הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)

71.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56672

⸱

7 בינואר 2018

 , 
1Department of Laboratory Medicine, Medical University of Vienna

במאמר זה

סיכום

המאמר הנוכחי מתאר את הדור ואת מטבולית איפיון של עכברים-fed דיאטה עתירת שומן כמודל של עמידות לאינסולין הנוצרות על-ידי תזונה והשמנה. עוד כולל פרוטוקולים מפורט לביצוע הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה ואת הבדיקה עמידות אינסולין, מעקב אחר שינויים לכל הגוף של גלוקוז חילוף החומרים ויוו.

תקציר

השמנת יתר מייצג את גורם הסיכון יחיד הכי חשוב בפתוגנזה של סוכרת מסוג 2, מחלה המתאפיינת התנגדות ספיגת הגלוקוז האינסולין, על ההחרפה ברוטו של מטבוליזם הגלוקוז מערכתית. למרות התקדמות ניכרת בהבנת מטבוליזם הגלוקוז, המנגנון המולקולרי של רגולציה שלה על בריאות ומחלה נשארים תחת-חקר, ואילו רומן גישות כדי למנוע ולטפל סוכרת נחוצים בדחיפות. דיאטה גלוקוז נגזר מעוררת הפרשת אינסולין, אשר משמש הרגולטור הראשי של התהליכים האנאבוליים הסלולר במהלך המדינה האכילו ובכך מאזן את רמת הסוכר בדם הלבלב רמות כדי לשמור על מצב האנרגיה מערכתית. האכלת מפעילים מטא-דלקת כרונית, מה שמוביל שינויים בהיקפי אינסולין. הקשורים קולטן איתות, ובכך מפחיתה את הרגישות וחיסול בתיווך אינסולין הגלוקוז. אירועים אלה בסופו של דבר לגרום גלוקוז בצום גבוהות, רמות האינסולין, כמו גם הפחתה גלוקוזה, אשר בתורו לשמש האינדיקטורים החשובים של תנגודת לאינסולין. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להפוך את הדור מטבולית איפיון תזונה עתירת שומן (HFD)-נמאס עכברים כמודל בשימוש תכוף של דיאטה-induced תנגודת לאינסולין. אנו מדגימים בפירוט את המבחן סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT), אשר עוקב אחר לרשות היקפיים של הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבדיקה עמידות אינסולין (ITT) לעקוב אחר פעילות לכל הגוף לאינסולין. יחד, שיטות אלה ושימושיהם במורד הזרם מייצגים כלים רבי-עוצמה כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולי כללי של עכברים גם לגבי במיוחד להעריך שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. הם עשויים להיות שימושית במיוחד בתחום מחקרית רחבה של תנגודת לאינסולין, סוכרת והשמנה לספק הבנה טובה יותר של פתוגנזה גם כדי לבחון את ההשפעה של התערבויות טיפוליות.

מבוא

בעולם המפותח, השמנת יתר, סוכרת הגיעו ממדי מגפה עקב חוסר פעילות גופנית, צריכת עודף של מזון מעובד, תופעות אשר מונעים על ידי עיור מהיר, תיעוש, כמו גם הגלובליזציה. למרות מחקר על עמידות לאינסולין ועל זה morbidities משותף, כגון היפרליפידמיה, טרשת עורקים, צברה לגדולה במהלך העשורים האחרונים, המנגנונים הביולוגיים מורכבים אשר לווסת את חילוף החומרים על בריאות ומחלה נשארים שהיישום מובן עדיין קיים צורך דחוף הקדמה חדשה למנוע ולטפל במחלות אלה1.

אינסולין, גלוקגון הורמון counter-regulatory זה לשמש הרגולטורים העיקריים של האנרגיה התאית אספקת חומר מזין ואיזון, וכך גם שמירה על ריכוזי גלוקוז נאותה דם מערכתית2. גלוקוז עצמה פועלת כאחת תכשירים הראשי הפרשת האינסולין על ידי תאי β בלבלב, בעוד אחרים macronutrients, גורמים ההורמונאלית וכן לקלט העצבי עוד יותר לשנות תגובה זו. אינסולין וכתוצאה מכך מפעיל את התהליכים האנאבוליים של המדינה מוזן על ידי הקלת פעפוע של עודפי הסוכר לתוך שריר, תאי שומן נוסף מפעיל גליקוליזה וכן חלבון או חומצות סינתזה, בהתאמה. בנוסף, אינסולין הסתרת פלט גלוקוז בכבד על ידי עיכוב גלוקונאוגנזה. צריכת אנרגיה עודף כרוני ודלקת meta להוביל hyperinsulinemia ו היקפית לאינסולין בשל למטה-ויסות לביטוי קולטן לאינסולין, כמו גם שינויים איתות המסלולים במורד הזרם, ובעקבותיה לקוי רגישות גלוקוז בתיווך האינסולין לרשותו וכן עיכוב לא מספיקות של גלוקוז בכבד ייצור3,4,5,6.

