יישום המדידה Electrophysiology ללמוד את הפעילות של מובילי אלקטרו-נייטרלי

סיכום

כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.

תקציר

הובלת יונים דרך קרום התא מבטיחה שליטה בסדר של יון תוכן בתוך ומחוץ לתא שעליו היא הכרחית להישרדות התא. מנגנונים אלה התחבורה הם מתווכת על-ידי הפעילות של חלבונים מוביל מתמחה. באופן ספציפי, pH dynamics דק נשלטים על ידי מערכות ההבלטה קרום פלזמה פרוטונים (H.⁺), כגון Na⁺/H⁺ מחליף (NHE) חלבון המשפחה. למרות המאמצים ללמוד המנגנונים NHE תקנה, ההבנה הנוכחית שלנו של המאפיינים biophysical ומולקולרית של משפחת NHE זה לא מספיק בשל המוגבל של שיטות למדוד ביעילות NHE פעילות . כתב יד זה, השתמשנו H⁺-אלקטרודות סלקטיבית במהלך כל-תא תיקון הקלטה clamping כדי למדוד את השטף הנוצרות על-ידי NHE H⁺ . אנחנו הציע גישה זו כדי להתגבר על כמה מגבלות של בדרך כלל השתמשו בשיטות למדידת פעילות NHE, כגון ספיגת רדיואקטיבי permeants ממברנה פלורסנט. מדידה של פעילות NHE באמצעות השיטה המתוארת מאפשר רגישות גבוהה, זמן רזולוציה ובקרה יעיל יותר של ריכוזים H⁺ תאיים. H⁺-אלקטרודות סלקטיבית הן מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. H⁺-סלקטיבית אלקטרודה מעבר, הרחק קרום התא בצורה שחוזרת על עצמה, מתנדנדות רשומות שינוי מתח התלויים השטף H⁺ . בעוד H⁺-אלקטרודות סלקטיבי משמשים לזיהוי שטף H⁺ עוזבת התא, השיטה מלחציים תיקון בתצורה שלם-תא משמשת לבקרה ההרכב יון תאיים. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם שומנים. הפעילות מוביל של NHE isoform 3 (NHE3) נמדדה באמצעות גישה טכנית זו ללמוד את הבסיס המולקולרי של תקנה NHE3 על ידי phosphoinositides.

מבוא

תחבורה בין יונים מומסים בגבול על פני קרום פלזמה היא חיונית להישרדותו של התאים ומכאן של אורגניזמים¹. תחבורה סלקטיבית של יונים, מומסים בגבול מושגת על ידי מערך של חלבונים טרנספורטר וערוץ מיוחדת. מוטציות בחלבונים אלה לעיתים קרובות לגרום מגוון תנאים קליניים, עיבוד טרנספורטר וערוץ חלבונים מטרות אפשריות עבור טיפול תרופתי¹. למרבה הצער, הבנת המנגנונים שבבסיס ערוץ וטרנספורטר ורגולציה לעיתים קרובות מוגבל על ידי הגישות לרשות המחקר שלהם פעילות^2,3,4.

