הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56631

⸱

26 בינואר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

תקציר

התפתחות המוח הוא תהליך מורכב, שבשליטת באופן מרחבי בעיות מפרק מעברי צבע של אורגניזם ותוכניות תעתיק שונה. בנוסף, שינויים epigenetic כרומטין, כמו היסטון מתילציה, יש תפקיד חשוב עבור ביסוס ושמירה על גורלם תא ספציפי בתוך התהליך הזה. הרוב המכריע של היסטון מתילציה מתרחשת על הזנב היסטון גמיש, הנגיש מכפילי היסטון, מחקים של חלבונים קורא היסטון. לעומת זאת, H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, הייתה שם בפונקציות התפתחותיים שונים. מתילציה H3K79 אבולוציונית כולו, ניתן למצוא מגוון רחב של מינים של הומו ספיינס כדי האפייה. השינוי מתרחש בקרב אוכלוסיות תאים שונים בתוך אורגניזמים, כולל אבות עצבית. המיקום של מתילציה H3K79 בתחום הכדוריים של היסטון 3 מקשה להעריך. כאן, אנו מציגים שיטות כדי לבודד, קדמון קורטיקלית התרבות תאים (CPCs) של רקמת מוח קליפתי עובריים (E11.5-E14.5) או אסטרוציטומה נוירון פרטנית אבות (CGNPs) מרקמות כמחנכת (P5-P7), וכדי ביעילות immunoprecipitate H3K79me2 עבור ה-PCR כמותי (qPCR) ורצף הגנום כולו.

מבוא

הפונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי של המוח הם מורכבים מאוד רגישים לשינויים פיזיים וסביבתיים. המוח מורכב שלושה חלקים כללי הינד-, אמצע, הקדמי, אשר מחוברים עמוקות. בתוך הקדמי, ניתן לחלק את telencephalon של telencephalon הגבי (DT), של telencephalon הגחוני (וי טי). DT של עכברים מורכב שש שכבות קורטיקלית אשר נוצרים בין E11.5 לבין E18.5 אופן "הפוכה"1. VT כולל את הרוחביים ganglionic בפיתוח, המהווים את2,של גרעיני הבסיס3מאוחר יותר. מספר סוגי תאים יכולים להיות מסווגים במערכת העצבים המרכזית יונקים כמו נוירונים, האסטרוציטים או oligodendrocytes להפוך4, אשר להתפתח באופן מרחבי בעיות מפרק5. קודם כל, עצבי ובתאים (NPCs) להצמיח סוגים שונים של נוירונים, interneurons VT ולאחר ההקרנה נוירונים ב- DT, ובהמשך תאי גליה (למשל, האסטרוציטים6). במהלך פיתוח קורטיקלית, השכבה השטחית ביותר (שכבה אני), אשר מכיל תאים Cajal Retzius, נוצר לראשונה. לאחר מכן, בין E12.5 ו E14.5, NPCs צור עצביים לשכבות העמוקות (השישי, V) בזמן בין 14.5, 16.5, אבות להצמיח השכבה העליונה (IV-II) נוירונים7,8. זהות עצביים צוין על ידי מורפוגן-induced בעיות מפרק מרחבי תעתיק תוכניות שונות, בנוסף על-ידי תוכניות epigenetic2.

המוח הקטן, אשר הוא מעורב קואורדינציה, ממוקם על hindbrain ומפתחת בין E10 בערך P20 עכברים9. הוא מכיל קליפת אסטרוציטומה ואת הגרעינים אסטרוציטומה10. קליפת אסטרוציטומה למבוגרים מורכב משלוש שכבות, שבהפסד מולקולרית, השכבה Purkinje תא, השכבה הפנימית ביותר פרטנית המכיל נוירונים פרטנית10. התאים גרגר אסטרוציטומה הנוירונים הקטן ביותר, מייצגים כ- 80% של הנוירונים בכל המוח חוליות11. להתפתח סימנים מקדימים ממוקם באזור נבטי חיצוניים והם נודדים דרך השכבה Purkinje תא היעד שלהם12. כמו ב- telencephalon, ההתפתחות של הצרבלום מוסדר על ידי אורגניזם חשוב מספר, אשר יש פונקציות ספציפיות זמן-מרחב ותלוי וליזום תוכניות תעתיק10מוגדרים.