מגוון רחב של מודלים עם אינדוקציה גנטי, תזונתי או ניסיוני של מחלת הוכחו להיות כלי מצוין כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תנגודת לאינסולין ואת צורות שונות של סוכרת, כמו גם מחלות הנלוות שלה7 . דוגמה הוא הדגם בשימוש נרחב וותיקה HFD-induced העכבר, אשר מאופיין על ידי עלייה מהירה במשקל עקב תזונה מוגברת בשילוב עם מופחתת יעילות מטבולית, וכתוצאה מכך אינסולין התנגדות8, 9. הן בבעלי חיים ובבני אדם, ובחרמון צום גלוקוז, אינסולין ברמות בדם, כמו גם סובלנות לקוי גלוקוז למינהל הם אינדיקטורים בשימוש תכוף של תנגודת לאינסולין והשינויים מערכתית אחרים של גלוקוז חילוף החומרים. ניטור גלוקוז, אינסולין רמות בדם המדינה הבזליים או לאחר גירוי ולכן הם המפרט נגיש בקלות.

בפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של עכברים HFD-fed, כמו גם שתי שיטות נפוצות, הבדיקה סובלנות גלוקוז דרך הפה (OGTT) ואת הבדיקה עמידות לאינסולין (ITT), אשר שימושיים כדי לאפיין את פנוטיפ מטבולית וכדי לחקור שינויים בחילוף החומרים של גלוקוז. אנו מתארים את OGTT בפירוט, הבודק לרשות הפרשת עומס, אינסולין גלוקוז אוראלית לאורך זמן. יתר על כן, אנו מספקים ההוראות כיצד לנהל את ITT לחקור לכל הגוף לאינסולין-פעולה על-ידי ניטור ריכוז הגלוקוז בדם בתגובה סיילין של אינסולין. הפרוטוקולים המתוארות במאמר זה ומבוססת, נעשה שימוש במספר מחקרים10,11,12. בנוסף שינויים קלים אשר עשוי לסייע להגביר הצלחה, אנו מספקים הנחיות תכנון ניסויים, ניתוח נתונים, כמו גם עצות שימושיות להימנע ממלכודות הפוטנציאל. הפרוטוקולים המפורטים להלן יכולים להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעה של גורמים סביבתיים גנטי תרופתי, תזונתיים, אחרים על חילוף החומרים של הגלוקוז בגוף כל ועל הפרעות המשויכת שלו כמו תנגודת לאינסולין. בנוסף גירוי עם גלוקוז או אינסולין, מגוון רחב של תרכובות אחרות עשוי לשמש לגירוי בהתאם למטרת מחקר אישיים. למרות מחוץ הטווח של כתב יד זה, יישומים רבים אחרים במורד הזרם ניתן לבצע את דגימות הדם נמשך, כגון הניתוח של דם ערכים שאינם גלוקוז, אינסולין (למשל, שומנים בדם, כולסטרול # ליפופרוטאינים פרופילי) כמו גם נתונים היסטוריים ניתוח של סמנים מטבוליים (למשל, על ידי בזמן אמת כמותיים פולימראז תגובת שרשרת (PCR), ניתוח תספיג Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (אליסה)). בהמשך flow cytometry, קרינה פלואורסצנטית מופעל התא מיון (FACS) ניתן להחיל לחקור את ההשפעות אוכלוסיות נפרדות תא בודד, בעוד transcriptomic פרוטיאומיה מבנית, גישות metabolomic עשוי גם להיות מנוצל עבור ניתוח untargeted.

בסך הכל, אנו מספקים פרוטוקול פשוט כדי ליצור מודל HFD-induced העכבר, בעוד נוסף המתאר שתי גישות עוצמה ללמוד שינויים מטבוליים לכל הגוף, את OGTT, ITT, אשר יכול להיות כלים שימושיים ללימוד בפתוגנזה של המחלה, פיתוח טיפולים חדשים, בעיקר בתחום של חילוף החומרים-הקשורים למחלות כמו תנגודת לאינסולין & סוכרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן מאושר על ידי חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת וינה רפואי, שנערכו לפי הפדרציה של אירופה מעבדה חיה המדע שיוכי (FELASA). אנא שימו לב כי כל ההליכים המתוארים פרוטוקול זה רק לבצע לאחר אישור מוסדי וממשלתיים, כמו גם על ידי צוות כי הם בקיאים טכנית.

