אוסף של שלאחר ההזדווגות זרע באיברי הרבייה הנקביים, מדידה של זרע ניזול בעכברים

סיכום

ניזול זרע נדרש הזרע להשתחרר הג'ל הזרע. מחקר זה מספק את נהלי איסוף זרע מן באיברי הרבייה הנקביים שלאחר ההזדווגות, ומדידת זמן ניזול זרע.

תקציר

בעכברים, פלטה הזרע החודר לתוך הרחם. לאחר השפיכה, הזרע משתנה עקביות דמוי ג'ל כדי דומעות, תהליך הנקרא ניזול. במחקר זה, נראה כיצד לאסוף את הזרע פוסט-ejaculated באיברי הרבייה הנקביים במודל של עכברים. עכברים הנשי הראשון, מבוגרים על הבמה ייחום שוכנו לכלוב של הזכר בן לילה. למחרת בבוקר, הזדווגות אושר על ידי הנוכחות של הכנס copulatory בפתח הנרתיק. עכברים נקבה עם תקעים copulatory היו מורדמים, נאסף כל באיברי הרבייה בכללותה (הנרתיק, הרחם, oviducts, השחלות), המבטיח מערכת סגורה כדי להכיל את הזרע. מערכת הרבייה הונח צינור microcentrifuge 1.5 mL, הנרתיק חתכו אותה כדי לשחרר את הזרע לתוך הצינור. כדי להבטיח נפח הזרע המרבי עבור ניתוח, מלקחיים חסר שיניים שימשו כדי לסחוט את הקרניים הרחם השחלות מקצה לקצה הנרתיק גירוש הזרע שנותרו. מערכת הרבייה לגמרי ואז אבדו. הצינור המכיל זרע היה טוו בקצרה למטה. פיפטה נימי 25 μL הונח לתוך הצינור בזווית של 180 מעלות (במקביל לקיר tube). כמות הזמן נהגו למלא את צינור קפילרי לקו μL 25 הוקלט. זרע מן המגדל זכר מוכחת בדרך כלל לוקח כ 60-180 s כדי למלא צינור קפילר 25 μL. טכניקה זו של אוסף זרע יכול לשמש גם ביישומים אחרים במורד הזרם כגון הדמיה וניתוח תנועתיות הזרע.

מבוא

מערכת הרבייה הנשית מורכבת ספינלי העליון והתחתון. מערכת הרבייה העליון כולל החצוצרות, הרחם endocervix. מערכת הרבייה נמוכה יותר כולל את ectocervix הנרתיק. בבני אדם, הזרע ejaculated הופקד אצל הקיר הקדמי של הנרתיק, הסמוך ectocervix¹. בעכברים, עם זאת, הזרע הוא נסחף לתוך הרחם תוך דקות לאחר ההזדווגות².

הזרע מכיל ג'ל הזרע הוא פני השטח למוצק בתוך שניות של שפיכה, גורם את הזרע כדי להיות לכודים,³. מרותק למיטה. ניזול משחרר את הזרע קיבוע על-ידי שינוי זרע מדמוי ג'ל מימית עקביות. תהליך זה הוא חיוני תנועתיות הזרע ורביה יונקים. הידע של זרע ניזול מבוססת בעיקר על במבחנה מחקרים שבו זרע הופך מעובה בקערה תרבות. בבני אדם, הפעילות האנזימטית מתרחשת של הערמונית אנטיגן ספציפי או ה-PSA (הידוע גם kallikrein הקשורות peptidase 3 או KLK3) הוא התורם העיקרי עבור ניזול באמצעות הידרוליזה של semenogelins (יוצרי ג'ל חלבונים המצויים הזרע)^{4 ,5,6}. השפלה של semenogelins משחררת את הזרע של coagulum הזרע, הגדלת ניידות זרע. פריד זרע לשחות לעבר החצוצרה כדי להפרות את הביצית. ניזול (או זרע צמיגות) בדיקות הם אחד הקרנתם הראשונית סטנדרטי עבור בדיקת זרע במרפאות פוריות כדי להעריך את פוריות הגבר⁷.

