הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון

12K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56647

⸱

5 בפברואר 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג במבחנה הדמיה לחיות phagocytosis assay כדי למדוד את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. עכברוש מטוהרים האסטרוציטים מיקרוגלייה משמשים יחד עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. שיטה זו ניתן לזהות בזמן אמת קינטיקה היבלעות והשפלה ומספקת פלטפורמה הקרנה מתאימים כדי לזהות גורמים להתכוונן אסטרוציט phagocytosis.

תקציר

האסטרוציטים סוג התא העיקריים במוח, צור קשר ישירות הסינפסות וכלי הדם. אמנם היה נחשב microglial תאים תאים חיסוניים העיקריים של phagocytes רק במוח, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי האסטרוציטים ישתתפו גם תהליכים phagocytic שונים, כגון סינפסה התפתחותיות לביעור ואישור של פלאק עמילואיד ביתא מחלת אלצהיימר (AD). למרות ממצאים אלה, את היעילות של אסטרוציט היבלעות והשפלות של המטרות שלהם לא ברור של מיקרוגלייה. חוסר מידע הוא בעיקר בשל היעדר מערכת assay שבו קינטיקה של phagocytosis אסטרוציט ו מיקרוגלייה-בתיווך דומות בקלות. כדי להשיג מטרה זו, פיתחנו לטווח ארוך הדמיה לחיות במבחנה phagocytosis assay כדי להעריך את יכולת phagocytic של האסטרוציטים מטוהרים, מיקרוגלייה. זה assay, זיהוי בזמן אמת של היבלעות והשפלה הוא אפשרי באמצעות pH מצומדת מחוון synaptosomes, אשר פולטים פלואורסצנטי אדום בהיר ב organelles חומצי, כגון lysosomes. Assay הרומן שלנו מספקת זיהוי פשוטה ויעילה של phagocytosis באמצעות הדמיה לחיות. בנוסף, זה וזמינותו phagocytosis במבחנה יכול לשמש כפלטפורמה ההקרנה כדי לזהות חומרים כימיים ותרכובות שניתן לשפר או לעכב את יכולת phagocytic של האסטרוציטים. כמו גיזום סינפטית תקלה והצטברות חלבונים פתוגניים הוכחו לגרום הפרעות נפשיות או מחלות ניווניות, כימיקלים, תרכובות לווסת את יכולת phagocytic של תאי גליה אמור לסייע בטיפול שונים הפרעות נוירולוגיות.

מבוא

גלייה, אשר מתייחסות הלא-טמפרמנט תאים במוח, הם סוג התא העיקריים במערכת העצבים המרכזית (CNS). בעבר, גלייה היו נחשבים תאים התומכים גרידא, בעיקר לשחק בתפקידים פסיביים בשמירה על הישרדות עצביים ומאפיינים סינפטית הבזליים. עם זאת, ראיות המתעוררים חשף כי גלייה ממלאים תפקידים פעילים יותר בהיבטים שונים של הנוירו-ביולוגיה, כגון שמירה על הומאוסטזיס המוח, מתווכים סינפסה היווצרות1,2,3 וסינפסה חיסול4,5, להתכוונן הפלסטיות הסינפטית6,7. גלייה ב מערכת העצבים כוללים האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. בין תאים אלה, האסטרוציטים מיקרוגלייה הוכחו ממלאים תפקידים phagocytic על ידי שתבלע הסינפסות4,5, מוות תאים8, פסולת עצבית9ו חלבונים פתוגניים, כגון בטא עמילואיד שלטי10,11. במוח המתפתח, האסטרוציטים לחסל סינפסות הגבי גרעין הברך הצדי (dLGN) עד MERTK ותלוי MEGF10 phagocytosis4. באופן דומה, מיקרוגלייה גם לחסל את הסינפסות מצופים C1q בשלבים התפתחותיים דרך המפל המשלים הקלאסית5. מעניין, הוצע כי פגמים סינפסה גיזום ניתן לאחד היזמים של מספר הפרעות נוירולוגיות. לדוגמה, הוכח כי מוטציות בגן רכיב המשלים 4 (C4), מה שמעלה גיזום סינפסה בתיווך המשלים על-ידי מיקרוגלייה, משויכים מאוד השכיחות של סכיזופרניה בני12. עיתון האחרונות הראו גם כי מסלול המשלים הקלאסית hyperactivated בשלבים חניכה של AD, גורם לאבדן מוקדם סינפסה זו מחלה13.