הפיתוח של שכבות קורטיקליים ו אסטרוציטומה נשלטת על ידי ביטוי גנים ברמת השעתוק של אורגניזם מסוים ועל, לכן, ידי המדינה כרומטין של ה-DNA. בתצוגה פשוטה, כרומטין הברית יכולה להיות מחולקת euchromatin כפעיל transcriptionally הטרוכרומטין כמו אזורים שקטים transcriptionally. נוקלאוזום היחידה הבסיסית של כרומטין מכיל שני עותקים של כל היסטון הליבה H2A, ויזת עבודה H2B, H3 ו- H4, מוקף 147 בסיסי זוגות של הדנ א13. שינויים היסטוניים עוברות שינוי מאוד post-translationally על ידי מתילציה, acetylation, זרחון, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, דיאמינציה פרולין isomerization14,15. היסטון ליזין מתילציה נחשב השינוי היסטון היציב ביותר ששולטת שעתוק, שכפול, רקומבינציה16, נזק לדנ א תגובה17, ו החתמה גנומית18. Lysines יכול להיות מונו, di- או תלת-מפוגל19 , מופיעים לא רק על זנבות היסטון נגיש, אלא גם בתוך תחום הכדוריים של שינויים היסטוניים20. Methylations ספציפי ב H3K4 ו H3K36 קשורים בעיקר עם euchromatin, methylations מסוים H3K9, H3K27 או H4K20 מצויים בעיקר באזורים heterochromatic, למרות כל שאריות ממוקמים בתוך הזנב היסטון14, 19,21. מתילציה H3K79 הינו ממוקם בתוך תחום הכדוריים היסטון, שויכה פעילות גנים ברמת השעתוק, אבל גם עם אזורים גנומית אינרטי transcriptionally22. השינוי אבולוציונית כולו מאז זה נצפתה שמרים, התימוס עגל, עוף ו האנושי23. מונו H3K79 di, trimethylation (H3K79me1, me2, me3) הם מזורז על ידי24,methyltransferases DOT1L25 היסטון גרעיני להגדיר תחום המכיל חלבון 2 (Nsd2)26. DOT1L הייתה שם התפשטות, DNA לתקן ו סלולריים reprograming27. אובדן Dot1l בעכברים מוביל למוות טרום לידתי סביב28,E10.529שלב התפתחותי. במהלך התפתחות הלב, בידול myocardiocyte, DOT1L חיוני עבור ג'ין ביטוי תקנה30. במערכת העצבים המרכזית, פונקציה DOT1L עשוי להיות מעורב בשפופרת פגמים בתעלה פיתוח31, מעורב בדיכוי Tbr1-ביטוי במהלך פיתוח הקדמי32, עשוי לתפקד בוויסות של ER-מתח התגובה הגנים33. תלויי-הקשר הפעלה או המדחיק הפעולה של H3K79me, במיוחד עם ויוו מצבים כמו הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית, הוא תאריך רק חלקית הבין32. מאז H3K79 מתילציה ממוקם בתחום הכדוריים היסטון 3, זה sterically פחות נגיש לעומת שינויים על זנבות היסטון גמיש23. כדי להבין את תפקוד H3K79 מתילציה, דרושות שיטות ניתוח לשחזור ואמין כדי לקבוע את מיקום שלה ואת הסביבה גנומית. שיטות העבודה אנו מציגים שיטות בידוד של אבות עצביות שונות (CPCs של קליפת המוח) ו- CGNPs עבור המוח הקטן, טיפול יעיל של מעכבי DOT1L שיטה שבב לנתח מתילציה H3K79 דרך qPCR או רצף זמן שונים נקודות במהלך הפיתוח קורטיקליים ו אסטרוציטומה. לקבלת מבט כולל על הפרוטוקול והאפשרויות שלה, ראה איור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

רווחת בעלי חיים ועדות של אוניברסיטת פרייבורג, רשויות מקומיות אישר כל ניסויים בבעלי חיים (G12/13, G16/11) מצויה בפרוטוקול הבא.

