. NPCs צלחת על צפיפות של 1.5 מיליון תאים לתוך ECM-חיקוי טוב המכיל 2 מ"ל של התקשורת הרחבה 100% מצופי ג'ל.
    2. דגירה NPCs ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה עם 5% CO2.
    3. להוסיף 5 μM של רוק מעכב למדיה NPCs P3 או נמוכה יותר, או NPCs המופשרים, כדי למנוע מוות של תאים מוגברת. לשנות מדיה לאחר 24 שעות ביממה כדי להסיר רוק מעכב.
    4. מעבר תאים כל 4-9 ימים, תלוי מתי הם הופכים confluent. תאים נחשבים confluent כאשר הם הופכים חד שכבתי בצפיפות המכסים את כל הישבן של המשטח מאכל.
    5. צלחת NPCs על צפיפות של 1 ל- 1.5 מיליון תאים לכל אחד טוב של צלחת 6-טוב (ראה סעיף 3.4). להסיר מדיה בילה כל 48 שעות והחלף 2 מ ל 100% התרחבות המדיה.
  4. הרם מביצועם, גלולה NPCs תחזוקה ו/או ציפוי עבור תנאים ניסיוני
    1. האחות בינוני, תשטוף תאים פעם עם 1 x PBS. האחות PBS ולהוסיף μL 500 בפתרון ניתוק התא 1 x 1 טוב של confluent NPCs. Incubate 10 דקות ב 37 º C.
    2. להוסיף 500 μL בטמפרטורת החדר (RT) PBS ולשטוף היטב באמצעות פיפטה P-1000 כדי להבטיח הסרה של תאים. לאסוף את תאי + פתרון PBS לתוך צינור חרוטי 15-mL. לשטוף את הצלחת שוב עם 1 מ"ל של PBS ומוסיפים נוזלי ברכבת התחתית.
    3. ספין התאים למטה ב- g x 300 עבור 5 דקות כדי גלולה.
    4. להסיר את תגובת שיקוע בגדר תא והשהה מחדש את התאים ב- 1-5 מ של מדיה DMEM/F12 ומחוממת מראש. לדלל לתאים צפיפות של 1 ל 4 מיליון תאים למ"ל של מדיה. לכמת תאים באמצעות של hemocytometer.
    5. צלחת המספר הנדרש של תאים ספציפיים עבור תחזוקה NPC (סעיף 3.3) או וזמינותו בודדים שהודעתו (עיין בסעיפים הבאים לקבלת פרטים נוספים).
    6. להתאים נפח התאים הבולם עם המדיה כך בין 15 ל- 100 μL של תאים משמשים עבור כל מנה/טוב. אמצעי אחסון זה ציפוי קטנה מבטיחה כי יש התפלגות התא אפילו כי גורמי גדילה, סמים או מצעים בשנת המדיום הם לא מדולל.
    7. דגירה תאים ב 37 º C. לשנות מדיה כל 48 שעות לצורך תחזוקה NPC או לראות פרטים ספציפיים עבור מבחני בודדים.
  5. מדיה הכנה ניסיוני תנאים (30% הרחבה מדיה)
    1. לדלל את המדיה הרחבה של 100% עד 70% (כינה 30% הרחבה) על-ידי הוספת 1:1 DMEM/F12 + פתרון NB כדי להפוך את המדיה עבור תנאי הניסוי.
    2. להפוך 20 מ של 30% הרחבה מדיה על-ידי הוספת 6 מ של 100% התרחבות המדיה, דילול 7 מ של NB ו- mL 7 של מדיה DMEM/F12. להוסיף 5 µL/mL של פתרון P/S.
      הערה: אם כבר, מכיל מדיה 100% P/S, הוסף 5 μL/mL עבור DMEM בשילוב / F12 + NB = (14 מ"ל) x (5 μL/mL) = 70 μL של P/S במקום 100µL.
    3. להוסיף ציפוי דיאלקטריים ו פקטורי גדילה בריכוזים הרצויים בכלי התקשורת הרחבה של 30%.