באופן ספציפי, מסועי בערך תת מתחלקים לשתי קבוצות גדולות בהתאם אם הם לשנות את הפוטנציאל transmembrane תא במהלך ההובלה של מומסים בגבול: מובילי שינוי יון electrogenic [למשל, נתרן-פוספט 2a טרנספורטר משותף (NaPi2a), נתרן סידן מחליף (NCX), וכו '.] או למעליות יון electroneutral ללא שינוי [כגון: מחליף נתרן-פרוטון (NHE), מוביל שיתוף סודיום-כלוריד, NaPi2c, ועוד.]. הפעילות של שני המעמדות של מובילי נחקרו בהרחבה באמצעות קליטת איזוטופים רדיואקטיביים, צבעי פלורסנט ממברנה-permeant². שתי הגישות להעריך את הפעילות של מובילי על ידי מדידת שינויים בריכוז בצובר יונים ספציפיים cytoplasmic ולאחר שתי השיטות יש מגבלות, כגון רגישות בינונית ו ברזולוציה זמן לקוי השליטה תאיים חצרו. ואכן, הפעילות של מובילי רבים תלויה cytoplasmic ריכוז היונים נשאו (למשל, NHE3, NCX), צפויים שינויים בריכוזים אלה יון יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות המשלח^{2 , 3 , 5}. מדידה מדויקת של מנגנונים אלה בחקיקה מוגבל בשיטות קלאסיות.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, שיטות מלחציים תיקון משמשים כדי לחקור את פעילות המשלח^2,6. באופן ספציפי, הפניה עצמית אלקטרודות יון סלקטיבית (ISEs)^7,8 בשילוב עם התיקון מחבר חובק למעקה המערכת אפשרה לאחרונה את המדידה של electroneutral טרנספורטר פעילות^{3,4 , 5}. ISEs הם מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. איסה זזים למעלה כדי ורחוק קרום התא בחוזרות אופנה מתנדנדות רשומות שינוי מתח (µV). מתח ההבדלים יכולים להיות מומרים יון השטף ערכים באמצעות שיטה כיול כי חל החוק הראשון של Fick של דיפוזיה^2,9. בעוד ISEs משמשים לזיהוי השטף של יונים זז מתוך תאים, שיטת מלחציים תיקון שני תאים שלמים או תצורות הפוכה משמשת לבקרה ההרכב יון פוטנציאליים, תאיים ממברנה. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם^3,של שומנים, חלבונים-⁵.

לסיכום, צדדיות של השיטה מלחציים תיקון לעומת כי של שיטות אחרות כדי ללמוד פעילות המשלח עשה תיקון מחבר חובק למעקה מתאימים על מנת להתגבר על המגבלות נפוצות של השיטות האחרות. השילוב של הכוללות הפניה עצמית ISEs וטכניקות מלחציים תיקון מציעה את האפשרות ייחודי כדי למדוד את הפעילות של מובילי electroneutral בסביבה ניסיוני פיקוח הדוק, לגלות את הרומן biophysical ומולקולרית המאפיינים של קרום התא תחבורה^3,4,5. גישה זו שימש בהצלחה ללמוד את הפעילות של NHE. משפחת יונקים חלבונים NHE מזרז ההחלפה נטו electroneutral חוץ-תאית נתרן (Na⁺) עבור פרוטון תאיים (H.⁺)^10,11 ניצול של הדרגה Na⁺ פנימה. ביונקים, משפחת חלבונים NHE כולל חלבונים הקשורים 11 (NHE1-9 ו- NHA1-2) של הזרע ספציפי NHE^10,12,13.

NHEs (SLC9a משפחה) נמצאים ubiquitously רוב היצורים החיים של אאוקריוטים פשוטה כדי פרוקריוטים גבוה ומעורבים במגוון של התא חיוני פונקציות^10,11, כולל שליטה את ההגנה מליחות תא אאוקריוטים, שמירה על הומאוסטזיס חומצה בסיס וכרך תא, מווסת את ספיגת מלח ומים שונים מיוחדים epithelia^10,12,14,15. התפקיד הביולוגי מפתח של NHEs ואת המשמעות של הפונקציות שלהם שנקבע באמצעות מספר מחקרים; עם זאת, מחקרים מעטים חקרו את המאפיינים biophysical ומולקולרית של יונקים NHEs בגלל מגבלות מתודולוגי⁴. לאחרונה, היישום של הכוללות הפניה עצמית של ISEs במהלך תיקון שלם-תא מחבר חובק למעקה חשפה את הרומן המנגנונים המולקולריים של NHE איזופורמים מוסדר על ידי שינויים ריכוזי יונים, חלבונים, פוספוליפידים^{3, תאיים 4}.