1. תכשירים

  1. ההכנות CPCs בידוד
    1. להגדיר מתוזמן ההזדווגות, כדי להשיג את העוברים בשלבים שונים של התפתחות קליפת המוח (בין E11.5 ו E14.5). השתמש עכברים של המתח NMRI (מכון מחקר רפואי חיל הים) אשר לפחות בן 8 שבועות. לאחר ההזדווגות, שקול פקק הנרתיק חיובי ב- E0.5.
    2. יש מספיק חומר, השתמש המלטה אחת של עכברים NMRI עבור שבב אחד H3K79me2 של cortices של E12.5 או E14.5. עבור מאוחר יותר העובריים, השתמש המלטה אחת עבור ניתוחים שבב נוסף (המלטה הגודל NMRI הממוצע: 10 עוברי).
    3. Precool Hank´s מאוזנת מלח פתרון (HBSS), באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 4 ° C (לאחסון לטווח ארוך ב RT).
    4. Equilibrate 4 ° C המאוחסן טריפסין-EDTA (0.05% w/v) ל- 37 מעלות צלזיוס.
    5. הכן תאים קורטיקליים בינוני (CCM): תוספת האמצעי עבור נוירונים (ראה טבלה של חומרים) עם ריכוזים הסופי של תוספת של 2% (v/v) B-27, 5 µg/mL Apo-Transferrin, 1 µg/mL גלוטתיון, 0.5 מ מגלוטמין, µg 0.8/mL סופראוקסיד דיסמוטאז ו- 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין-Neomycin תערובת לאנטיביוטיקה. אחסן אותו ב 4 º C. לניסוי, equilibrate של המדיום כדי 37 מעלות צלזיוס.
    6. הפשרת סרום עגל עוברית (FCS), aliquot אותו (50 מ ל כל אחד), ו equilibrate aliquot אחד 37 מעלות (לאחסון לטווח ארוך ב-20 ° C).
    7. להכין מניות של 1 DNAse (10 מ"ג/מ"ל) ב- H2O תרבית תאים. חנות aliquots ב-20 ° C.
    8. אם יש צורך, להמיס ספציפי מעכבי DOT1L EPZ-5676 או SGC0946 ב דימתיל סולפוקסיד כדי ריכוז מניות של 100 מ מ. חלות של הריכוז בסוף של 1-5 מיקרומטר התאים ביום 0 והחלה המדכא כל יומיים.
    9. לטיפוח עלות לקליק, מעיל תא תרבות צלחות (טוב 6 או 12 טוב) עם מנות פולי-L-ornithine (1 מ"ג/מ"ל ב- pH פנמיות 150 מ מ 8.4) במשך לפחות שעה-RT ואחר כך עם laminin (1 מ"ג/מ"ל) CCM בינוני ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. ההכנות CGNP בידוד
    1. לארגן את הזיווג המתאים של עכברים ליצירת חיות P5-P7 בידוד של הצרבלום (3-5 בעלי חיים לכל שבב ותנאי).
    2. להכין HBSS/גלוקוז על-ידי הוספת 6 מ"ג/מ"ל גלוקוז למאגר HBSS.
    3. להכין את המדיום תרבות תא CGNP (CGM) על-ידי הוספת תוספת של 1% (v/v) N2, 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין-Neomycin, 25 מ מ של FCS אשלגן ו-10% ל- DMEM-F12. לטיפוח CGNP להכין CGM בינונית ללא FCS אבל כולל µg/mL 0.6 סוניק הקיפוד (ששש) (CGM-ששש), equilibrate אותו ל- C ° 37 בעת הצורך.
    4. מעיל תא. ובכן 6 צלחות תרבות עם 100 µg/mL פולי-D-ליזין עבור h 1-2-RT להסרת תאים עכשיו, דונלד. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם ddH סטרילי2O ולתת את הצלחות יבש. חנות את הלוחיות לשבוע אחד מרבי-4 מעלות צלזיוס.
    5. קומפלקסים CGNPs מעיל 6-ובכן תא תרבות צלחות עם פולי-L-ornithine (0.1 מ"ג/מ"ל) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן לשטוף פעמיים עם H2O תרבית תאים ולתת את הצלחות יבש.
      הערה: הלוחות ניתן לאחסן במשך שבוע אחד מרבי-4 מעלות צלזיוס.
    6. להכין 0.025% טריפסין (w/v) ב- HBSS/גלוקוז, equilibrate אותו ל- C ° 37 בעת הצורך.
  3. ההכנות שבב של H3K79me2
    1. להכין מחברים (1% ב- PBS, pH 8) טרי לפני crosslinking כרומטין. כדי להכין PFA מחממים 50 מ ל PBS במיקרוגל ל מרבי 65 ° C. במהלך בחישה מתמדת להוסיף 0.5 מ ג כדורגלן טוב, מגניב. לאחר מכן להוסיף 50 µL 10 M NaOH, חכה עד PFA היא התפרקה. לאחר מכן, להוסיף 42.5 µL HCl (37% v/v) כדי לקבל pH של 8. בדוק שוב את ה-pH ולהגיע מכן לאפשר הפתרון PFA 1% RT.
    2. הכנת המלאי של RNase (1 מ"ג/מ"ל), Proteinase K (20 µg/µL) סטרילי ddH בנפרד בתוך2O. לאחסן את aliquots ב-20 ° C.
    3. להכין את מאגרי הבאות ואת ריאגנטים: PBS המכיל 0.02% Tween, פירוק מאגר, גליצין, מאגר דילול, צ'יפ מאגר 1, שבב מאגר 2, שבב מאגר 3 ו- TE מאגר ואחסן אותם ב 4 º C. הכנת המאגר • תנאי טרי בכל פעם.
      1. להכין PBS המכיל 0.02% Tween. החנות עבור רוב שבוע ב 4 º C.
      2. להכין מאגר פירוק באמצעות 50 מ"מ טריס ב pH 8.0, 10 מ מ EDTA, dodecyl 1% (w/v) נתרן גופרתי (מרחביות) ו 1 x מעכב פרוטאז.
      3. להכין גליצין 2.5 מטר.
      4. להכין מאגר דילול באמצעות 20 מ מ טריס ב- pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) טריטון X-100 0.25% (w/v) מרחביות, 1 x מעכב פרוטאז.
      5. להכין מאגר שבב 1 באמצעות 20 מ מ טריס ב- pH 8.0, 150 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) טריטון X-100, 0.2% (w/v) מרחביות.
      6. להכין מאגר שבב 2 באמצעות 20 מ מ טריס pH 8.0, 500 מ מ NaCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) טריטון X-100, 0.2% (w/v) מרחביות.
      7. להכין את השבב מאגר 3 באמצעות 20 מ מ טריס pH 8.0, 250 מ מ LiCl, 2 מ מ EDTA, 1% (v/v) NP-40 ו- 1% (w/v) מרחביות.
      8. להכין מאגר טה באמצעות 20 מ מ טריס pH 8.0 ו- 2 מ מ EDTA.
      9. להכין טרי • תנאי מאגר המכיל 1% (w/v) מרחביות, 100 מ מ NaHCO3.