לעומת phagocytosis בתיווך מיקרוגלייה, אם phagocytosis בתיווך אסטרוציט תורמת החניכה, התקדמות של הפרעות נוירולוגיות שונות הוא פחות ברור. עם זאת, עיתון האחרונות עולה כי גורמים לשנות את הקצב של גיזום סינפסה נורמלי על ידי האסטרוציטים עלול לשבש את המוח הומאוסטזיס, לתרום הרגישות, פתולוגיה לספירה14. הקצב של גיזום סינפסה על ידי האסטרוציטים בעוצמה נשלטת על ידי ספקיות isomers, עם אלל מגן עבור המודעה (ApoE2) בחריפות שיפור הקצב ואת הסיכון אלל עבור המודעה (ApoE4) באופן משמעותי להורדת הקצב. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים ביטוי ApoE4 שהצטברו C1q סינפטית הרבה יותר מאשר השליטה או עכברים ApoE2 14. נתונים אלו מראים כי ליקויי phagocytosis בתיווך אסטרוציט בתחילת המודעה המוח עלול לגרום ההצטברות של פסולת senescent מצופים C1q הסינפסות/סינפטית שמפעיל phagocytosis microglial בתיווך המשלים, נהיגה ניוון סינפטית . הקיבולת phagocytic לקוי של האסטרוציטים ב ApoE4 נושאות עשוי גם לתרום הצטברות הפלאק בטא עמילואיד במוח מושפע לספירה לא מבוקרת.

בנוסף, הוכח כי תאי גליה במוח דרוזופילה בגילאי לאבד את יכולת phagocytic בשל ירידה תרגום של דרייפר, homolog של Megf10 האסטרוציטים להשתמש עבור phagocytosing הסינפסות. שחזור דרייפר רמות הציל את יכולת phagocytic של תאי גליה, אשר מסומנת ביעילות פסולת עצב פגומים במוח בגילאי במידה דומה עד כדי כך במוח הצעיר, המציין כי הזדקנות-induced שינויים בקיבולת phagocytic האסטרוציטים עשוי לתרום להפרעה של המוח הומאוסטזיס15.

בהתבסס על הממצאים החדשים, להתכוונן מקיבולת האסטרוציטים phagocytic עשוי להיות אסטרטגיית טיפולית אטרקטיבי כדי למנוע ולטפל בהפרעות נוירולוגיות שונות. בהקשר זה, היו מספר ניסיונות לשפר את יכולת phagocytic של האסטרוציטים, לדוגמה, על-ידי גרימת לחומצי lysosomes עם חלקיקים חומצי16 , overexpressing גורם שעתוק EB (TFEB), אשר ניתן לשפר ליזוזום להן17. למרות נסיונות אלו, זה עדיין לא ברור איך האסטרוציטים ותאים microglial נבדלים קינטיקה phagocytic שלהם, אם אנחנו צריכים להגדיל או להקטין את קיבולות phagocytic שלהם למחלות שונות.

בנייר זה, אנו מציגים וזמינותו של הרומן במבחנה לגילוי מקיבולת האסטרוציטים phagocytic בזמן אמת. הנתונים מראים שונים קינטיקה של היבלעות והשפלה האסטרוציטים ו מיקרוגלייה. בינוני אסטרוציט ממוזגים (ACM), אשר מכיל גורמים המופרש מן האסטרוציטים, חיוני phagocytosis יעיל של האסטרוציטים והן מיקרוגלייה. יתר על כן, Megf10, קולטן phagocytic האסטרוציטים, על homolog של סיד-1 , דרייפר, ממלא תפקידים חיוניים phagocytosis בתיווך אסטרוציט8,18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי קוריאה מתקדמים במכון למדע, טכנולוגיה חיה טיפול מוסדי, שימוש הוועדה (IACUC), KA2016-08.

1. synaptosome טיהור

הערה: הליכים אלה מותאמים מן הנייר שפורסמו בעבר19 עם מספר שינויים על מנת לשפר את התשואה של מטוהרים synaptosomes (איור 1).