מאמר שפורסם לאחרונה מראה כי ניתוח של נוזל הזרע שנאסף את העכבר הנשי באיברי הרבייה שלאחר ההזדווגות יכולה לשמש להמחשת חוסר ניזול שיכולים לגרום לאחר מכן ליקויי פוריות⁸. ניזול פגומים כגון לרטרו זרע תורם 11.8-32.3% מהמקרים עקרה גברים⁹, רומז ניזול נורמלי הוא הכרחי עבור רבייה יונקים. עם זאת, מחקרים וטיפול של פגמים ניזול התמקדו אך ורק זכר⁷. האפשרות כי באיברי הרבייה הנקביים ממלאת תפקיד הזרע ניזול לא נחקרו. לכן, שיטות איסוף זרע ומדידת זמן ניזול יספק לחוקרים כלי אבחון הרומן כדי לקבוע אם ניזול יכול להיות אחד הגורמים לאי פוריות באורגניזם מודל עניין.

פרוטוקול

כל בעלי החיים, הליכים המשמשים במחקר זה מטופל בהתאם להנחיות אכפת לי חיה אוניברסיטת מדינת וושינגטון (WSU) והוועדה שימוש ובציות שאושרו על-ידי WSU בעלי חיים פרוטוקולים #4702, #4735.

1. עכברים

1. שימוש רגיל C57BL/6J למבוגרים זכר עכברים או זנים אחרים של ריבית. לשמור על חיות תחת סביבת טמפרטורה, לחות-מבוקרת, עם ad libitum גישה של מים ומזון.
   1. השתמש מגדלים זכר ועד בן 8 שבועות בן 10 חודשים. השתמש רק מוכח מגדלים בניסויים.
2. השתמש למבוגרים נקבה עכברים עם רקמת מחיקה סלקטיבית של באיברי הרבייה α של קולטן אסטרוגן (מקודד על ידי ג'ין Esr1 ) לתאי האפיתל¹⁰ (Wnt7a^{Cre / +}; Esr1^f/f, הנקרא "קו" או נוק) ולשלוט הארנבונים מאותה (Esr1^f/f, שנקרא "CTRL") במחקר זה.
   1. השתמש נקבות בת שבוע 8. הגילאים של נקבות מגוונות בהתאם הניסוי של ריבית.
3. לקבוע את שלבי ייחום בבוקר בשעה 08:00 h. השתמש רק נקבות בשלב ייחום של המחזור. עבור שיטות מפורט של מריחת הנרתיק וניתוח cytological, להפנות הנהלים שפורסמו בעבר¹¹.

2. ההזדווגות והערכה תקעים Copulatory

1. ביום של ייחום (h 16:00), בית הנקבה לכלוב של הזכר.
2. למחרת בבוקר (08:00 h), להפריד את הנקבה מהעכבר זכר.
3. להשתמש עיבוד של שיטת שפורסמו בעבר¹² כדי לגשת נוכחות או היעדרות של פקק הנרתיק או copulatory כאינדיקציה של ההזדווגות.
4. החזק את העכבר הנשי מבסיס של הזנב להרים בקצרה את הגפיים האחוריות.
5. למצוא את התקע copulatory על ידי הנוכחות של coagulum הזרע תפר חוט רקמה אופווייט בפתח הנרתיק בעזרת קיסם. אם התקע copulatory, הקיסם לא תהיה אפשרות להכנסה לתוך תעלת הנרתיק.

3. הכנה לפני איסוף הרקמה

1. להכין 10 מ"ל של התקשורת L-15 של ליבוביץ, בתוספת 1% סרום שור עוברית (נקרא L15 מדיה + 1% FBS) צינור 15 מ"ל. דגירה התקשורת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות waterbath.
2. על מנת לשמר את הכדאיות של רקמות, זרע ליישומים במורד הזרם, aliquot 2 מ"ל של טרום ומחוממת L15 מדיה + 1% FBS ב microcentrifuge 2 מ"ל צינור לאיסוף רקמות.
3. לחמם את השלב של stereomicroscope ל- 37 מעלות צלזיוס. מוגדר הבלוק החום 37 ° C ומניחים על צינור microcentrifuge mL 1.5 ריק בבלוק.
4. אם היישומים במורד הזרם מחייבים הדמיה של תנועתיות הזרע, לחמם שהשקופית זכוכית 37 מעלות צלזיוס.