4. הערכת לסינתזת DNA S-שלב הכניסה, מספרי הטלפון הנייד של NPCs

  1. הכנה לסינתזת DNA, S-שלב הכניסה ואת וזמינותו מספר התא
    1. להפוך את פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל של פולי-D-ליזין (PDL) ב- dH2O ולחטא מסנן. לדלל 1:10 dH2O כדי להפוך 0.1 מ"ג/מ"ל PDL פתרון ולהוסיף 300 μL כל טוב של צלחת טוב 24 או 1 מ"ל ל תבשיל 35 מ מ. תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT.
    2. לשטוף PDL בארות 3 פעמים במשך 5 דקות ב- dH2O. וביופסיה dH2O ולהוסיף 300 μL/טוב או 1 mL/צלחת של laminin (5 μg/mL) מדולל ב- 1 x PBS. מכסה הצלחות עם מצלמות-מיקרוסקופים, לשמור על אבטחה סטרילי, ארון בן לילה-RT (12 עד 24 שעות).
    3. הכנת 30% התרחבות המדיה (ראה סעיף 3.5) לאחר ה 12 עד 24 הוסף כלי רכב, גורמי גדילה או סמים עניין-הריכוז הרצוי כרכים כי הם פחות מ 10% הפתרון הכולל כדי למנוע דילול ש ח 30% הרחבה בינונית.
    4. לשטוף כל טוב של צלחת 24-ובכן פעמיים עם PBS 1 x (5 דקות כל אחד). האחות 1 x PBS ולהוסיף μL 450 של מדיה (בלי או עם גורמי גדילה/סמים). דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 15 דקות לפני ציפוי תאים.
    5. עבור ניסוי, להגדיר 2-3 בארות או מנות לכל מצב.
    6. NPCs צלחת (ראה סעיף 3.4):
    7. Assay סינתזה של דנ א NPC: 100,000 תאים/באר היטב צלחת 24
    8. S-שלב כניסה: תאים 500,000/35 מ מ מאכל
    9. תא Assay מספר: 50,000 תאים/באר צלחת 24-ובכן
  2. קודמן עצבית תא DNA סינתזה Assay
    1. צלחת 100,000 התאים היטב לתוך צלחת 24-ובכן, להעריך במצב/בשלושה עותקים.
    2. להוסיף רדיואקטיבי, tritiated [3H]-תימידין למדיום תרבות (1.5 μCi/mL) כל היטב לאחר h 46 בתרבות. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
      הערה: בעת שימוש בחומרים רדיואקטיביים, לקבל הדרכה שלך מוסד, פרוטוקול הבטיחות רדיואקטיביות בעקבות והשלך חומרים רדיואקטיביים בתוך כלי קיבול המיועדים כראוי פסולת.
    3. להסיר כראוי להיפטר מדיה רדיואקטיבי לאחר 2 ח' 300 להוסיף μL של טרום חימם 0.25% טריפסין-EDTA (0.5 מ מ) על כל טוב ואת תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
    4. להפעיל את הכריה תא (ראה חומרים וציוד סעיף), המשאבה ולהבטיח כי הלחץ משאבה היא להלן 200 PSI. מניחים נייר סינון דרך החלל הכריה תא והרימו בפינה הימנית כדי לסמן כיוון הנייר.
    5. מניחים צינורות איסוף של התא המקצרה טס "ריק" ריק ולחץ prewash כדי להרטיב נייר הסינון. מניחים צינורות איסוף הדגימה בארות ולהפעיל (התחל).
    6. כאשר הכריה תא סיום איסוף דגימות, הרם נייר סינון קלאמפ ולהתקדם לחזור עבור כל קבוצות המדגם. תמיד prewash בתוך צלחת ריקה, "ריק".
    7. יבש נייר סינון תחת מקור אור ולהגדיר בקבוקונים המתאימים במגש. אגרוף צ'דס נייר לתוך מבחנות ולהוסיף 2 מ של קוקטייל גזים כל מבחנה. בקבוקונים והמעיל תווית.
    8. דגירה בקבוקונים של גזים קוקטייל במשך לפחות שעה לפני קריאת הסעיפים לדקה (CPMs) על מכונת נצנוץ.
  3. NPC S-שלב הכניסה Assay
    1. ראה סעיף 3.4 עבור שלבים כדי להרים, מביצועם, גלולה, וכן להשעות מחדש תאים.
    2. צלחת תאים 500,000 לכל מאכל לתוך מנות 35 מ מ סעיף 4.1, דיש רק 1/תנאי בשלב זה.