  1. להכין מדיה הדרגתיות צפיפות מקוטע.
    1. מניחים את הדברים הבאים על הקרח: 3%, 10% ו-23% צפיפות פתרונות הדרגתיות במאגר מעבר צבע (להביא 250 מ של מים עם 109.54 גר' סוכרוז, 606 מ ג של טריס 5 מ של 0.2 מ' EDTA, pH 7.4); מאגר homogenizing (להוסיף 25 מ של 4 x מאגר הדרגתיות, µL 500 של 50 מ מ DTT לתוך 74.5 מיליליטר מים); מהמגן ומכתש.
      הערה: פתרון הדרגתי צפיפות והכנות מוצגים בטבלה 1. כדי להכין 3%, 10% ו-23% צפיפות פתרונות מעבר צבע, להשתמש בפתרון ההדרגתי צפיפות raw.
    2. להכין 6 צינורות צנטריפוגה סופר ברורים לכל שלושה עכברים בוגרים.
    3. להוסיף 3 מ"ל של פתרון הדרגתי של צפיפות 23% על החלק התחתון של כל שפופרת צנטריפוגה עם פיפטה 1-mL. ואז, לאט לעשות שכבה עם 3 מ"ל של 10% צפיפות פתרון מעבר צבע על הפתרון הדרגתיות 23% צפיפות עם מרעה פיפטה, 1-mL פיפטה. לבסוף, להוסיף 3 מ"ל של 3% צפיפות פתרון מעבר צבע על העליונה. בשלב זה, השתמש בזהירות כדי להימנע היכרות עם בועות.
    4. לכסות את הצינורות צנטריפוגה בניילון נצמד ולשמור על הצינורות על קרח.
  2. Precool, צנטריפוגה מהירה ו ultracentrifuge ל 4 ° C.
  3. לחטא ציוד כירורגי (הפעלה מספריים, מספריים האביב Castroviejo, מלקחיים מעוקלים) עם 70% אתנול. להכין גביע זכוכית קטנים עם 25 מ של מאגר homogenizing על הקרח ולשקול את הספל.
  4. לחלץ את השכל מ עכברים זכר שלושה מבוגרים (כ 12 שבועות).
    1. לנקוע את חוליות וחותכים את הצוואר עם ההפעלה מספריים. לקלף את העור של ראש גולגולת לאורך האמצע באמצעות מספריים הפעלה ומלקחיים מעוקל. לסלק את הריח נורות, המח במספריים האביב Castroviejo.
  5. להכניס את המוח הנותרים. הספל עם מלקחיים מעוקל ולשקול את השכל. יש לשטוף את המוח מספר פעמים עם מאגר homogenizing קר כקרח כדי להסיר דם על פני השטח של המוח.
    הערה: בעבר, 9 מ של מאגר homogenizing עד 1g של רקמות המוח הומלץ.
  6. להוסיף 4 מ של homogenizing מאגר של 1g של רקמות המוח כדי המליטה מהמגן. בזמן homogenizing את השכל, להוסיף homogenizing מאגר עד 8 מ ל.
  7. לחלק homogenate של שני צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה מ-. רוחצים המליטה עם 1 מ"ל של מאגר homogenizing טריים את להוסיף את הצינורות.
    שים לב: המשך הצעדים 1.3-1.7 מהר ככל האפשר. פחות מ 20 דקות מומלץ.
  8. Centrifuge את homogenates צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 1000 g x 10 דקות ב 4 ° C עם בלמים איטית יותר.
    הערה: הגדרת קצב ההאטה (בלם)-שתיים או שלוש כאשר הקצב המרבי של ההאטה תשע.
  9. בזהירות להוסיף את תגובת שיקוע שפופרת 50-mL החדש ולהוסיף עד 12 מ של מאגר homogenizing.
  10. לאט ובזהירות פיפטה 2 מ של תגובת שיקוע מדולל על הפתרון הדרגתיות צפיפות 3% עם פיפטה 1-mL ומניחים הצינורות על קרח.
  11. צנטריפוגה-31,000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C בלי בלמים.
    הערה: הגדרת הקצב ההאטה באחד (אפס) או חוף.
  12. במקום הצינורות על הקרח ולאסוף את השבר synaptosome בין פתרון הדרגתי של צפיפות 23% 10% צפיפות פתרון מעבר צבע עם פיפטה 2-mL לתוך צינור 50-mL. להוסיף סוכרוז קפואים/EDTA מאגר עד 80 מ ל, מחלקים אותו 4 שפופרות צנטריפוגה במהירות גבוהה מל.
    הערה: ראה איור 3 synaptosomes fractionated עם מעברי צבע עם תוויות.
  13. צנטריפוגה ב g x 20,000 למשך 30 דקות ב- 4 הלעפה תרוטרפמט עם הפסקות פחות.
    הערה: לקבוע את קצב ההאטה פעמיים או שלוש כאשר הקצב המרבי של ההאטה תשע.
  14. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה 1-mL, resuspend בגדר synaptosome עם 1 מ"ל של מול מאגר פיזיולוגיים (140 מ מ NaCl, 3 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.2 מ מ2, 1.2 מ מ NaH2PO4, 10 מ מ HEPES ו 10 מ מ גלוקוז, pH 7.4)20. להוסיף 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד 10% מול מאגר פיזיולוגיים (הריכוז הסופי של דימתיל סולפוקסיד: 5%) לאסוף את synaptosomes לתוך שפופרת 50-mL צנטריפוגה מהירה אחת.
  15. 1 מ"ל aliquot לתוך צינורות 1.5-mL. מודדים את ריכוז חלבון synaptosomes באמצעות וזמינותו ברדפורד.
  16. להקפיא את הצינורות ובמהירות לאחסן הצינורות במקפיא עמוק-80 ° C עד ה-pH מחוון ההטיה.