2. העצבית קדמון בידוד של רקמת המוח

  1. בידוד וטיפוח אופציונלי של CPCs
    1. המתת חסד החיות בהריון מאת נקע בצוואר הרחם ולהעביר את העוברים HBSS קר כקרח.
    2. אסיר את הגולגולת במספריים לבודד את המוח ואז להסיר את קרומי המוח, במידת הצורך, עם מלקחיים קטנים, ולבודד cortices (שלם, DT או VT) של שתי ההמיספרות על-ידי הסרת כל חלקים אחרים במוח מתחת למיקרוסקופ המשקפת באמצעות מלקחיים קטנים, וכן, אם הצורך, קטנים מספריים. לאחסן את cortices מבודדים במאגר HBSS מ ב 4 ° C בשפופרת 15 מ"ל.
    3. Centrifuge את החומר המוח מבודדים עבור 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    4. לשטוף את cortices עם 5 מ"ל HBSS קר כקרח, homogenize אותם עם טיפ פיפטה 1 מ"ל על-ידי pipetting למעלה ולמטה. במידת הצורך, חותכים את קצה קצה פיפטה.
    5. Centrifuge הדגימה homogenized במשך 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. להסיר את HBSS.
    6. להוסיף 3 מ"ל טריפסין, דגירה המדגם למשך 5 דקות ב 37 º C.
    7. להוסיף 1 מ"ל FCS, 5 מ ל CCM ו 30 µL של DNase 1 המדגם, homogenize את הדגימה עם פיפטה זכוכית 5 מ ל על-ידי pipetting בזהירות למעלה ולמטה.
    8. Centrifuge התאים מבודדים למשך 5 דקות ב 1000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, הוסף 5 מ ל CCM, homogenize את הדגימה שוב.
    9. לדלל עם aliquot של המדגם, תספור עם נויבאואר סופר-תא כמות ממוצעת של 4.5 x 106 תאים לכל העובר צפוי. קומפלקסים CPCs מבודדים המשך עם צעד 2.1.10. שבב, ומיד להמשיך את שלב 3.
    10. לטיפוח-תרגול, צלחת CPCs על פולי-L-ornithine (0.1 mg/mL) ועל laminin (1 מ"ג/מ"ל) מצופה מנות ב צפיפות בין 8 x 104 ו- 2.5 10x5 תאים/cm2 CCM בינוני, דגירה אותם ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 100% לחות יחסית.
    11. מאז CPCs להפעיל להבדיל לתוך הנוירונים בתרבית תאים (לאחר כ 4 ימים), שקול את התאריך לנתיחה כמו יום במבחנה 0 (יום 0). עבור התנאים יותר של טיפוח-תרגול, לשנות חצי של המדיום כל היום הרביעי בינונית CCM טריים.
    12. החלת 1-5 מיקרומטר SGC0946 או EPZ5676 מומס דימתיל סולפוקסיד ביום 0 (4-5 שעות לאחר בידוד תא) ולרענן אותו בכל יום שני. השתמש דימתיל סולפוקסיד כטיפול שליטה. לבדוק את היעילות של טיפול המדכא באמצעות שיטות immunoblot סטנדרטי, אם נדרש.
  2. בידוד וטיפוח אופציונלי של CGNPs
    1. המתת חסד חיות P5-7 ע י עריפת ראשו באמצעות מספריים. מסירים את העור בקרקפת, לפתוח את הגולגולת, מסירים את המוח באמצעות מספריים קטנים וחדים. לבודד את המוח הקטן, להעביר אותו HBSS הקר/גלוקוז. הסר כל קרומי המוח וכלי הדם, להעביר את cerebella 15 mL צינורות מלאים HBSS קר/גלוקוז.
    2. לשטוף את cerebella שלוש פעמים עם 10 מ"ל HBSS הקר/גלוקוז (לאסוף אותם על ידי צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 ° C) ו homogenize cerebella לאחר מכן על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 1 מ"ל (המרבי 2 - 3 פעמים) כדי לקבל 0.5-1 מ מ3 שברי.
    3. מוסיפים 5 מ של 0.025% טריפסין HBSS/גלוקוז, דגירה הרקמה תחת ערבוב מתמיד באמבט מים 37 מעלות במשך 15 דקות להפסיק תהליך העיכול על-ידי הוספת 5 מ של CGM, לאסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 º C.
    4. הסר את תגובת שיקוע triturate הרקמה עם טיפ pipet 1 מ"ל ב 1 מ"ל CGM, להעביר אותו צינור 15 מ"ל.
      הערה: חשוב להימנע בועות אוויר.
      1. הוסף 5 מ ב- CGM, דגירה את התערובת למשך 2 דקות על הקרח ליישב את שאריות רקמת. להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור 15 מ"ל. להוסיף 2 מ"ל CGM הרקמה שיורית וחזור על התהליך trituration.
    5. מאגר של supernatants (ללא שאריות רקמת, כ- 10 מ"ל סך הכל), צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את התאים אסטרוציטומה. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל CGM.
    6. מאז האסטרוציטים לדבוק מהר יותר וחזק פולי-D-ליזין מאשר CGNPs, לוחית רישוי התאים על 100 µg/mL פולי-D-ליזין מצופה 6-ובכן-פלטות (עד 4 מ"ל לכל טוב), תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 ° C כדי להסיר את האסטרוציטים.
    7. לנער את הצלחת ולאסוף את תגובת שיקוע. ואז צנטריפוגה-g x 650 עבור 5 דקות ב 4 ° C בשפופרת 15 מ"ל. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל CGM ולספור את התאים עם נויבאואר ספירת קאמרית.
      הערה: CGNPs עגולים, קטנים, ולהראות הילה כאשר צילמו באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב.
    8. אם נדרש, הזרע התאים ב- 37 מעלות צלזיוס מראש חימם CGM על לוחות פולי-L-ornithine-מצופה (3 x 106 תאים לכל 6-טוב), דגירה אותם ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 100% לחות יחסית.
      הערה: אם לא יבוצע זריעה, להמשיך צעד 3.1.
      1. לאחר 6-12 h, חילופי המדיום כדי CGM-ששש. מתייחסים ה CGNPs 6 מבודדים (או בעת שינוי כדי CGM-ששש) לאחר בידוד עם DOT1L-מעכב, דימתיל סולפוקסיד לשלוט, לחדש אותו כל יום שני (השוואה עם 2.1.12). לבדוק את היעילות של טיפול המדכא באמצעות שיטות immunoblot רגיל אם נדרש. שבב, להמשיך עם שלב 3.3.
        הערה: עוזב CGM על הלוחות (ועם זה FBS) תגרום הבידול של CGNPs לתוך הנוירונים פרטנית אסטרוציטומה (CGNs).