1. HFD-fed עכברים

הערה: לשמור על כל C57BL/6J עכברים על מחזור/כהה 12 שעות ביממה עם גישה חופשית מזון ומים.

  1. בגיל 6 שבועות, במקום עכברים במשך 8-12 שבועות על HFD (40-60% שומן קלוריות) כדי לגרום להשמנה, בזמן האכלה קבוצת הביקורת רזה דיאטה דלת שומן (LFD) (10% שומן קלוריות).
  2. לקבוע את משקל הגוף של העכברים על בסיס שבועי. עקומות משקל צריך להראות דפוסים דומים בשתי הקבוצות, עם מדרון גבוהה יותר בקבוצה הניזונה HFD.

2. OGTT

הערה: אם נקודות זמן דגימה דם נבחרו במהלך OGTT כל 15 דקות, הניסוי צריכה להתבצע עם מקסימום של 15 עכברים במקביל, על מנת לקבל לפחות 1 דקות טיפול-זמן לכל העכבר.

  1. ההכנות ביום שלפני OGTT
    1. להעביר את העכברים לתוך כלוב עם מצעים טרי ומהר אותם לילה לפני בדיקות (14 h), תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר את האוכל בשעה 6 בערב במשך זמן התחלה למחרת בבוקר בשעה 8 בבוקר).
      הערה: צום עכברים הוא הגישה רגיל, בין לילה אולם מהיר יותר קצר (5-6 h) הוא יותר פיזיולוגית עבור עכברים (לפרטים, ראה דיון ).
  2. ההכנות ביום של הניסוי (אך לפני הניסוי)
    1. הכינו 10 מ"ל של תמיסת גלוקוז 20% (להמיס D-(+)-גלוקוז במים מזוקקים).
      הערה: כל ריאגנטים המנוהלים החיות חייב להיות תרופתי כיתה וסטרילי.
    2. להכין צלחת 96-ובכן האוסף פלזמה, על ידי מילוי טוב אחד על כל נקודת זמן הדגימה ועכבר כל, עם 5 µL NaEDTA (0.5 M EDTA, pH 8.0 ב- 0.9% NaCl, אחסון ב- RT). במהלך הניסוי, לאחסן את הצלחת הזו על קרח.
      הערה: ראה איור 1 משלים עבור רשימה מפורטת.
  3. למדוד את משקל הגוף של עכברים כל ולסמן הזנבות שלהם עם סמן קבוע על מנת להפוך עכברים בקלות ניתן להבחנה (למשל, העכבר 1 = 1 מקף, מקפים העכבר 2 = 2, וכו ').
  4. גלוקוז מדידה ודגימה הדם (איור 2)
    1. בזהירות לחתוך 1-2 מ מ של קצה הזנב באמצעות מספריים חדות ("חלופה א' באיור2). תמיד לנגב את טיפת הדם כדי למנוע המוליזה או זיהום בנוזל רקמות לפני לקיחת דגימות דם חדש עבור קביעת גלוקוז הדם הראשונה. להוציא דגימת דם קטנים (µL ~ 3) לשקילת הבזליים רמת הסוכר בדם (= נקודת זמן 0) עם סוכר.
      התראה: לבדוק ולהתאים מספר תשלום לבדוק רצועות על סוכר.
      הערה: כמו שיטת דגימה דם אלטרנטיביים, ניק את וריד הזנב לרוחב של עכבר עם להב סכין חדה (Variant B" באיור2). תקחי את הזנב לרוחב מתבצעת בדרך כלל כשליש לאורכו של הזנב מקצה הזנב, נע לכיוון הבסיס של הזנב לדוגמאות מרובים. השימוש בקרם הרדמה מקומית מומלצת. לעצור את זרימת הדם על ידי הפעלת לחץ אצבע על הרקמות הרכות לפחות 30 s לפני החיה מוחזר לכלוב שלו.
    2. לאסוף דגימת דם (כ-30 µL) באמצעות צינור קפילרי טריים (שמור את הציר האופקי צינור קפילרי). רוקן את צינור קפילרי באמצעות פיפטה על ידי לשים את הטיפ פיפטה בחלק העליון של צינור קפילרי הסוף על בקפידה דוחפים את הדם שנאספו לבאר של צלחת 96-ובכן, תוך הימנעות בועות אוויר. חזור על הליך זה עבור כל העכברים - אחד בכל פעם.