2. pH ההטיה מחוון

  1. צנטריפוגה 1.5-mL צינורות עם synaptosomes ב g x 21,092 למשך 3-4 דקות ב 4 º C.
  2. הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 200 µL של 0.1 M נה2CO3 ולערבב היטב על ידי pipetting.
    הערה:2CO נה3 נוספה כדי להעלות את רמת ה-pH כמו succinimidyl אסתר באופן היעיל ביותר מגיב עם ראשי אמינים ב- pH בסיסי מעט.
  3. להוסיף 2 µL של מחוון ה-pH צינור ובעדינות מערבולת.
    התראה: שימוש µL 1 של pH אינדיקטור לכל 0.3 מ ג של synaptosome פתרון.
  4. למזער חשיפה קלה על ידי כיסוי הצינורות ברדיד אלומיניום, תקופת דגירה אותם של 1-2 h בטמפרטורת החדר (RT) ב שייקר טוויסט עם עצבנות עדין-30-40 סל ד.
  5. לעצור את העצבנות ולהוסיף 1 מ"ל של DPBS.
  6. Centrifuge הצינורות ב g x 21,092 למשך 1-2 דקות.
  7. הסר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של DPBS כדי resuspend בגדר מאת pipetting עדין.
  8. חזור על שלבים 2.6-2.7 לפחות שבע פעמים כדי להסיר את מחוון ה-pH לא מאוגד.
  9. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר עם 200 µL של DPBS עם דימתיל סולפוקסיד 5%.
    הערה: בשלב זה, כל synaptosomes הם שאינם פונקציונליים. יש לנו אישר כי phosphatidylserine (PS) נחשף הממברנה החיצונית של synaptosomes, אשר מתפקד בתור "לאכול-לי" אות (איור 4).

3. האסטרוציטים וטיהור מיקרוגלייה

הערה: פרוטוקול זה לטיהור אסטרוציט היא ממאמרו של נייר שפורסמו בעבר21. ב פרוטוקול זה, מתואר הטיהור של עכברוש האסטרוציטים, מיקרוגלייה. ההליכים הספציפיים לטיהור האסטרוציטים העכבר ו מיקרוגלייה מתוארים גם בהערות.