4. רקמות אוסף

1. להביא אזור הרקמה אוסף המדיה L15 מראש ומחוממת + 1% FBS aliquot.
2. המתת חסד הנקבה (~ 08: 30h) באמצעות פחמן דו-חמצני חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם.
   הערה: זה כ 8 שעות לאחר ההזדווגות, בהנחה ההזדווגות מתקיים בחצות.
3. מקם את החיה במצב פרקדן לחשוף את אזור הבטן.
4. תרסיס אלכוהול 70% על הבטן ליד הגפיים האחוריות.
5. להשתמש את המספריים ויבתר לעשות חתך קטן (~ 1 ס מ) על העור של הבטן התחתונה.
6. להשתמש ביד הדומיננטית למשוך את הזנב (ואת הגפיים האחוריות במידת הצורך) בעוד היד האחרת מושך את העור בכיוון ההפוך (לכיוון הראש) כדי לחשוף את שריר הבטן. שיטה זו משמשת כדי למזער את כמות השיער זיהום אל האברים מהבטן.
7. חותכים את שריר הבטן בצורת V-בבסיס הבטן, סמוך הנרתיק, כדי לחשוף את האיברים מהבטן.
8. העבר והמעיים שומן בבטן בצד כדי לחשוף את מערכת הרבייה.
9. חתוך את שלפוחית השתן ואת רקמות אחרות מעל אזור הנרתיק.
10. שיחתכו הערווה symphysis כדי לקבל גישה רקמת הנרתיק.
11. הרם את רקמת הנרתיק בפתח הנרתיק, באמצעות מספריים כדי להפריד בין תעלת הנרתיק לבין הרקמה רקטלי.
12. בזהירות לקצץ את השומן מצע המעי העליון משני צדי הרחם באמצעות מספריים האביב.
    התראה: הרחם שביר מאוד עם הזרע בתוך. להיזהר לא ניקוב הרחם, אחרת הזרע יאבדו.
13. הרם את מערכת הרבייה נמוכה וחותכים כרית השומן השחלות את שני הצדדים.
14. להעביר את באיברי הרבייה כל לתוך הצינור של ליבוביץ ומחוממת מראש L-15 מדיה + 1% FBS.

5. מדידה של זרע ניזול (צמיגות) מאוסף תוכן הרחם

1. על הבמה stereomicroscope מחוממת, העברת הרקמות לתוך תבשיל תרביות רקמה סטרילי 35 מ מ מלא 3.5 מ ל להתחמם מראש L-15 מדיה + 1% FBS לנקות רקמות דם, מזהמים אחרים.
   התראה: בעת הכביסה, לתפוס את הרקמות על ידי השומן, לא את הרחם. בשלב זה, הזרע הוא צפוי להיות שלמים בתוך הרחם.
2. כתם רקמות עודף מדיה באמצעות מעבדה מגבונים.
3. החזק את הרקמה בקצה הנרתיק בעת הצבת את הקצוות השחלות בצינור microcentrifuge מחומם מראש. בעוד אתה מחזיק שבסוף וגינלי, לחתוך את הקרניים הרחם בבסיס של הרחם, המאפשר את הקרניים הרחם ליפול לתוך הצינור microcentrifuge.
4. תן הזרע זרימה החוצה הקרניים הרחם לתוך הצינור. להשתמש מלקחיים חסר שיניים לסחוט בעדינות את הקרניים הרחם מהקצה השחלות כדי שבסוף וגינלי, לסלק את שאריות הזרע.
5. למחוק את הרקמות בתיק חומרים מסוכנים, לשרוף.
6. בקצרה ספין למטה הזרע minicentrifuge (~ 1-2 s).
7. להניח את הצינור, מקביל לשלב מחוממת - זרע לא ישפך החוצה.
8. יש לי את שעון העצר מוכן ולהגדיר לספור ''.
9. צינור קפילר 25 µL מכניס דגימת הזרע בזווית של 180 מעלות (מקבילה לקיר tube). זה כדי למזער את מידת ההשתנות בין כל חוקר כשאני מחזיק את צינור קפילרי בזוויות שונות.
10. הקש את הטיימר ברגע הופך צינור קפילרי מגע עם הזרע.
11. רשום את הזמן (s) שלוקח לזרע להגיע לקו 25 µL.
12. עם סיום המדידה, מיד לשים את הצינור המכיל זרע בחזרה בבלוק חום יבש לצורך ניתוח פונקציונאלי נוסף, כגון הדמיה וידאו של תנועתיות הזרע.
13. לחטא את צינור קפילרי המכיל זרע במועט הצינור ב- 10% מלבין פתרון עבור 20 דקות וזורקים את צינור קפילרי בתוך המיכל שרפ.