3. קיבוע של תאים, הטיה של כרומטין

הערה: בצע שלבים 3.1 ו- 3.2 אם תאים לא מתורבתים, אם הם המשך לשלב 3.3.

  1. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 1,000 x g ולהוסיף 1.3 mL PBS. להעביר את הדגימה צינור 1.5 מ. צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 1000 g x-4 מעלות צלזיוס. לשטוף את הדגימה פעמיים עם 1.3 mL PBS.
  2. שלב קריטי: הוסף 350 µL 1% PFA לדגימת דגירה זה עבור 5 דקות-22 מעלות צלזיוס. כדי להפסיק את התגובה, הוסף 18.4 גליצין µL PBS 1 מ"ל. Centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב 1000 g x-4 מעלות צלזיוס.
    1. לשטוף את הדגימה פעמיים עם PBS קר כקרח. לאסוף את התאים קבוע על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. שומרים את הדגימות על קרח מכאן ואילך.
      הערה: הזמן קיבוע חייב להיות בדיוק 5 דקות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. מספרי הטלפון הנייד שונים עשויים לדרוש זמן עיבודים.
  3. שלב קריטי: בתרבית CGNPs (או CPCs), להוסיף עד 1 מ ל 1% מחברים ישירות אל הבארות צלחת של התרבות תאים. לאחר דגירה 5 דקות ב 22 ° C, להוסיף כמות מספקת של גליצין ו- PBS, לקצור את התאים עם המגרד התא.
    1. להעביר את התאים לתוך צינורות 1.5 mL ו- centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב 1,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את הדגימה פעמיים עם PBS קר כקרח. לאסוף את התאים קבוע על ידי צנטריפוגה עבור 5 minat 1,000 x g ב 4 º C. שומרים את הדגימות על קרח מכאן ואילך.
  4. שלב קריטי: להוסיף 700 µL של פירוק מאגר (+ מעכב פרוטאז), דגירה המדגם למשך 15 דקות ב 4 º C. מערבולת המדגם בכל 5 דק להטות את כרומטין של התאים lysed 3 x 10 דקות sonicator (30 s דופק, השהה s 30) בעוצמה המרבית.
    1. ודא כי אמצעי האחסון אינו עולה על 350 µL למחזור. מערבולת הדגימות בכל 10 דקות לבדוק את lysate עבור גרעינים הנותרים עם מיקרוסקופ שלב-ניגודיות.
      הערה: חשוב להשיג תוצאות אופטימליות ההטיה (השוואה עם איור 1B) לניתוח בשלב מאוחר יותר. במקרה של שימוש בשיטות אחרות עבור הגז של כרומטין, למטב את הטיית כדי כרומטין שברים בגודל בין 200-500 bp.
  5. גלולה תא שרידים במשך 10 דקות, 13,000 x g, 4 מעלות צלזיוס. השתמש את תגובת שיקוע על הצעד preclearing 5.2. להקפיא את הדגימה ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר, אם יש צורך בכך.

4. הכנת חרוזים, Preclearing

  1. לשטוף 45 µL חלבון א' מגנטי חרוזים/צ'יפ, 20 µL מגנטי חרוזים/ולטעום עם 1 מ"ל PBS קר כקרח המכיל 0.02% Tween שלוש פעמים באמצעות עמדה מגנטי. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של PBS קר כקרח החרוזים.
  2. 1 מ"ל PBS קר כקרח, חרוזים µL 45/צ'יפ, להוסיף 3 µg של נוגדן/צ'יפס (H3K79me2 או ארנב IgG). דגירה הדגימות עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס על מסובב כדי לאגד הנוגדנים החרוזים. בהתאם הנוגדן, להשתמש נוגדנים µg ~ 3/צ'יפ.
  3. לשטוף את הנוגדן-המאוגד-החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS קר כקרח המכיל 0.02% Tween. להוסיף את אמצעי האחסון המתאים חרוז (החל ףקיהב beads מגנטי משמש) ל- PBS קר כקרח שטף הנוגדן-בשילוב-החרוזים.
  4. להוסיף µL 600 דילול מאגר µL 20 של חרוזים שטף מגנטי המדגם עבור preclearing (µL הנפח הכולל 1,320), תקופת דגירה של 2 h-4 מעלות צלזיוס על מסובב. הסר את החרוזים באמצעות עמדה מגנטי. . קח 5% (33 µL) lysates כמו דגימות קלט ומקפיאים ב-20 ° C.

5. כרומטין Immunoprecipitation

  1. לחלק את תמצית precleared שני צינורות (כ 643.5 µL), להוסיף באותו אמצעי אחסון של דילול מאגר, הנוגדן-המאוגד-החרוזים (45 µL מדגם; H3K79me2 או ארנב IgG). דגירה הדגימות-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מסובב.
  2. לשטוף את החרוזים עם צ'יפ כקרח מאגר 1, שבב מאגר 2 שבב מאגר 3 10 דקות כל ב 4 ° C-מסובב. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם טה המאגר עבור 5 דקות ב 4 ° C-מסובב.
  3. Elute את החרוזים עם מאגר • תנאי עבור h 1-1400 סל ד ב שייקר בטמפרטורת החדר.
  4. להוסיף 10 µg RNase (1 מ"ג/מ"ל) לכל שבב מדגם 5 µg הדגימות קלט, דגירה בדגימות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (1,400 סל ד).
  5. להוסיף 100 µg Proteinase K (20 µg/µL) לכל שבב µg 50 לכל קלט ולדגום, דגירה בין לילה ב 65 ° C ב- 1400 סל ד.