  1. יום לפני טיהור
    1. להכין מנות התרבות תאים מצופים מראש פתרונות.
    2. הכינו צלחות פטרי 145 מ מ x 20 מ מ עם מ 25 ל 50 מ"מ טריס-HCl (pH 9.5). מקום הטיפול נוגדן ראשית או משנית הפטרי בנפרד כמתואר להלן. דגירה המנות במקפיא למשך הלילה.
      צלחת BSL-1: 20 µL של 5 מ"ג/מ"ל BSL-1 (Griffonia simplicifolia לקטין)
      צלחת משנית בלבד: µL 60 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
      CD45 צלחת: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
      O4 המנה: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgM (ממוצע-שרשרת ספציפי)
      Itgb5 צלחת (Integrin β5) עבור האסטרוציטים עכברוש: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
      הערה: כדי לחבר נוגדן משני פני הידרופובי הפטרי, מצורף איטית בטמפרטורות נמוכות מומלץ. עם זאת, זה אפשרי להרגיע את צלחת פטרי עם נוגדנים משניים עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. נוגדנים עבור אסטרוציט panning משמשים באופן שונה בהתאם למין החיה; לדוגמה, HepaCAM הבישול האסטרוציטים העכבר: 60 µL של 2.4 mg/mL עז אנטי עכבר IgG + IgM (H + L)
  2. יום של טיהור
    1. להתכונן immunopanning.
    2. הכן טורפדו 50-mL ולהוסיף מניות הצינורות. הכנה מפורטת פתרון מניות מוצגת בטבלה 1.
      1. הכן צינור 1 (אנזים): 22 מ ל אנזים מניות (אנזים מניות: 1 x של ארל מאוזנת תמיסת מלח (EBSS)+0.46% D (+)-גלוקוז + 26 מ מ NaHCO3 ו0.5 מ מ EDTA).
      2. הכן צינור 2 (נמוך Ovo): 42 מ של מניות מעכב (מעכב מניות: 1 x D EBSS+0.46% (+)-גלוקוז + 26 מ מ NaHCO3).
      3. הכן צינור 3 (גבוהה Ovo): 10 מ של מניות מעכב.
    3. לצרף 0.22-מיקרומטר סביבונים קצות פיפטות 2-mL מחובר טנק2 (95% O2 ו- 5% CO2) CO. בועה CO2 לתוך צינורות 1-3. תפסיק מבעבעים כשמתברר הפתרונות של תפוז.
    4. להשלים את הפתרונות.
      התראה: להשלים, דגירה הפתרון צינור 1 ב 34 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש להפעלת האנזים.
      1. הכן צינור 1 (אנזים): 22 מ ל אנזים מניות + 180 U פפאין + 0.004 g L-ציסטאין.
      2. הכן צינור 2 (נמוך Ovo): 42 מ של מעכב מניות + 3 מ"ל של Ovo נמוך + 200 µL של DNase.
      3. הכן צינור 3 (גבוהה Ovo): 10 מ של מעכב מניות + 2 מ של Ovo גבוהה + 20 µL של DNase.
      4. הכן צינור 4 (0.2% BSA): 19 מ של 1 X DPBS + 1 מ"ל של BSA 4% + 8 µL של DNase.
      5. הכן צינור 5 (0.02% BSA): 45 מ של 1 X DPBS + 5 מ של צינור 4 + 50 µL של DNase.
    5. מחממים מים טורקי, חום בלוק ב 34 מעלות צלזיוס.
  3. תמצית קליפת חולדה.
    1. לחטא ציוד כירורגי עם 70% אתנול והכן מ מ 100 צלחות פטרי עם DPBS.
    2. להכין קופסת אקרילי. לשים 2-3 שכבות של רקמות בחלק התחתון של תיבת ולהוסיף 1 מ"ל של איזופלוריין לתוך התיבה.
    3. עזים ומתנגד הגורים עבור 20-40 s בתיבה ואשר ההרדמה על ידי צביטה רגל עם מלקחיים. לחשוף את הלב22 , perfuse הגורים באמצעות מזרק 10-mL עם DPBS.
      הערה: זלוף משמש כדי למנוע זיהום תאי הדם במהלך השלב השתוותם מיקרוגלייה.
    4. חתך קו של הכלבלב צוואר הרחם העליון של הצוואר עם מספריים הפעלה, פצעים וחתכים בעור הראש לאורך הקו האמצעי. אעשה חתך על הגולגולת לאורך הקו האמצעי ופתח את הגולגולת עם מלקחיים מעוקל.
    5. בלו המוח הקטן עם מספריים האביב Castroviejo. להוציא את המוח הנותר ומניחים אותו בצלוחית 100-מ מ מלא DPBS.
    6. הסר בתחומים אחרים כגון ההיפוקמפוס של המוח האמצעי של קליפת במספריים האביב Castroviejo תחת המיקרוסקופ. הסר את קרומי המוח עם מלקחיים משובחים.
    7. להעביר את קליפת המוח לתוך תבשיל 60 מ מ חדש ולהסיר את DPBS שנותרו בצלחת. קוצצים את הרקמה עם להב מספר 10.
  4. מביצועם קליפת להשעיה תא בודד
    1. שופכים את הפתרון צינור 1 מסוננים לתוך תבשיל 60 מ מ ולהוסיף 50 µL של DNase1. מערבולת הפתרון בצלחת.
      הערה: DNase משמש כדי לעכב צבירה של ה-DNA של תאים קרע.
    2. למקם את המנה גוש חום 34 ° C, לכסות את זה עם מכסה שיש לו חור באמצע. להשתמש במלחם לעשות החור במכסה הפטרי 60 מ מ.
    3. להתחבר 22-מיקרומטר סביבונים צינור מיכל של2 CO ולמקם את הטיפ מסנן לתוך החור.
    4. דגירה המנה ב 34 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות מערבולת הפתרון בצלחת כל 10-15 דקות.
  5. סיום הכנת המנות פנורמית.
    1. הסר את הכלים השתוותם זה מצופה נוגדנים משניים מהמקפיא ביום מבעוד מועד. להשאיר את המנה BSL-1 ואת המנה נוגדן בלבד משני-RT.
    2. לרחוץ כלים אחרים שלוש פעמים עם 20 מ של DPBS.
    3. שופכים כמות מספקת של 0.02% BSA לתוך הכלים. מניחים נוגדנים ספציפיים הראשי הכלים המתאימים:
      תבשיל CD45: 12 מ ל BSA 0.02% + 20 µL של 0.5 מ"ג/מ"ל העכבר אנטי חולדה CD45
      תבשיל Itgb5: 12 מ ל BSA 0.02% + 20 µL של 0.5 מ"ג/מ"ל Itgb5
      O4 המנה: 8 מ של BSA 0.02%, 4 מ של נוגדן O4
