התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
התפתחות המוח האנושי ממשיך דרך סדרה של תהליכים מתוזמר בדיוק, בשלבים מוקדמים מכובד על ידי התפשטות, הגירה, תוצר neurite; ובשלבים מאוחרים יותר מאופיין תוצר האקסון/דנדריט היווצרות סינפסה. בהפרעות התפתחותיות, לעיתים קרובות אחד או יותר של תהליכים אלה הן משובשות, שמוביל חריגות בתוך מבנה המוח ותפקודו. עם כניסתו של האדם pluripotent המושרה תא גזע (hiPSC) טכנולוגיה, חוקרים עכשיו יש אטומטי בשפע של תאים אנושיים, כי יכול להיות מובחן כמעט כל סוג התא, לרבות נוירונים. תאים אלה ניתן ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם בפתוגנזה של המחלה. מספר פרוטוקולים באמצעות hiPSCs ליצור מודל המחלה מנוטלי שימוש סופני הבדיל נוירונים או שימוש תרבות 3D מערכות הנקרא organoids. בעוד ששיטות אלה הוכיחו שלא יסולא בפז לומד פתוגנזה מחלות אנושיות, ישנם מספר חסרונות. הבידול של hiPSCs לתוך הנוירונים דור של organoids ממושך ויקר תהליכים שיכולים להשפיע מספר הניסויים ולא משתנים אשר יכולים להיות מוערך בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בנוסף, בעוד הנוירונים הפוסט-mitotic ו organoids מאפשרים בחקר תהליכים הקשורים למחלות, לרבות תוצר דנדריט, synaptogenesis, הם למנוע בחקר תהליכים מוקדמים יותר כמו התפשטות והעברה. הפרעות התפתחותיות, כגון אוטיזם, שפע ראיות גנטיות, פוסט-מורטם מציינת פגמים בתהליכים התפתחותיים מוקדם. קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסיה מאוד proliferative תא, ייתכן מודל מתאים בו לשאול שאלות על תהליכים ontogenetic, מחלת חניכה. אנחנו עכשיו להרחיב את מתודולוגיות למד מן הלומדים פיתוח בתרבויות קורטיקלית עכבר ועכבר כדי NPCs אנושי. השימוש NPCs מאפשר לנו לחקור פנוטיפים הקשורים למחלות ולהגדיר כיצד משתנים (למשל, גורמי גדילה, סמים) השפעה התפתחותית תהליכים שונים כולל התפשטות, העברה של בידול רק אחרי כמה ימים. בסופו של דבר, כלים זה יכול לשמש באופן הדירים תפוקה גבוהה לזיהוי מנגנוני מחלות ספציפיות והן פנוטיפים בהפרעות התפתחותיות.
מבוא
השימוש של אורגניזמים פשוטים ומודלים העכבר יש מבואר על מנגנוני התפתחות המוח בסיסיים, כמו גם בפתוגנזה של המחלה. למרות ההתפתחויות הללו, האטיולוגיה של רבים מנוטלי הפרעות נשאר קשה להבנה, כי לא כל הממצאים אורגניזמים פשוטים הרלוונטיים ישירות היבטים מורכבים של מחלות אנושיות. יתר על כן, למורכבות רבה יותר של המוח האנושי לעיתים קרובות מקשה על מודל ההתפתחות האנושית, הפרעות בבעלי חיים. עם התפתחות, התקדמות הטכנולוגיה האנושית pluripotent המושרה בתאי גזע (hiPSCs), תאים סומטיים יכול להיות מחדש לתוך תאי גזע, ואז הבדיל לתוך תאים עצביים ללמוד מחלות אנושיות. ההתקדמות בטכנולוגיות hiPSCs ו "omic" (גנומיקה, transcriptomics, פרוטאומיקס, גליקומיקס) מבטיח לחולל מהפכה להבנת התפתחות המוח האנושי. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. נהלי בטיחות ותחזוקה אבטחה הקבינט
-
נהלי בטיחות אבטחה ברמה-2 (BSL-2)
- פעל לפי ההנחיות של המוסד על עבודה עם חומרים BSL-2. תשליך BSL-2 חומרים על-פי נוהלי המוסד. מציינים חדרים וציוד המשמשים עבור חומרים BSL-2. ללבוש כל ציוד מגן אישי (PPE), כולל חלוק וכפפות.
-
אבטחה לארון תחזוקה
- השתמש ארון אבטחה מאושר לשימוש בחומרים ברמה BSL-2.
- להדליק את האור האולטרה סגול באבטחה הקבינט למשך לפחות 15 דקות ולאחר מכן לרסס משטחים עם אקונומיקה 10% הפתרון. לאפשר הפתרון אקונומיקה כדי לשבת למשך 15 דקות לנקות את הארון, להפעיל את זרימת האוויר לפני השימוש.