6. טיהור של שבב דגימות

  1. לטהר את השבב ודוגמאות קלט בטהרה ה-DNA קיט (ראה טבלה של חומרים) לפי ספר ההוראות. השתמש עמודות טיהור נוספות כאשר יותר מ 5 µg של ה-DNA הוא צפוי. Elute הדגימה עם 2 x 15 µL של המאגר • תנאי ה-DNA המסופק בערכה.
  2. לבצע כימות של הדגימות (השתמש 1 µL) על-ידי שימוש של fluorophore visualizing fluorospectrometer (ראה טבלה של חומרים).

7. ניתוח דוגמאות שבב ויה qPCR

  1. לעיצוב פריימר לניתוח qPCR, לאחזר רצף גנומית של עניין הדפדפן מציג גנומיקה אינטגרטיבית (igv ב)34. עיצוב תחל סביב האתר התחלה תעתיק (TSS) של הגן, מאז H3K79me2 סביר להניח להימצא שם. כפקד, שקול ללא קידוד גנומית אזורים או אזורים בערך 10 Kb במעלה הזרם של TSS או 10 Kb במורד הזרם של הסוף גנים ברמת השעתוק באתר (מלון טס).
    1. צור את תחל עם https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ באמצעות שגודל המוצר בין 70 ל- 200 bp של טמפרטורה אופטימלית מוגדרת מראש של 60 מעלות צלזיוס. למטרת ניסיון, השתמש תחל עבור אזורים גנומית Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3, ו Npm1 המפורטים בטבלה1.
  2. הבדיקה תחל החדש תוכנן עם התוכנית הבאה של qPCR, מיקס מאסטר של שינוי טמפרטורה מחזק בין 58 ° C 63 ° C, ובחרו את הטמפרטורה מחזק עם המוצר ובאיכות הגבוהה.
    1. החל דנ א בג'ל לשלוט על גודל המוצר הצפוי. לניתוח qPCR, להשתמש בזמן אמת PCR לזיהוי במערכת (ראה טבלה של חומרים).
    2. הכנת המיקס הראשי באמצעות DNA פולימראז µL 10 מיקס מאסטר, פריימר µL 0.5 קדימה (10 מיקרומטר), 0.5 פריימר µL הפוכה (10 מיקרומטר), מים ללא נוקלאז µL 4 5 µL דנ א (1 ng/µL).
    3. השתמש בתוכנית qPCR 2 שלבים כדלקמן: 5 דקות ב 95 ° C, 50 x (30 s ב 95 ° C, 30 s-58 ° C - 63 ° C), ומילוי הדרגתי דנטורציה בקביעות ב 4 º C.
  3. צור סידרה דילול של דגימות דנ א גנומי, הוטו, מטוהרים (2 ng/µL, 1 ng/µL, 0.5 ng/µL, 0.25 ng/µL ו 0.125 ng/µL) ומשתמשים 5 µL בדיקת יעילות השימוש qPCR. לקבוע את השיפוע של העקומה סטנדרטי ולחשב את היעילות פריימר על ידי הנוסחה הבאה:
    יעילות (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. השתמש תחל עם יעילות בין 90% ל- 105% בתיק אידיאלי, או לפחות עם יעילות בין 85% ל- 115%.
  4. כדי לנתח את השבב ודוגמאות קלט, החל 0.1-1 ng של שבב ה-DNA מעורבב עם קדימה בהתאמה ומערבבים הפוכה פריימר נטול נוקלאז ומים DNA פולימראז מאסטר בנפח סופי של 20 µL עבור כל תגובה qPCR.
  5. לקבוע את הערכים מחזור (סיטי) הסף של שבב ודוגמאות קלט, לנרמל את הדגימה Ct Ct ערכים של קלט כדי לחשב העשרה (% קלט) עם הנוסחה הבאה. השימוש Ct ערכים המתקבל IgG הבקרה כדי לקבוע את רמת רקע.
    קלט % = 100-2^(− קלט norm. הנורמה. שבב)
    . נורם. קלט = Ct (קלט) − יומן2(דילול פקטור)
    . נורם. שבב = Ct (ChIP) − יומן2(דילול פקטור)
    הערה: הנורמה. = מנורמל