      הערה: עבור immunopanning העכבר, להשתמש בעכבר אנטי חולדה CD45 (0.5 mg/mL) עבור מיקרוגלייה ו- HepaCAM (0.5 mg/mL) עבור האסטרוציטים.
    4. הכנת 30 מ של 30% FBS עם neurobasal מדיה ו- 10 מ"ל של 1 X EBSS. לחמם שני פתרונות באמבט מים 34 מעלות צלזיוס.
  6. לעכב את התגובה פפאין.
    1. העברת רקמות שטופלו פפאין צינור 50-mL. המתן הרקמות להתיישב. האחות נוזלית ביניקה.
    2. להוסיף 4 מ"ל של Ovo נמוכה פתרון הצינור ו מערבולת הפתרון לשטוף את התאים.
    3. חזור על צעדים 3.6.1-3.6.2 שלוש פעמים כדי לעצור את תגובת האנזים.
  7. Triturate הרקמות בקליפת המוח.
    1. להוסיף 6 מ של Ovo נמוך לאמבטיה. האחות ולשחרר את רקמות במהירות בעזרת פיפטה 5-mL.
      התראה: לא להציג את בועות.
    2. להכין שפופרת 50-mL החדש, הוסף 5 מ של Ovo נמוך. איסוף תאים בודדים צינור חדש.
    3. חזור על צעדים 3.6.1-3.6.2 פעמיים ולשנות את פיפטה 5-mL פיפטה 1-mL.
    4. חזור על trituration עד יותר מ 95% של הרקמות אינם גלויים.
    5. להכין שכבה של Ovo גבוהה פתרון מתאי צינור 3 עם פיפטה 10-mL מתחת המכילות Ovo נמוך חלופה מועדפת.
    6. צנטריפוגה ב g x 190 במשך 6 דקות עם מספר בלמים.
      הערה: הגדרת קצב ההאטה-אחד או שניים כאשר הקצב המרבי של ההאטה תשע.
  8. פילטרט של תאים בודדים.
    1. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע ביניקה, ולאחר מכן resuspend בגדר עם 3 מ"ל של 0.02% פתרון BSA עם פיפטה 1-mL.
    2. להוסיף 0.02% BSA פתרון עד 9 מ ל.
    3. להכין את שפופרת 50-mL החדש 20-מיקרומטר תא מסננת על גבי הצינור. הרטב את מסננת תא עם 1 מ"ל של 0.02% BSA פתרון.
    4. העברת התליה תא בודד לתוך מסננת התא. לסנן 1 מ"ל בכל פעם.
    5. לשטוף את מסננת תא עם 3 מ"ל של 0.02% BSA פתרון. לא עושים יותר מ 15 מ"ל של התליה תא בודד מסוננים.
    6. דגירה הצינורית בתוך אמבט המים 34 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות להתאוששות התא. הצעד שחזור התא מאפשר relocalization של חלבונים פני שטח התא למוח.
  9. לבצע גלילה רציפה של התאים.
    1. לשטוף את הצלחת השתוותם CD45 שלוש פעמים עם 20 מ של DPBS. לשטוף בכל מנה שלוש פעמים עם 20 מ של DPBS מיד לפני השימוש.
    2. שופכים את התליה תא בודד לתוך CD45 פאנינג מאכל. להשאיר את המנה עבור 28 דקות ומנערים את המנה עבור 14 דקות. כדי להסיר תאים לא מאוגד מלמטה, לנער בזהירות את המנה.
    3. העברת התליה תא למנה משנית בלבד. לחכות 20 דקות ומנערים היטב את המנה למשך 10 דקות. כדי להשיג מיקרוגלייה מתוך קערה CD45, עבור לשלב 3.9.2.
    4. העברת התליה תא לתוך המנה BSL-1. להשאיר את המנה למשך 10-12 דקות.
    5. העברת לתוך המנה O4. לחכות 20 דקות ומנערים למשך 10 דקות.
    6. להעביר המנה Itgb5. להשאיר את המנה למשך 40 דקות ומנערים בעדינות כל 10 דקות.
      הערה: עבור העכבר panning, להעביר התליה תא לתוך המנה HepaCAM.
  10. ניתוק התאים מתוך קערה.
    1. מיקס 400 µL של טריפסין (30,000 U/mL ב EBSS) עם preincubated 8 מ ל 1 X EBSS.
    2. שופכים התליה תא משפחתי בצלחת לתוך דלי פסולת.
    3. לשטוף את הצלחת שמונה פעמים עם DPBS.
    4. שופכים 8 מ של EBSS עם טריפסין לתוך קערה.
    5. דגירה המנה למשך 5-10 דקות בחממה 37 º C. תקופת דגירה של 10 דקות עבור המנה CD45 ו- 5 דקות על המנות Itgb5 ו- HepaCAM.
    6. הקש על המנה ולבחון את המנה תחת מיקרוסקופ.
      הערה: אם יש רוב האסטרוציטים אינו מנותק, תחזיר את המנה לתוך החממה למשך עוד 5 דקות.
    7. למזוג 10 מ"ל של 30% FBS לתוך המנה לנטרל טריפסין.
    8. פיפטה למעלה ולמטה לתוך המנה כולה כדי לנתק האסטרוציטים או מיקרוגלייה.
    9. העברת הפתרון לתוך צינור 50-mL.
    10. להוסיף 10 מ של 30% FBS ו 200 µL של DNase לתוך קערה. ניתוק התאים שוב. DNase משמש כדי לעכב צבירה של ה-DNA של תאים קרע.
    11. העברת הפתרון לתוך הצינור. אם התאים נשארים בצלחת, להוסיף עוד 10 מ"ל של 30% FBS ולנתק את התאים שוב.
  11. צלחת את התאים.
    1. Centrifuge את הצינור ב g x 213 למשך 10 דקות.
    2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא עם מדיה.
      הערה: השתמש immunopanned אסטרוציט בסיסי מדיה (IP-ABM) עבור האסטרוציטים ומדיה מיקרוגלייה ברשתית בסיסי (MBM) עם immunopanned ממוזגים אסטרוציט מדיה (IP-ACM) עבור מיקרוגלייה. IP-ABM ויצירות MBM מוצגים בטבלה של חומרים.
    3. לספור את התאים עם hemocytometer.
    4. צלחת את האסטרוציטים ואת מיקרוגלייה בנפרד בתוך צלחות מצופה PDL.
      הערה: להכין את הצלחת מצופים PDL לפני השימוש. כדי להכין צלחות מצופה PDL, להוסיף 50 µL של 1 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין 5 מ ל מים מזוקקים, שופכים כמות מספקת של פתרון לתוך קערה/הצלחת היטב, לחכות 30 דקות לשטוף את הצלחת/צלחת שלוש פעמים עם מים מזוקקים.
    5. דגירה לצלחת. לשנות את מחצית התקשורת כל 7 ימים עבור האסטרוציטים ו- 3 ימים עבור מיקרוגלייה.