באופן ספציפי, פרוטוקול בתנאי כתב יד זה מתאר את הדרכים ואת הגישות ללמוד את פעילות וויסות של NHE isoform 3 (NHE3), שחקן מרכזי לספיגת נוזלים HCO₃^– , Cl^–, Na⁺ מברשת קרום הגבול של כליות, מעיים epithelia^14,16. תובנה חדשה הבדלים הרגישות של פעילות NHE3 כדי phosphoinositides תאיים (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4.5) P2], phosphatidylinositide 3,4,5-טריפוספט [PI(3,4,5]P3]) הוא דיווח. תא תחבורה חלבונים, כגון ערוצי מובילים, מוסדרים על ידי phosphoinositides¹⁷, NHE3 נקשר ישירות P2 PI (4.5) והן P3 PI (3,4,5)¹⁸. על סמך הספרות הנוכחי, גם phosphoinositide יכול להיות רלוונטי להסדרת פיזיולוגיים או pathophysiological NHE3^5,18,19. הממצאים שלנו תומך בתפקידים נפרד PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) בוויסות פעילות NHE3. הבחנה זו התאפשרה בשל היישום של טכניקות ISE בשילוב עם הקלטה מלחציים תיקון כל תא. טכניקה זו מאפשרת גם שליטה על התוכן הסלולר phosphoinositide ויה זלוף תאיים של phosphoinositides שונים במהלך המדידה של פעילות NHE3.

פרוטוקול

הערה: שני מגברים נדרשים עבור הקלטת הפעילות של מובילי electroneutral על ידי ISE הפניה עצמית בשיתוף עם תיקון מחבר חובק למעקה, מגבר מלחציים תיקון כדי לשמור על התא תצורה של כל תא, (מגבר של impendence גבוהה אלקטרומטר) כדי להקליט הפעילות טרנספורטר באמצעות ISE (ראה טבלה של חומרים). תיקון קלאמפ המגבר מחובר ישירות ללוח הרכישה מסוף. אלקטרומטר קשורה המגבר הדיפרנציאלי מנוצל כדי לסנן ומגבירים את האות. המגבר הדיפרנציאלי מחובר ללוח הרכישה מסוף. Capmeter, תוכנה מלחציים תיקון מפקח על קיבולת תא, שימש מחקרים קודמים²⁰ (ראה טבלה של חומרים). הפתרונות קאמרית זלוף הקלטה נשמרים ב- 37 מעלות צלזיוס.

1. הכנה של מדי סוכר ISEs

1. משוך את פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט הקוטר החיצוני של 1.2 מ מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה פולר² .
2. פולנית על פיפטה באמצעות את microforge. הקוטר של קצה פיפטה צריכה להיות 2-3 מיקרומטר.
3. מקם את פיפטות בעל צנצנת פיפטות עם קצה פיפטה פונה כלפי מעלה (ראה טבלה של חומרים).
   שים לב: בצע שלבים 1.4-1.6 בשכונה fume כימי מאוורר היטב.
4. לערבב את התערובת siliconization המורכבת טיפה 1 (~ 150 µL) של bis (דלמטלמינו) דימתיל silane ו 10 טיפות של tetrachloride פחמן (ראה טבלה של חומרים).
5. שופכים את התערובת siliconization לתוך הצנצנת וסגור המכסה הדוק.
6. דגירה את הצנצנת עם התערובת siliconization במשך 24-48 שעות בשכונה fume כימי בטמפרטורת החדר עד התערובת הוא התאדו לגמרי.
7. מילוי רקע פיפטה עם שרף יון סלקטיבי המתאים כדי ליצור עמודה של 2-4 מ מ.
   הערה: מימן ionophore אני קוקטייל B יכול להיות פעילות NHE לבנייתם הקלטה (ראה טבלה של חומרים).
8. הקש על קצה פיפטה להפיץ שרף סלקטיבית יון עד הקצה, ולמקם את פיפטה בצורה אנכית בתוך המחזיק צנצנת עם קצה פיפטה למטה.
9. מתחת למיקרוסקופ ויבתר הקוקטייל שרף הגיע הסוף של הקצה. אם יש צורך, הפעילו לחץ חיובי כדי לדחוף את השרף עד הסוף.
10. מילוי החצי-פיפטה עם הפתרון המתאים (~ 100 μL). . הנה, תשתמש 100 מ מ אשלגן ו- 10 מ מ HEPES ב- pH 7.0 אם משתמש ionophore אני קוקטייל B.
11. להתחבר את ISE אלקטרומטר ולמקם את קצה ISE בתוך תמיסת אמבט משמש הקלטה. אפס את אלקטרומטר.
12. בדיקת ה⁺-תגובה סלקטיבית ISE על-ידי שינוי ה-pH של התמיסה אמבט. ה ממוצע⁺-התגובה ISE סלקטיבית היא ~ 58 mV ליחידה של pH.
13. מעת לעת להעריך את ההיענות ISE כיול.