- Tritiated רדיואקט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מטרה אחת של מחקרים אלה הוא להגדיר את הפעילות המקדימות של NPCs, כלומר, עלייה מספרי הטלפון הנייד. זו מושגת על-ידי הערכת לסינתזת DNA של האוכלוסייה בתא סכום, בגישה תפוקה גבוהה זה מודד את ההתאגדות של תימידין tritiated מעקב רדיואקטיבי לתוך התא תמציות, ומשקף את כל התאים עוסקת S-שלב, בין אם הם סינתזה במשך 5 דקות או את כל שעתיים. בנוסף, מבחני אלה מאפשרות קביעת היחס של תאים מזינים S-פאזי ומספרים בתא סכום, assay יותר לתקיפות של תאים בודדים. תאים לסנתז DNA ב S-שלב, שלב המופיע לפני מיטוזה, חלוקת התא, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקולים המובאת כאן להדגים שיטות מהיר ופשוט ללמוד התפתחותיות היסוד תהליכים ולבדוק גורמי צמיחה ותרופות באמצעות תאים hiPSC-derived קודמן עצבית. hiPSC טכנולוגיה יש מהפכה בחקר בפתוגנזה של מחלות התפתחותיות במתן גישה חסרת תקדים לחיות תאים עצביים האנושי של אנשים מושפעים. אכן, היו מחקרים רבים hiPSC של הפרעות התפתחותיות כולל תסמונת רט, תסמונת טימותי, תסמונת X שביר, וסכיזופרניה, אשר גילית סטיות מחלות ספציפיות, דנדריטים, synapses, ו עצביים הפונקציה4,33,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמך על ידי המושל ניו ג'רזי המועצה למחקר רפואי, טיפול של אוטיזם (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), ננסי לוריא מסמן קרן נאמנות עופרת Mindworks, קרן הקהילה היהודית של מטרווסט רבתי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדיום אינדוקציה עצבית PSC: קישור לפרוטוקול: https://goo.gl/euub7a | ThermoFischer Scientific | A1647801 | זוהי ערכה המורכבת ממדיום נוירובזאלי (NB) ותוסף אינדוקציה עצבית פי 50 (NIS). ה-NIS משמש לייצור 1X Neural Induction Medium ו-100% Expansion Medium |
| Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% |
| Expansion Medium Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 רכיב של NIM ו-100% Expansion Medium | |
| ג'ל Matrigel Corning מוסמך hESC | 354277 | ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאי מוסמך hESC (ג'ל מחקה ECM) | |
| Y-27632 (2HCl), 1 מ"ג | טכנולוגיות תאי גזע | 72302 | מעכב ROCK |
| 6 צלחות באר | Corning | COR-3506 | לוחות פוליסטירן המשמשים לתחזוקת NPC ולבדיקת נדידת נוירוספרה |
| צלחות 24 באר | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | לוחות פוליסטירן: משמשים לבדיקת סינתזת DNA NPC |
| צלחות 35 מ"מ | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | לוחות פוליסטירן: משמשים לכניסת NPC S-Phase ובדיקת נויריט |
| עכבר טבעי Laminin | Invitrogen | 23017-015 | מצע לציפוי צלחות: משמש לסינתזה של NPC DNA, כניסת S-Phase ובדיקות |
| מספר תאיםמצע פיברונקטין | סיגמא | F1141 | לציפוי צלחות: משמש לבדיקת נויריט |
| פולי-D-ליזין | סיגמא | P0899 | מצע לציפוי צלחות |
| פניצילין/סטרפטומיצין | תרמו-פישר | אנטיביוטיקה 15140122 מדעית, רכיב של NIM, 100% התרחבות ו-30% התפשטות מדיה | |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | פתרון ניתוק תאים 1X |
| 2.5% טריפסין (10X) | Gibco | 15090-046 | תמיסה אנזימטית 10X |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | משמש בתמיסת טריפסין להרמת תאים לבדיקת סינתזת DNA |
| טריטיאט [3H]-תימידין | פרקין אלמר | NET027E001 | טריטיום רדיואקטיבי, תימידין |
| פישרברנד 7 מ"ל HDPE בקבוקוני נצנוץ | פישרברנד | 03-337-1 | בקבוקונים לספירת נצנוץ נוזלי |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | קוקטייל נצנוץ נוזלי |
| LS 6500 מונה נצנוץ נוזלי רב תכליתי | בקמן קולטר | 8043-30-1194 | מונה נצנוץ נוזלי |
| Skatron קציר תאים חצי אוטומטי סוג 11019 | מכשירים מולקולריים & סקטרון אינסטרומנטס בע"מ | קציר תאים חצי אוטומטי | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® ערכת הדמיה 488 | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU וערכת צביעה לבדיקת כניסה S-Phase |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | הערכת כדאיות התאים |
| נייר סינון GF/C בדרגה | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | נייר סינון סיבי זכוכית |
| בסיסי אנושי FGF-2 | Peprotech | 100-18B | גורם גדילה |
| יותרת המוח אדנילט ציקלאז מפעיל פוליפפטיד (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | נוירופפטיד |
מקורות
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