4. לאסוף את ה-IP-ACM

  1. להכין תבשיל 100-מ מ כאשר האסטרוציטים confluent יתר על המידה.
  2. למחוק את התקשורת, כדי לבשל שלוש פעמים עם 10 מ"ל של DPBS.
  3. שופכים 15 מ"ל של חלבון נמוכה מדיה לתוך קערה.
    הערה: ההרכב מדיה חלבון נמוכה מוצגת טבלה של חומרים.
  4. תקופת דגירה המנה של 7 עד 10 ימים בחממה 37 º C.
  5. לאסוף ולרכז את התקשורת עם 10k (או 30k) צנטריפוגלי מסנן צינורות.
  6. Centrifuge הצינורות ב g x 851-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: Centrifuge הצינורות עד התקשורת שנותרו פחות מ 1 מ"ל.
  7. איסוף מרוכז מדיה (IP-ACM) לתוך צינור 1.5-mL החדש.
  8. למדוד את הריכוז של ה-IP-ACM באמצעות ניתוח כמותי

5. phagocytosis הדמיה לחיות Assay (איור 2)

  1. להכין צלחת 24-טוב (או כל צלחת/מנה כי הוא מוכן לחיות-הדמיה) ב האסטרוציטים אילו הם confluent (בדרך כלל, 7 עד 10 ימים של דגירה לאחר הטיהור הוא אידיאלי לייצוב תאי).
  2. מסיר את המדיה כל היטב ולשטוף הבארות עם 1 מ"ל של DPBS, שלוש פעמים. כדי למזער חשיפה אוויר, לשטוף הבארות במהירות.
  3. הוסף µL 300 של IP-ABM עם 5 µL של synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH וגורמים נוספים כגון ה-IP-ACM זה יכול לווסת תא גליה phagocytosis.
  4. דגירה על צלחת חממה2 CO למשך 40 דקות. שלב זה מאפשר ה-pH synaptosomes מצומדת מחוון להתיישב לתחתית של הלוחות.
  5. להסיר את התקשורת עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH לא מאוגד ולשטוף כל טוב עם 1 מ"ל של DPBS, שלוש פעמים.
    התראה: הדבר בחומרה. כדי למזער חשיפה אוויר, לשטוף הבארות במהירות.
  6. להוסיף 500 µL של IP-ABM עם גורמים נוספים כדי לבדוק לתוך הבארות.
  7. לקחת את הצלחת מכשיר הדמיה לחיות ולבחור עמדות. כוונן פוקוס, זמן החשיפה, בהירות וכוח LED.
    הערה: ההגדרות עבור זמן החשיפה, בהירות וכוח LED הם משתנה בהתאם עוצמת קרינה פלואורסצנטית מטרת הניסוי. ב וזמינותו הדמיה לחיות עם synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH, אנחנו בדרך כלל להגדיר ערכים אלה כדלקמן: חשיפה: ~ 150-200 ms, בהירות: 15 והובילה חשמל: 4-6.
  8. להגדיר פורמט התמונה מרווח הזמן, המספר הכולל של מחזורי עבור הדמיה לחיות. להגדיר את מרווח הזמן ל- 1 או 2 h תלוי כמה תפקידים שנבחרו. 2 ביממה במרווחים מומלצים כאשר יותר מ-150 משרות שנבחרו עבור הדמיה לחיות.
  9. התחל את הניסויים הדמיה לחיות.
  10. לנתח את הנתונים.
    1. פתח את התוכנית פיג'י.
    2. ייבוא רצף תמונות. להמיר תמונות בגווני אפור של 8 סיביות.
    3. לבצע רקע חיסור עם מסתובב בר ברדיוס של 50 פיקסלים.
    4. להתחיל זמן סדרה מנתח V3 תוספים.
      הערה: הכתובת עבור הזמן סדרה מנתח V3 תוספים מוצגת טבלה של חומרים.
    5. גרור האזור של עניין (ROI) התמונה ולחץ על הוסף במנהל ROI.
    6. לחץ על "Get עוצמה הכולל" בסדרת הזמן V3_0.
    7. לשמור את התוצאות ולשלב את הנתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ב זה במבחנה phagocytosis assay עם הדמיה לחיות לטווח ארוך, השתמשנו synaptosomes מן homogenates מוח העכבר למבוגרים, אשר הופרדו בפתרון ההדרגתי בין פתרון הדרגתי 23% ו- 10% הפתרון מעבר צבע באמצעות ultracentrifugation ( איור 3). לאחר ההכנה, synaptosomes חשופות PS בקרום החיצוני שלהם (איור 4), רומז כי הם איבדו את תפקידם, יכול להיות מוכר על ידי קולטנים PS האסטרוציטים ו מיקרוגלייה. כמוצג באיור5, synap...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, נציג שיטות לטווח ארוך הדמיה לחיות במבחנה phagocytosis assay באמצעות גלייה מטוהרים synaptosomes מצומדת מחוון ה-pH. אנחנו מראים כי בהשוואה מיקרוגלייה, האסטרוציטים בעלי קיבולת היבלעות והשפלה שונים במהלך phagocytosis של synaptosomes. בנוסף, הנתונים שלנו מראים כי מופרש אסטרוציט גורמים, אשר מכילים מולקולות גישור כגון GAS6, חלבונים ו- MEGE8, הם חיוניים עבור יעיל phagocytosis תלויי-PS של תאי גליה במוח. יתר על כן, Megf10 KO האסטרוציטים להראות phagocytosis פגומה של synaptosomes.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים יונג יון-ג'ו לתמיכה ניסיוני שלה במהלך טיהור synaptosome ופארק Jungjoo על תמונות של synaptosomes עם חשיפה PS. בנוסף, אנו מודים לכל החברים במעבדה של צ'ונג לדיון מועיל. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2016M3C7A1905391 ו- NRF-2016R1C1B3006969) (וו-S. ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>טיהור סינפטוזום