2. הכנת מלחציים תיקון סיליקון עבור הקלטת

הערה: השיטה המתוארת על ידי דונלד Hilgemann במאמרו על ערוץ אחד הקלטה²¹ מומלץ.

1. משוך את פיפטות ענק תיקון של נימים זכוכית בורוסיליקט (2.0 mmOD / 1.5 ממ ת. ז)^22,232,פולר פיפטה.
2. שימוש microforge רכוב על השלב של מיקרוסקופ הפוכה להגיע עם פיפטה רחב עצה (10-22 μm)²³. להמיס חרוז (~ 0.5 מ ל) של זכוכית רכה על החוט פלטינה עבה של microforge.
   הערה: פלטינה חוט עבה יחסית נדרש (~0.5 מ"מ) כדי לבדות פיפטות ענק תיקון.
3. מקם את פיפטה תיקון קרוב חרוז זכוכית רכה, ולהחיל חום מלא עד הקצה מתחילה לסגת. החוט פלטינה יעביר מעט לכיוון centerduring חימום.
4. לכבות את האש, דחפו את הטיפ פיפטה חרוז זכוכית מרוככת. החוט קירור תמשוך ולשבור את הטיפ פיפטה.
5. להחיל מחדש את החום כדי להחליק את הטיפ פיפטה וליצור טיפ פיפטה לקוטר הרצוי. הקוטר של הקצה תלויה בגודל של התא להיות שתוקנה (8-10 μm במחקר זה).

3. הכנה של תאים

1. לחמם מלוחים מאגר פוספט (PBS) ללא Ca^{2 +} , Mg^{2 +}, טריפסין-EDTA פתרון מדיום הגידול ל- 37 מעלות צלזיוס.
2. רחץ תאים פעמיים עם PBS. השתמש 1 מ"ל של המאגר לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.
3. להוסיף 0.5 מ של טריפסין בתאי לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.
   הערה: כאשר התאים מתחילים מצוד, נענעי את הצלחת לצרף מבטל את התאים.
4. עצרי טריפסין על-ידי הוספת 5 מ ל (כמות לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ) של מדיום הגידול מלאה בתוספת 10% סרום שור בעובר.
   הערה: זמן התגובה של טריפסין הוא סוג התא התלויים.
5. המקום התאים על מטרף עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.
6. השתמש תאים עבור עד 2 שעות לאחר trypsinization.
   הערה: הזמן עשויים להשתנות בהתאם לקו תא.

4. הכנת מערכת זלוף אינטרה-פיפטה

1. חתך בגודל המתאים של קוורץ אבובים (150 מיקרומטר OD / 75 מיקרומטר ID) כדי להכין את הקו זלוף אינטרה-פיפטה.
2. הכנס צד אחד של הצנרת קוורץ טיפ פיפטה µL 200. הדבק את הצנרור קוורץ על הטיפ, לחתוך את הקצה של הקצה עם סכין גילוח חד.
3. להתחבר לקו זלוף (קוורץ אבובים דבוק אל קצה) חתיכה קטנה של צינורות סיליקון שישמש מאגר עבור הפתרון זלוף אינטרה-פיפטה.
4. להתחבר לאורך צינור סיליקון מזרק כדי ליצור לחץ חיובי.
5. הוספה הסוף חינם של הצנרת קוורץ דרך הצינורית פוליאתילן של בעל פיפטה זלוף פורט (ראה טבלה של חומרים).
6. להעריך את הקו זלוף עם הפתרון פיפטה.