    3. להתסיס מנות הלוך ושוב בכל הכיוונים כדי להבטיח אפילו חלוקת תאים. דגירה תאים ב 37 ° C עבור 46 h.
    4. להכין שלוש צלחות 35 מ מ מצופה PDL/Laminin לכל תנאי לאחר 24 שעות. לדוגמה, אם יש צלחת אחת 35 מ מ של 30% התרחבות המדיה, צלחת אחת 35 מ מ של 30% הרחבה מדיה + FGF (10 ng/mL) ואז מעיל 6 צלחות PDL/Laminin לשימוש ביום הבא.
    5. להוסיף 2 μL/mL של 5 מ מ אדו תרבויות לאחר 46 ה Incubate כבר שעתיים.
    6. מביצועם, גלולה התאים (ראה סעיף 3.4). מחדש להשעות בגדר תא ב- 3 מ"ל של התקשורת הרחבה 30% או 3 מ"ל של 30% הרחבה מדיה + גורמי גדילה הרצוי/סמים.
    7. בצלחת 1 מ"ל לכל מאכל על מנות PDL/Laminin מצופים מראש. להתסיס מנות הלוך ושוב בכל הכיוונים כדי להבטיח אפילו חלוקת תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאפשר את התאים לדבוק המנה. ראה איור 2 ציר זמן פשוטה.
  4. S-שלב הכניסה לניתוח
    1. לתקן מנות עם קרח 4% Paraformaldehyde (PFA ב- 1 x PBS) במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף כלים 3 פעמים במשך חמש דקות עם 1 x PBS.
    2. להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x עם 0.05% אזיד הנתרן, כדי למנוע צמיחה של חיידקים ופטריות. תאים שניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים אם מנות (אטום עם מצלמות-מיקרוסקופים) נשמרים ב- PBS + נתרן אזיד פתרון, אנטיגנים אבל לא כל אימונולוגי הם שהשתמרה היטב לאחר עיכובים ממושכים בניתוח.
    3. Assay תאים באמצעות תגובה אדו מסחרי קיט (ראה הפרוטוקול של היצרן). כתם תאים באמצעות דאפי או עוד סמן גרעינית, תמונה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    4. להעריך את הפרופורציה של תאים חיוביים אדו על תאים חיים הכולל (מספר בתא סכום), עיוור 10 שדות אקראיים באופן שיטתי (10 x). אינם כוללים תאים מתים בניתוח.
    5. לנצל הן תמונות חדות שלב פלורסנט תמונות כדי לקבוע מכתים אדו חיובי וכדי לברר אילו תאים מתים או חי (איור 3).
    6. ספירת התאים יש שניהם חלקה אפילו קרום התא בהגדרות חדות שלב, ואת גרעין גדול מפוצל על ידי גרעיני פלורסנט דאפי כתם, תאים אלה הם חיים (איור 3 א-ב).
    7. לא לכלול כל התאים הנמצאים בשלב החיובי, יש קרום התא לא אחידה שבור, יש גרעין קטן, צפוף כמו דמיינו ידי דאפי פלורסנט הדמיה, כמו אלו תאים מתים (איור 3 א-ב). להעריך תאים חיים עבור ביטוי של עידו על-ידי זיהוי תאים בעלי אדו ניאון בהיר מכתים את הגרעין כולו או צביעת פלורסנט מנומר בגרעין (איור 3C).
  5. NPC תא Assay מספר
    1. לאחר יומיים בתרבות, תווית, להכין צינורות microcentrifuge 1.5 mL, 0.5 mL microcentrifuge צינורות. כל שפופרת 0.5 mL, הוסף 5 μL של Trypan Blue.
    2. כדי כל טוב של צלחת טוב 24, הסר בינוני ולהוסיף μL 200 1 x תא ניתוק פתרון ומקום בתוך חממה למשך 10-15 דקות.
    3. לאחר הזמן המוקצב, ברגע תאים יש הרים, להוסיף את הסכום הרצוי של 1 x PBS מכל קידוח.