PercollGE בריאות מדעי החיים17-0891-01
התחלה מהירה ערכת בדיקת חלבון ברדפורד 2BIO-RAD5000202
<חזק>צימוד מחוון pH
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)תמיסתLPS
pHrodo אדום, succinimidyl esterMolecula בדיקותP36600
<חזק>אימונופאנינג
10X ארל' s תמיסת מלח מאוזנת (EBSS)SigmaE7510
סרום בקר אלבומיןBovogenBSA025
Deoxyrebonuclease 1 (DNase)WorthingtonIs002007
DMEM)Gibco11960-044
(dPBS)WelgeneLB001-02
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco16000-044
Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)Vector LabsL-1100
עיזים נגד עכבר IgG+IgM(H+L)Jackson ImmunoResearch115-005-044
עיזים נגד עכבר IgM (μ-שרשרת)Jackson ImmunoResearch115-005-020
גורם גדילה אפידרמלי קושר הפריןסיגמהE4643
נוגדן HepaCAM אנושיR& מערכות DMAB4108
נוגדן חד שבטי אינטגרין בטא 5 (KN52)eBioscience14-0497-82
L-ציסטאיןסיגמאC7880
L-גלוטמטGibco25030-081
N-אצטלי-L-ציטאין (NAC)SigmaA8199
מדיה נוירובזליתGibco21103-049
O4 hybridoma supernatant(mouse IgM)Bansal et al.23
PapainWorthingtonIS003126
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140-122
Pluristrainer 20 μ mPluriSelect43-50020-03
פולי-D-ליזיןסיגמאP6407
פרוגסטרוןסיגמאP8783
פוטרסין דיהידרוכלורידסיגמאP5780
עכברוש מטוהר נגד עכבר CD45BD Pharmingen550539
עכבר מטוהר נגד חולדות CD45BD Pharmingen554875
נתרן פירובטGibco11360-070
נתרן סלניטסיגמאS5261
טרנספריןסיגמאT1147
טריפסיןסיגמאT9935
מעכב טריפסיןוורת'ינגטוןLS003086
צינור אולטרה קליר (צינור, דופן דקה, שקוף במיוחד)בקמן קולטר344059
Collect IP-ACM
Macrosep Advance מכשירים צנטריפוגליים עם ממברנת אומגה (10k)PALLMAP010C37
Macrosep Advance מכשירים צנטריפוגליים עם ממברנת אומגה (30k)PALLMAP030C37
<חזק>פגוציטוזיס בדיקת הדמיה חיה
ג'וליNanoEntek
Time Series Analyzer V3 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html
DMSO100( תוספי

מקורות

  1. Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
  2. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  3. Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
  4. Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
  5. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  6. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  7. Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
  8. Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
  9. Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
  10. Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
  11. Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer's disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
  12. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  13. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  14. Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
  15. Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871(2016).
  16. Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
  17. Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
  18. Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355(2017).
  19. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
  20. Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
  21. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  23. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פגוציטוזה של אסטרוציטיםסינפטוזומים עם אינדיקטור pHבליעה על ידי תאי גליההשוואה למיקרוגליההכנת סינפטוזומיםדימוי רב-מסגרות (Time-lapse)כימות פלואורסצנציהנוק-אאוט של MEGF10סריקה להפרעות נוירולוגיות
PH הרומן חוץ גופית ב- Live-הדמיה בתיווך וזמינותו של אסטרוציט Phagocytosis-שימוש Synaptosomes מצומדת-מחוון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.