8. ניתוח דוגמאות שבב באמצעות רצף

  1. להעביר את הדגימות שבב (קלט ו immunoprecipitated דנ א) מתקן רצף.
  2. כדי להכין ספריית שימוש מראש, הכנה הספריה המתאימה קיט (ראה טבלה של חומרים) ולהמיר 2 ng של הקלט DNA והכל ב dna immunoprecipitated לתוך ספריות אינדקס עבור הדור הבא מגה-פלקס רצף- ציינו פלטפורמה (ראה טבלה של חומרים).
  3. שלב קריטי: בעקבות ההוראות קיט, מאתרים ומפסיקים רצף מתאמים (עם ריכוז העבודה של 15 מיקרומטר) לסיים את שברי DNA לתיקון, דה-זנב. רצף מתאמים ו- PCR תחל לשימוש המתאים oligos (ראה טבלה של חומרים). עבור סכום זה של קלט ה-DNA, להשתמש 6-9 מחזורים PCR להעשיר את שברי DNA מתאם מאתרים.
    הערה: בדרך כלל, אין צורך לבצע מבחר בגודל של ה-DNA של מתאם מאתרים. מומלץ להשתמש בכמה מחזורים PCR ככל האפשר, שכן רבים PCR הגברה תוצאה מחזורים PCR כפילויות דעה קדומה GC גבוהה.
  4. בדיקת ספריית הסופי, סעו µL 0.5 התגובה הכולל עבור ניתוח כדי להמחיש את גודל הפצה על התקן המתאים (ראה טבלה של חומרים). על כימות, השתמש צבע visualizing בשילוב עם fluorospectrometer או בשיטות אחרות (ראה טבלה של חומרים).
  5. מאז H3K79me2 שנראה שינוי היסטון, אשר משתרע בהרחבה על אזורים גדולים יותר גנומית, רצף מדגמים מזווגים-הסוף באורך קריאה של 50 bp, עם עומק רצף הקריאות Mio 75.
  6. לנתח את השבב-seq הנתונים עם השרת פרייבורג גלקסי/אוני (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. לבצע בקרת איכות עם ChIPseq שהושג עם FastQC ו, ובמידת הצורך, למפות אותן ישירות עם Bowtie2 גירסה 2.2.035 עם או בלי חיתוך. התייחסות מכלול הגנום להשתמש mm9 או את mm10 בגירסה החדשה; כמו התייחסות ביאור Ensembl FTP לשחרר 79.
  8. אופציונלי: הסר קרא כפילויות באמצעות פיקארד MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) לפני שיא הביקור.
  9. לקרוא פסגות עם MACS2 גירסה 2.1.036 שימוש באפשרות 'הרחב' עבור H3K79me2.
  10. כדי לקבל יחס2 יומן השבב בין מדגם קלט, יומן2 של מספר קריאות הקריאות היחס בין שתי דגימות להשתמש BamCoverage BamCompare.
  11. עבור כל שאר שבב-seq ספציפי ניתוח מעמיק, החל deepTools2 בגירסה 2.3.5 או 2.4.137, דהיינו כדי ליצור קבצי מעקב אחר כיסוי (bamCoverage עבור השבב בלבד, bamCompare לשם השוואה של צ'יפ לכניסה), כדי לאמוד השבב ביצועים להשתמש plotFingerprint ולהשתמש ליצור סקירה כללית computeMatrix, plotHeatmap. בחר K-התכוונתי קיבוץ באשכולות במהלך תהליך computeMatrix אשכול גנומית אזורים על-פי ההתפלגות H3K79me2.
  12. שימוש לאור הנתונים שבב-seq H3K79me2 של E14.5 DT שהופקדו-NCBI למטרת ניסיון (מספר גישה: SRP057733).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ערכת כללי של קדמון העצבי בידוד, טיפוח, שבב H3K79me2 ושיטות ניתוח שבב: איור 1 מציג תרשים זרימה כדי לבצע שבב H3K79me2 של ובתאים קורטיקלית בנקודות זמן שונות במהלך התפתחות המוח עובריים או של נוירון פרטנית אסטרוציטומה אבות בשלבים כמחנכת. כצעד ראשון, המוח צריך להיות מבודד, את telencephalon (בין E11.5 ו E14.5) או המוח הקטן (P5-P7) יש לאחזר. ניתן לנתח את מחוזות שונים telencephalon על-ידי חלוקתו DT ו VT. לאחר מכן הרקמה להיות הומוגני, המוצא לאגס עצבית ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם שתי דרכים עיקריות לביצוע כרומטין immunoprecipitation כדי לזהות את תפוסת גנומית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, הקוראים קוד היסטון, סופרים או מחקים. אחת היא שיטת צ'יפ מקורי בעזרת נוקלאז מתעכל, יליד כרומטין עבור immunoprecipitation, והשני הוא הציג השיטה באמצעות כרומטין מחברים-קבוע, הוטו, שבו את נוקליאוזומים וחלבונים אחרים צמוד-DNA covalently מאוגדים ל- DNA 39. צ'יפ מקורי עם קצב זיהוי נוגדנים גבוה שלה צריך להיות ישימים עבור היסטון מתילציה מאז כרומטין, methylations היסטון יציבים יחסית לאורך השבב....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים לא מתחרה