      הערה: בדרך כלל, ביום 2, להוסיף μL 300 ל- PBS 1 x התאים המכילים טוב פלוס 200 μL של הפתרון ניתוק, עבור הנפח הכולל של 500 μL. עם זמן הדגירה תרבות נוספים, כמו תאים להפוך confluent יותר, להגביר עוצמת דילול לפי הצורך. לדוגמה, ביום הרביעי, להוסיף μL 500 1 x PBS, ביום השישי, להוסיף μL 800 ל- 1 x PBS. נפחים יהיה 700 μL 1 מ"ל, בהתאמה.
    4. באמצעות פיפטה P-1000, פיפטה למעלה ולמטה כל טוב 4 עד 5 פעמים כדי להסיר תאים. בוחנים את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי כל התאים יש מנותק. העברת תאים 1.5 mL צינורות.
    5. היפוך 1.5 mL צינורות עם תאים מדולל פי 2 עד פי 3. ואז לקחת את μL 50 aliquot של תאים מהאמצע של הצינור, להוסיף 0.5 mL צינורות עם Trypan Blue (ראה 4.5.1).
    6. פיפטה תא פתרון לכל אורך 2 כדי 3 פעמים. להוסיף תאים hemocytometer ולנתח באופן מיידי. מחכים זמן רב יותר 10 דקות עשוי להגדיל את מות תאים או הנוכחות של תאים יש לקחת Trypan Blue.
    7. להוסיף בזהירות µL 10 לתא + התערובת Trypan Blue בכל צד של hemocytometer כדי לבצע ספירות שכפל. ספירת תאים באמצעות המיקרוסקופ ניגודיות שלב. לא לספור תאים מתים או בתאים כחול כהה לקחו על עצמם Trypan Blue.
    8. כדי לקבל שימוש מספר, בתא סכום הממוצע מספר הטלפון הנייד מתוך 4 הפינות של hemocytometer ולהחיל המשוואה הבאה:
      תא מספר x נפח המדיה (mL) x 10,000 ממוצע = cell סך הכל מספר/טוב
    9. האחות וחזור את ההליך על בארות הנותרים. שינוי בתקשורת על התאים לא להיות נספרים, כל assay חוזר ה 48 על 4 ימים & 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. הכנה של מנות, מדיה Neurite Assay
    1. להפוך את פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל של פולי-d-ליזין (PDL) ב- dH2O ולחטא מסנן. לדלל 1:10 dH2O כדי להפוך את פתרון PDL 0.1 מ"ג/מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל כל מנה 35 מ מ. תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT.
    2. בינתיים, מכינים 30% התרחבות המדיה (ראה סעיף 3.5) ולהוסיף 5 μg/mL (5 µL/mL) של פתרון Fibronectin (מניות 1 מ"ג/מ"ל) בכלי התקשורת.
    3. ברגע שהתקשורת מוכן, להוסיף כלי רכב, גורמי גדילה או סמים עניין בריכוזים הרצויים.
      הערה: מומלץ להוסיף רכב, גורמי גדילה או סמים, בעוצמות < 10% הפתרון הכולל כדי למנוע דילול fibronectin ורכיבים אחרים של המדיום הרחבה 30%.
    4. לאחר 20 דקות, לשטוף כלים PDL 3 פעמים במשך חמש דקות עם dH2O כדי להסיר עודפי PDL. ודא מאכלים יבשים לפני הוספת מדיה.
    5. מניחים 1 מ"ל של מדיה (עם או בלי גורמי גדילה/סמים) + פתרון Fibronectin כל מנה מצופה PDL.
    6. דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ציפוי תאים כדי להבטיח החזקה נכונה של Fibronectin PDL.
    7. עבור ניסוי, להגדיר 2-3 מנות לכל תנאי (למשל, 3 רכב המכיל מנות, 3 מנות המכילות סמים).
  2. ציפוי NPCs עבור Neurite Assay
    1. ראה סעיף 3.4 עבור שלבים כדי להרים מביצועם, גלולה, resuspend תאים.
    2. צלחת 50,000 תאים לכל מאכל לתוך המנות המבושלות סעיף 5.1. להתסיס מנות הלוך ושוב בכל הכיוונים כדי להבטיח ריפודי כתופיים של תאים.
    3. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  3. ניתוח של Neurites
    1. לאחר המקננת תאים עבור 48 שעות, תשאף בינוני, ולתקן מנות עם קרח קר 4% מחברים עבור 20 דקות.