5. אופן ההכנה של פתרונות

1. להכין פתרון פיפטה בכבדות במאגר הקלטה NHE (115 מ מ אשלגן אספרטט (KAsp), 1 מ"מ EGTA, 0.5 מ מ MgCl₂, 10 מ מ ג-ATP, 12.5 מ מ HEPES, צינורות 12.5 מ מ, המגבים 12.5 מ מ ו- 12.5 מ מ MES, pH 6.0 מותאם עם חומצה אספרטית).
   הערה: להכין את מניות פיפטה פתרון סינון. הוסף Mg-ATP לפני הקלטה.
2. להכין פתרון אמבט טרי בכל פעם (140 מ"מ NaCl, מ מ 2 CaCl₂, 2 מ מ MgCl₂ו- pH טריס-HCl 0.1 מ מ 8.2).

6. רישום של פעילות טרנספורטר

1. לשמור על חדר ההקלטה ואת כל הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס, כי פעילות טרנספורטר היא תלוית טמפרטורה.
2. מקם את התאים אל החדר הקלטה. חכו עד שהם להוריד לחלק התחתון של החדר, אבל אל תתנו להם לצרף אל התא.
3. בחר תא המתאים. למדוד את הקוטר של התא עם עינית מיקרומטר. בחר תאים עם קטרים דומה.
   הערה: בדרך כלל, תא גדול יהיה השטח התאים ואולי יותר מובילי הביע על קרום פלזמה שלה, וכך גם יש יותר פעילות המשלח. עם זאת, זה לא בהכרח נכון, כמו פעילות טרנספורטר תלוי ספציפית לגבי המעלית ואת סוג התא שנבחנה.
4. הר על פיפטה microelectrode יון סלקטיבית כדי micromanipulator, מילוי פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה עם הפתרון תאיים, עליך לוודא כי הפתרון מגיע הטיפ של פיפטה².
   הערה: זה עשוי לדרוש הברזים עדין מספר לחסל בועות על חוד פיפטה.
5. הר של פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה ראש לשלב אלקטרופיזיולוגיה להגדיר^22,2,23.
   הערה: חשוב לשמור על הבמה ראש על זווית 45 מעלות לציר האופקי, זה מבטיח זווית הכניסה עבור פיפטה מתאים היווצרות של גושפנקה עמיד מאוד.
6. החל לחץ חיובי קטן (~ 5 ס"מ H₂O) על פיפטה תיקון כדי להקטין את הסיכוי של חוסם את הטיפ, ומניחים אותו בתוך תמיסת אמבט.
7. . תפסיק לזוז על פיפטה מלחציים תיקון פעם הטיפ הוא קרוב התא.
8. לשחרר את הלחץ חיובי בעוד פיפטה נוגע התא והפעילו לחץ שלילי קלה (~ 5 ס"מ H₂O) כדי להשיג > 1000 MΩ (גיגה אוהם) חותם על קרום התא עם התיקון פיפטה²³.
9. למקם את פיפטה תיקון עם התא באותו מישור מוקד כמו ISE ולהזיז את פיפטה תיקון עם התא בסמיכות ISE (~ 5-10 מיקרומטר)^2,5 אלא למנוע ומאפשר את התא כדי לפנות את ISE (איור 1 א').
10. להבטיח כי החזקת פוטנציאלי הוא 0 mV.
11. קרע את החותם עם סדרת ראספים קצר כדי להשיג את תצורת כל תא.
12. להזיז את ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) לאט משמאל או מעלה-מטה כדי להקליט את הפעילות של המשגר (איור 1B).
13. להקליט את פסגות לפחות 5-8 (איור 1C, מ- A ל- B).
14. החל גל מרובע לפליטת במהלך ההקלטה לעקוב אחר האיכות של החותם, קיבוליות של קרום התא (איור 1).
15. להעריך את שטף H⁺ () מן ההבדל בריכוז H⁺ חינם בין פני השטח תא הפתרון בתפזורת (ΔH⁺)
    
    
    הערה: , H⁺ , מאגר המקדמים של דיפוזיה בהתאמה, B_T הוא ריכוז מאגר הכולל, K_D הוא קבוע דיסוציאציה של המאגר, r הוא התא רדיוס, ו קובע לשינוי מצב יציב הריכוז של ה מאוגד⁺ עבור שינוי קטן חינם H⁺. H⁺ מציין פרוטון חופשי בתמיסה. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, H⁺ פלקסים מומרים השטף אלקטרופיזיולוגיות יחידות על-ידי חישוב של מקבילות הנוכחי פלקסים (/faraday)^3,הרשות הפלסטינית⁵].
16. לנרמל את שטף פרוטון השטח תא זה ניתן לחשב את גודל התא או את קיבול הממברנה.