6. וידאו הדמיה של תנועתיות הזרע

1. הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת הדמיה וידאו.
2. פיפטה 20 µL של הזרע שנותרו על גבי השקופית זכוכית ומחוממת מראש, בעוד השקופית זכוכית מושם על הבמה מחוממת.
3. מכסים עם coverslip זכוכית.
4. הנח את הצד coverslip ' שקופית ' למטה על המיקרוסקופ.
5. השתמש 20 X עדשה המטרה כדי למצוא תחומי עניין.
6. לשנות ל- 100 X עדשה המטרה עבור הדמיה וידאו.
7. להקליט הוידאו ב- 12 מסגרות לשנייה (fps) ב-30 s.
8. באופן אקראי להקליט קטעי וידאו בתחומים שונים לפחות 3 לכל חיה.
9. ביצוע ההדמיה במהירות למזער חשיפה קלה השקופית כדי לשמר את תנועתיות הזרע ואת הכדאיות.
   הערה: הליך זה הדמיה צריך להיעשות תוך 2-3 דקות.
10. לבצע ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ImageJ כמו שתואר לעיל⁸.

תוצאות

זרע נאסף מן CTRL וקו h נקבות כ 8 לאחר ההזדווגות עם זכרים CTRL פורייה. ניזול (או זרע צמיגות) הוא לכמת על ידי לוקחים את הזמן כדי למלא 25 קפילר μL זרע. הזרע שנאסף CTRL uteri לקח 2.06 דקות ±0.12 (mean±S.E.M, n = 5) כדי למלא את צינור קפילרי (איור 1). עם זאת, הזרע שנאסף KO uteri לקח יותר מ 60 דקות (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) של זמן הניסוי. נתונים אלה מציעים הזרע באופן משמעותי מעובה יותר או פחות צמיגה ב- CTRL לעומת קו uteri.

כדי להמחיש את אחד היישומי...

דיון

איסוף זרע מן העכבר uteri יכול לספק יתרונות על פני הזרע ניתוח במבחנה כפי לשעבר יכול להמחיש את האינטראקציות פיזיולוגי בין הזרע לבין הפרשות באיברי הרבייה הנקביים. טכניקות שהוצגו במחקר זה מאפשר לחוקרים לקבוע את איכות תאי הזרע וכן הכדאיות הזרע, תנועתיות בתנאים פיזיולוגיים אידיאלי. יתר על כן, ישנם ניתוחים במורד הזרם שונים שניתן לבצע באמצעות הזרע שנאסף על uteri, לדוגמה, ניתן לספור את הזרע כדי לקבוע את המספר הממשי זרע הזנת את הרחם ואת הזרע יכול גם לדימות עבור מבחני תנועתיות. נקודת זמן אידיאלי כדי לאסוף את הזרע ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קיסם	יהלום	750-שטוח	סטרילי אוטומטי, השתמש בקיסם קהה. אל תשתמש במספריים לניתוח מחודד
	פישר	08-940
מספריים אביב	Roboz	RS-5600
מלקחיים עדינים	Roboz	RS-5045
25-μ צינור נימי זכוכית L	VWR	53432-761
לייבוביץ' s L-15 מדיה	Life Technologies	11415064	תוסף עם 1% FBS
סרום בקר עוברי (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל	Axygen	MCT-150-C
2 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה	Axygen	MCT-200-A
מחמם בלוק יבש דיגיטלי	VWR	13259-052	לחימום צינור המיקרוצנטריפוגה לפני איסוף זרע
מיניצנטריפוגה	קורנינג	LSE 6765
צלחת תרבית 35 מ"מ	VWR	10861-656
צינור צנטריפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל	VWR	10025-686
אמבט מים	דיוק	TSGP05
סטריאומיקרוסקופ שלב מחומם	Leica Microsystems	MZ10F	כדי לשמור על חום הרקמה לפני איסוף
זרע מיקרוסקופ ברייטפילד	Leica Microsystems	DMi8	אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע
מצלמה	Leica Microsystems	DMC2900	אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע
זכוכית שקופיות	פישר	12-552-3	אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע
Coverslip	VWR	48393-059	אופציונלי. להדמיית וידאו של תנועתיות הזרע
אקונומיקה			בריכוז dH2O עד 10%

יש לדלל