    2. לאחר 20 דקות, לשטוף כלים 3 פעמים במשך חמש דקות עם 1 x PBS. לאחר השטיפה הסופית להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x עם 0.05% אזיד הנתרן.
    3. לנתח את מנות באופן עיוור על מיקרוסקופ לעומת זאת שלב בגיל 32 X. לספור הכולל תאים ותאים עם neurites ב-3, שורות 1 ס מ, נבחרו באקראי עמדות אבל לשחזור. לספור מינימום של 150 תאים לכל מאכל על מנת להבטיח דגימה מספקת.
      הערה: neurite מוגדר כהרחבה (תהליך) מתוך הגוף תא > קטרים גוף התא 2 אורך. עבור תאים עם תהליכים מרובים, נחשב את התהליך הארוך על הקריטריון. תאים עם תהליכים הם < 2 גוף התא קטרים אורך אינם כלולים (איור 4).
    4. להוסיף יחד את המספר הכולל של התאים ואת המספר הכולל של תאים עם neurites בכל צלחת. לחשב את אחוז תאים עם neurites. ממוצע אחוז תאים עם neurites על פני מאכלים שכפל. אמונם ניסויית הפארמצבטית נוצר כאשר כל השורות בתוך כל מנה דומה הינם ממוצעים בין מאכלים דומים מאוד, עם שגיאת התקן של הממוצע (SEM) < 10%.
    5. לחלופין, לנתח neurites על-ידי עריכת immunocytochemistry עבור סמני כגון בטא-III-טובולין (TUJ1) או MAP2. לאחר צביעת עבור דה מרקר עניין, קח 10 תמונות אקראיות באופן שיטתי על מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10 X. תמונה תאים לפחות 200. במקרה זה, רוכשים את התמונות לא. קרוב מדי לקצה של המנה. לנתח את אחוז תאים עם TUJ1 או MAP2 + neurites (לקבלת דוגמה, ראה איור 10 ).

6. NPC Neurosphere Assay ההעברה

  1. היווצרות Neurosphere
    1. להוסיף 1 מ"ל של 100% הרחבה מדיה לתוך תבשיל 35 מ מ עם סובסטרט ללא ציפוי. דגירה מנות לפחות 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ציפוי NPCs. להכין 2-3 מנות להבטיח כי שם יהיה מספיק neurospheres עבור תא העברה וזמינותו.
      הערה: בהעדר מצע ציפוי מבטיחה כי NPCs נשארים תלויים בתקשורת, אשר חיוני היווצרות neurosphere. ציפוי מנות ימנע היווצרות neurosphere.
    2. ראה סעיף 3.4 על מדרגות הרם, מביצועם של גלולה תאים. Resuspend תא גלולה ב- 2-5 מ ל 100% מראש ומחוממת התרחבות המדיה. בצלחת 1 מיליון NPCs לתוך כל מנה 35 מ מ מוכן סעיף 6.1.1.
    3. דגירה NPCs ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 ל 96 h כדי לאפשר NPCs צבירה וטופס neurospheres. להעריך את גודל הכדור בעזרת סרגל בשידור חי במיקרוסקופ שלב-ניגודיות. לחכות ברוב התחומים להגיע של הקוטר המשוער של 100 מיקרומטר (± 20 μm) (איור 5). התחומים קטנים לחלוטין להתפזר, להתפרק במהלך ההעברה וזמינותו.
  2. הכנה של צלחות Neurosphere Assay ההעברה
    1. יתמוסס ECM-לחקות ג'ל aliquots (ראה סעיף 3.2) 6 מ של 30% התרחבות המדיה. ברגע ECM-לחקות gel/30% מדיה הרחבת פתרון מוכן, להוסיף כלי רכב, גורמי גדילה או סמים אינטרסים בריכוזים הרצויים.
      הערה: הרכב, סמים ו פקטורי גדילה ריכוזי צריך להיות מוגברת לחשבון עבור התוספת של 200 µL של neurospheres ב סעיף 6.3.
    2. בצלחת 1 מ"ל של החיקוי ECM ג'ל פתרון התקשורת הרחבה /30% (± כלי רכב, גורמי גדילה או תרופות) לתוך אחד טוב של צלחת 6-. טוב. לעשות 2-3 בארות לכל תנאי הניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש מנות 35 מ מ. דגירה צלחות במשך לפחות 30 דקות ב ° 37 C.