תוצאות

ISE הפניה עצמית במהלך ההקלטה מלחציים תיקון שלם-תא הוחל ללמוד ויסות פעילות NHE3 על ידי phosphoinositides. PS120 תאי פיברובלסט כמו²⁴, שחסרה את הביטוי של קרום פלזמה אנדוגני NHEs, שימשו. NHE3 פראי-סוג (NHE3-wt) או מוטציות NHE3 זה אין איגוד phosphoinositides [טירוזין 501, ארגינין 503, ליזין 505 היו שהוחלפו עם אלנין, R503A/Y501A/K505A (NHE3-YRK)] היו stably לידי תאי פיברובלסט דמוי PS120¹⁸.

דיון

למרות הפונקציות מכריע של שנאים, השיטות הזמינות ללמוד את פעילותם הן יעילות ואף לא מתאימות. מגבלה אחת היא כי השיטות הזמינות למדוד תנועה יון מתווכת על-ידי טרנספורטר פעילות בלי להתחשב תנודות בהרכב יון תאיים במהלך ניסוי⁴. השיטה הציג מבטיחה שליטה מדויקת של יון חוץ-תאית, תאיים יצירות ומציע כלי רב עוצמה עבור שינוי יון תאיים, חלבון, שומנים בדם יצירות^3,4,5.

הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול ז...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מגבר מהדק תיקון			מולקולריים
אלקטרומטר דיפרנציאלי דו-ערוצי (HiZ-223)	Warner Instruments	64-1650
מגבר דיפרנציאלי (DP-301)	Warner Instruments	64-0044
תוכנת Patch Clamp המבוססת על MatLab	MatLab עם ארגז		תוכנת המכסה מומלצת
מערכת בקרת טמפרטורה ThermoClamp-1	AutoMate Scientific	03-11-LL	מחמם בשורה
בקר טמפרטורה חד ערוץ (TC-324C)	Warner Instruments	64-2400
חבית אחת סטנדרטית בורוסיליקט צינורות זכוכית	Precision Instruments	1B120F-3	משמש לאלקטרודות סלקטיביות יונים
צנצנת אחסון מיקרופיפטה	מכשירים מדויקים בעולם	E212
ביס(דימתיל-אמינו)דימתילסילן	סיגמא-אולדריץ'	14755-100 מ"ל
פחמן טטרכלוריד	סיגמא-אולדריץ'	319961-500 מ"ל
מימן יונופור I - קוקטייל B	סיגמא-אולדריץ'	95293
צינורות בורוסיליקט קיר דק	מכשיר סאטר	B200-156-15	משמש לפיפטה מהדק תיקון
זכוכית רכה (Corning 8161 Patch Glass)	Warner Instruments	64-0815
צינורות נימי סיליקה (150um OD/75um ID)	Molex (Polymicro Technologies)	106815-0018	משמש למערכת זלוף תוך-פיפטה
אשלגן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	P9333
אשלגן אספרטט	סיגמא-אולדריץ'	A6558
EGTA	סיגמא-אולדריץ'	E3889
מגנזיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	M4880
מגנזיום-ATP	סיגמא-אולדריץ'	A9187
HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H3375
צינורות	סיגמא-אולדריץ'	P6757
MOPS	סיגמא-אולדריץ'	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
סידן כלורי	Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
חומצה הידרוכלורית	Sigma-Aldrich	H1758
Apyrase	Sigma-Aldrich	A6535
פוספטידילינוזיטול(4,5) ביספוספט diC8	דרג Biosciences	P-4508
פוספטידילינוזיטול 3,4,5-טריספופט diC8	Echelon Biosciences	P-3908