תודות

אנו מודים הנרייטה Bertemes שעזרת להקים פרוטוקול טיפוח CGN בתוך המעבדה. הנייר בשיטה זו נתמכה על ידי במימון DFG CRC992 אפיגנטיקה רפואי על ידי מימון לטלוויזיה. המחברים להכיר את התמיכה של קבוצת גלקסי פרייבורג (freiburg): Pavankumar Videm, ביורן Grüning, פרופסור רולף Backofen, ביואינפורמטיקה, אוניברסיטת פרייבורג, גרמניה ממומן על ידי שיתופי מחקר מרכז 992 אפיגנטיקה רפואי (DFG גרנט SFB 992/1/2012) גרמניה הפדרלית שר החינוך ואת המחקר (BMBF גרנט 031 A538A RBC (de. אי)).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Anti-GAPDHAbcamab8245קטגוריה: נוגדן
<חזק>קיצור/תגובה: דילול אימונובלוט 1:5000
אנטי-H3Abcamab1791<חזק>קטגוריה: נוגדן
<חזק>קיצור/תגובה: דילול כתם חיסון 1:3000
אנטי-H3K79me2דיאגנודpAb-051-050<חזק>קטגוריה: נוגדן
<חזק>קיצור/תגובה: נוגדן ChIP
אנטי-H3K79me2Abcamab-051-050<חזק>קטגוריה: נוגדן
<חזק>קיצור/תגובה: דילול כתם חיסון 1:1000
אנטי-ארנב-IgGדיאגנודC15410206<חזק>קטגוריה: נוגדן
<חזק>קיצור/תגובה: נוגדן ChIP Ctrl
אנטי-טובולין אלפאAbcamab108629<חזק>קטגוריה: נוגדן
<חזק>קיצור/תגובה: דילול אימונובלוט 1:3000
אפו-טרנספרין (1 מ"ג/מ"ל)סיגמא-אולדריץ'T1147<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לתוסף CCM
B27 (50x)Life Technologies17504044<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לטכנולוגיות CCM
BioanalyzerAgilent G2940CA<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: לניתוח כרומטין גזוז
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: אולטרסאונד
חומצה בורית pH 8.4סיגמא אולדריץ'B6768<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לתרבית CPC
CFX Connect RT מערכת זיהוי PCRBio-Rad1855201<חזק>קטגוריה: ניתוח ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: מערכת איתור עבור qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: עבור
חלבון CGM Dynabeads AInvitrogen10001Dקטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: חרוזים מגנטיים, עבור ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062<חזק>קטגוריה: עיכוב DOT1L
<חזק>קיצור/תגובה: לעיכוב DOT1L בתרבית תאים
חומצה אתילנדיאמין טטראצטיתSERVA39760.01<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: EDTA
סרום בקר עוברי 10% (v/v)Gibco10082147<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לבידוד CPC ו-CGM
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G5767<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לבידוד CGNP
גלוטתיון (1.25 מ"ג/מ"ל)סיגמא-אולדריץ'G4251<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: עבור CCM
גליציןקארל רות'3187<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: לקיבוע תאים
GoTaq mastermixPromegaA6002<חזק>קטגוריה: ניתוח ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: תערובת מאסטר DNA פולימראז עבור qPCR
האנק' s Balanced Salt SolutionLife Technologies14025-100Category: Cell Culture
קיצור/תגובה: HBSS
L-glutamine (200 מ"מ)Life Technologies25030081Category: Cell Culture
קיצור/תגובה: עבור CCM
LamininSigma-AldrichL2020<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לתרבית CPC
ליתיום כלורידסיגמא-אולדריץ'L4408<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה:
תוסף LiCl N2Life Technologies17502048<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: עבור CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: פלואורוספקטרומטר לכימות DNA
NEB ערכת הכנה לספריית אולטרה DNA הבאה עבור IlluminaNEBE7645S<חזק>קטגוריה: ניתוח ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: ערכה להכנת ספרייה
NEBNext Multiplex Oligos עבור IlluminaNEBE7335<חזק>קטגוריה: ניתוח ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: אוליגוס להכנת ספרייה
מדיום נוירו-בזאליGibco21103049<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: עבור CCM
NP-40 חלופיקלביוכימיה492016<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: עבור מאגר ChIP
ParaformaldehydeCarl Roth335<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: PFA, לקיבוע תאים
פניצילין-סטרפטומיצין-ניאומיצין 1% (v/v)Life Technologies15640055<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: PSN, עבור CCM ו-CGM
פוספט חוצץמלח Life Technologies10010023<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: PBS, לבידוד CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496<חזק>קטגוריה: ניתוח ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: ויזואליזציה של צבע לכימות DNA
פולי-D-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P6407<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לבידוד CGNP
פולי-L-אורניתין הידרוברומידסיגמא אולדריץ'P3655<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לתרבית CPC
אשלגן כלוריתרמו פישרAM9640G<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: KCl, עבור
מעכב פרוטאזCGM רוש4693159001<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: עבור ChIP
פרוטאינאז Kסיגמא-אולדריץ'3115879001<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: עבור ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: ערכה לטיהור DNA
RNAseSigma-AldrichR6513קטגוריה: ChIP
<חזק> קיצור/תגובה: עבור ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: עיכוב DOT1L
קיצור/תגובה: לעיכוב DOT1L בתרבית תאים
נתרן ביקרבונטקארל רות8551.1<חזק>קטגוריה: ChIP
קיצור/תגובה: עבור מאגר אלוטיון
נתרן כלוריקארל רות'9265<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: NaCl, עבור מאגר ChIP
נתרן דאוקסיכולאטסיגמא-אולדריץ'30970<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: עבור נתרן ChIP
דודצילסולפטקארל רות'183<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: SDS, עבור קיפוד ChIP
סוניק (SHH)סיגמא-אולדריץ'SRP6004<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לבידוד CGNP
סופראוקסיד דיסמוטאז (1 מ"ג/מ"ל)סיגמא-אולדריץ'S7571<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: עבור CCM
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneCarl Roth9090Category: ChIP
קיצור/תגובה: TRIS, עבור מאגר ChIP
Triton X-100Carl RothX100<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: עבור מאגר ChIP
טריפסין-EDTA 0,05% (w/v)סיגמא אולדריץ'59417C<חזק>קטגוריה: תרבית תאים
<חזק>קיצור/תגובה: לבידוד CPC
Tween20Carl Roth28320<חזק>קטגוריה: ChIP
<חזק>קיצור/תגובה: להכנת חרוזים
מכשירי מעבדה אחרים: תא ספירת נויבאואר, אינקובטור, מסובב, שייקר, סט חיתוך, אמבט
CCM: מדיום
CGM: מדיום
' מיםתא קליפת המוח תרבית תאים CGNP

מקורות

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
  3. Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).
  4. Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
  5. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
  6. Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
  7. McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
  8. Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
  9. Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. Neuroscience. 162, 549-559 (2009).
  10. Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
  11. Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
  13. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  14. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  15. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  16. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
  17. Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
  18. Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
  19. Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
  20. Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
  21. Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
  22. Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
  23. Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
  24. van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
  25. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  26. Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485(2015).
  27. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
  28. Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190(2008).
  29. Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
  30. Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
  31. Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
  32. Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
  33. Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
  34. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  35. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
  36. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137(2008).
  37. Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
  38. Roidl, D. Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
  39. Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Western BlotqPCR
בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.