      הערה: לא תשאף gel/30% ECM-לחקות את התרחבות המדיה לפתרון זה וזמינותו. ציפוי הספירות על גבי ג'ל ECM-לחקות aspirated יוביל העברה מהירה של עודף.
  3. Neurospheres יופיצ
    1. לאסוף neurospheres שהוקמה ב סעיף 6.1 ולמקם אותם לתוך צינור חרוטי. לשטוף את מ מ 35 מנות עם 1 מ"ל של PBS 1 x כדי להבטיח neurospheres כל נאספים. ספין למטה neurospheres שנאספו ב g x 100 למשך 5 דקות.
    2. מחדש להשעות את neurospheres ב 1-3 מ"ל של טרום ומחוממת 30% במדיה הרחבה. אם המנה 1 של neurospheres נאסף, 1 מ"ל של התקשורת משמשת resuspend הספירות. אם 2 מנות נאספים, 2 מ של מדיה נוספים resuspend הספירות, וכו פיפטה בעדינות ולהשתמש רק עם P-1000 להבטחת הספירות אינם שבורים.
    3. צלחת 200 μL של neurospheres resuspended לתוך gel/30% ECM-לחקות הרחבת פתרון ב סעיף 6.2. לוחות אבן לכל הכיוונים לפיזור אחיד neurospheres. דגירה של הלוחות עבור h 48-37מעלות צלזיוס.
    4. הסרת ה-ECM-לחקות gel/30% מדיה הרחבת פתרון ולתקן תאים 4% מחברים, שטיפת ותאים לשמור 1 x PBS + 0.05% אזיד הנתרן.
  4. ניתוח של Neurospheres
    1. לרכוש תמונות של neurospheres כולו באמצעות הגדרות חדות שלב 10 X. ודא הספירות לא נוגעים אחד בשני. למדוד הממוצע העברה באמצעות התוכנה ImageJ.
    2. לאתר את קווי המתאר החיצוני של neurosphere שימוש בכלי קו ביד חופשית. קו ביד חופשית ניתן לגשת על ידי לחיצה ימנית על סמל הקו "ישר". באופן ידני מעקב באמצעות עכבר.
    3. השתמש בפונקציה מידה כדי לחשב את השטח של המעקב. ודא כי "אזור" נבחר בתור read-out בחלון "הגדרת המידות" נמצא תחת הלשונית נתח. ראה איור 6 . עקבות של המתאר החיצוני בכחול.
    4. לעקוב אחר המסה התא הפנימי של האזור כדור ולמדוד. ראה איור 6 זכר מתאר הפנימי בצבע אדום. לכמת ההעברה הממוצע על-ידי חיסור המסה הפנימית תאים מהאזור neurosphere הכולל.
    5. Neurospheres מידה כי התערוכה מסה בצפיפות תא פנימי עם תאים נודדים החוצה כמו שטיח רציף (איור 6).
    6. אינם כוללים תאים מחוץ לשטיח או מנותק מן neurosphere למדידה. ראה איור 6 דוגמאות של תאים (מסומן בעיגול לבן) אינם נכללים המדידה השטיח החיצוני. לנתח את מינימום של 20 neurospheres עבור כל תנאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרה אחת של מחקרים אלה הוא להגדיר את הפעילות המקדימות של NPCs, כלומר, עלייה מספרי הטלפון הנייד. זו מושגת על-ידי הערכת לסינתזת DNA של האוכלוסייה בתא סכום, בגישה תפוקה גבוהה זה מודד את ההתאגדות של תימידין tritiated מעקב רדיואקטיבי לתוך התא תמציות, ומשקף את כל התאים עוסקת S-שלב, בין אם הם סינתזה במשך 5 דקות או את כל שעתיים. בנוסף, מבחני אלה מאפשרות קביעת היחס של תאים מזינים S-פאזי ומספרים בתא סכום, assay יותר לתקיפות של תאים בודדים. תאים לסנתז DNA ב S-שלב, שלב המופיע לפני מיטוזה, חלוקת התא, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המובאת כאן להדגים שיטות מהיר ופשוט ללמוד התפתחותיות היסוד תהליכים ולבדוק גורמי צמיחה ותרופות באמצעות תאים hiPSC-derived קודמן עצבית. hiPSC טכנולוגיה יש מהפכה בחקר בפתוגנזה של מחלות התפתחותיות במתן גישה חסרת תקדים לחיות תאים עצביים האנושי של אנשים מושפעים. אכן, היו מחקרים רבים hiPSC של הפרעות התפתחותיות כולל תסמונת רט, תסמונת טימותי, תסמונת X שביר, וסכיזופרניה, אשר גילית סטיות מחלות ספציפיות, דנדריטים, synapses, ו עצביים הפונקציה4,33,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמך על ידי המושל ניו ג'רזי המועצה למחקר רפואי, טיפול של אוטיזם (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), ננסי לוריא מסמן קרן נאמנות עופרת Mindworks, קרן הקהילה היהודית של מטרווסט רבתי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדיום אינדוקציה עצבית PSC:
קישור לפרוטוקול: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801זוהי ערכה המורכבת ממדיום נוירובזאלי (NB) ותוסף אינדוקציה עצבית פי 50 (NIS). ה-NIS משמש לייצור 1X Neural Induction Medium ו-100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 MediumThermoFischer Scientific12634-010Component of 100%
Expansion Medium Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103049 רכיב של NIM ו-100% Expansion Medium 
ג'ל Matrigel Corning מוסמך hESC354277ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאי מוסמך hESC (ג'ל מחקה ECM) 
Y-27632 (2HCl), 1 מ"גטכנולוגיות תאי גזע72302מעכב ROCK
6 צלחות בארCorningCOR-3506לוחות פוליסטירן המשמשים לתחזוקת NPC ולבדיקת נדידת נוירוספרה 
צלחות 24 בארThermoFischer Scientific2021-05לוחות פוליסטירן: משמשים לבדיקת סינתזת DNA NPC
צלחות 35 מ"מThermoFischer Scientific2021-01לוחות פוליסטירן: משמשים לכניסת NPC S-Phase ובדיקת נויריט
עכבר טבעי LamininInvitrogen23017-015מצע לציפוי צלחות: משמש לסינתזה של NPC DNA, כניסת S-Phase ובדיקות
מספר תאיםמצע פיברונקטיןסיגמאF1141לציפוי צלחות: משמש לבדיקת נויריט 
פולי-D-ליזיןסיגמאP0899מצע לציפוי צלחות
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו-פישראנטיביוטיקה 15140122 מדעית, רכיב של NIM, 100% התרחבות ו-30% התפשטות מדיה 
StemPro AccutaseGibcoA11105-01פתרון ניתוק תאים 1X 
2.5% טריפסין (10X)Gibco15090-046תמיסה אנזימטית 10X
0.5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261משמש בתמיסת טריפסין להרמת תאים לבדיקת סינתזת DNA
טריטיאט [3H]-תימידיןפרקין אלמרNET027E001טריטיום רדיואקטיבי, תימידין
פישרברנד 7 מ"ל HDPE בקבוקוני נצנוץפישרברנד03-337-1בקבוקונים לספירת נצנוץ נוזלי
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 קוקטייל נצנוץ נוזלי
LS 6500 מונה נצנוץ נוזלי רב תכליתיבקמן קולטר8043-30-1194מונה נצנוץ נוזלי
Skatron קציר תאים חצי אוטומטי סוג 11019מכשירים מולקולריים & סקטרון אינסטרומנטס בע"מקציר תאים חצי אוטומטי
Click-iT EdU Alexa Fluor® ערכת הדמיה 488ThermoFisher ScientificC10337EdU וערכת צביעה לבדיקת כניסה S-Phase
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061הערכת כדאיות התאים
נייר סינון GF/C בדרגהGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849נייר סינון סיבי זכוכית
בסיסי אנושי FGF-2Peprotech100-18Bגורם גדילה
יותרת המוח אדנילט ציקלאז מפעיל פוליפפטיד (PACAP-38)BACHEMH-8430נוירופפטיד
גורם גדילה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9(2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10(2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neural Precursor CellsProliferation AssayMigration AssayNeurosphere FormationEdU LabelingPhase Contrast ImagingImmunocytochemical StainingCell DetachmentTrypan Blue CountingECM Mimic Gel

מאמרים קשורים