      הערה: חלופה עבור איסוף דם דרך צינור קפילרי, להשתמש פיפטה התרגלו האחסון הנכון (למשל, 30 µL) לאיסוף דם, או לאסוף את טיפת דם לכיוון הזנב על הסרט פרפין, ו pipet זה לתוך הפתרון-EDTA. אך ורק למנוע המגע של וזלין עם רצועות בדיקת דם או סוכר, כמו זה עשוי להשפיע עוקבות מדדים גלוקוז, אינסולין.
      התראה: OGTT זה מלחיץ מאוד עבור עכברים: עכברים רזה יכול לאבד כ 15% ממשקל גופם במהלך מהיר לילה. בנוסף, לקיחת דמים בנקודות זמן שונות מוביל לאובדן משמעותי של דם. עבור דגימה דם קל יותר, זה אפשרי לעסות היטב את mouse-tail עם וזלין.
      הערה: המוסדיים הנחיות עשוי להגביל את כמות הדם שנאספו בתוך תקופת מוגדרת המותר. הדגימה ואמצעי timepoints צריך להיות מותאם לא תעלה על ערכים מרביים מותרים. משקל הגוף של העכברים יש להשתמש כדי לחשב את הסכום הכולל דם נסיגה מותרת.
  5. חישוב נפח תמיסת גלוקוז מבוסס על משקל הגוף (1 גרם גלוקוז/ק"ג משקל גוף; הזה יכול להיות מוגברת עד 3 g/kg) נדרש להיות מנוהל על ידי אוראלי gavage עבור כל עכבר. לדוגמה, עם משקל הגוף של 30 g העכבר צריך 150 µL של גלוקוז 20% פתרון לניהול 30 מ"ג של גלוקוז.
    הערה: כדי לבסס את המינון של גלוקוז על המשקל של העכבר זה הליך רגיל. אם גוף הרכב נתונים זמינים, המינון של גלוקוז עבור OGTT יש לחשב על בסיס לין מסת הגוף (לפרטים, ראה דיון ).
  6. ניהול גלוקוז
    1. להכין כל מה נדרש במהלך הניסוי כולו מראש (טיימר, גיליון הרשומה ניסוי, מזרקים צג, רצועות, נימים, גלוקוז, תמיסת גלוקוז, צלחת 96-ובכן, אזמל, מחשבון, איזון, בטוש, ספסל ניירות, פיפטה עם טיפ, כפפות).
    2. ליישום גלוקוז, לרסן את העכבר על-ידי בחוזקה אוחז אותו יתלה. חלות מספיק מוצקות העור סביב הצוואר כדי למנוע פיתול מגבילות העכבר וכדי כראוי הטה את ראשו לאחור. גם להבטיח כי העכבר יכול לנשום כמו שצריך.
      הערה: לאחר ניהול גלוקוז מופעל, ניהול זמן טוב חשוב מאוד.
    3. בזהירות לנהל את תמיסת גלוקוז (מבוסס על שלב 2.5) ישירות לתוך הקיבה באמצעות מחט האכלה. בזהירות לכוון את המחט האכלה דרך הפה לכיוון הוושט. לאפשר את העכבר כדי לבלוע את המחט: המחט לחלוטין שוקעת לתוך הוושט התחתון/הקיבה של העכבר. להזריק את תמיסת גלוקוז (איור 3 א).
      1. אם התנגדות כלשהי, או אם החיה נאבק באופן מיידי, לשלוף את המחט ולמקם אותו מחדש. להתחיל את הטיימר מיד לאחר gavage הראשונה ולפקח גלוקוז כל לעכברים אחרים במרווחים 1 דקות.
        הערה: זה עשוי להיות שימושי להחיל טיפת תמיסת גלוקוז ישירות מן המחט האכלה על הפה של העכבר, אשר יגרה מלקקת, בבליעה, ובכך להקל על החדרת המחט האכלה קל יותר. אל תחיל לחץ בעת החדרת המחט האכלה כמו זה עלול לפצוע את החיה.
  7. לאחר 15 דקות, למדוד את רמות הגלוקוז בדם עם סוכר, בנוסף לקחת דגימות דם (µL ~ 30) (כפי שמתואר פרט בשלב 2.4) של העכבר בכל באותו סדר כפי שהם היו מזריקים.
    הערה: ניהול זמן הוא מאוד חשוב; בצע כמו צמוד ככל האפשר באמצעות ממרווחי הזמן אותו באשר gavage. תן העכברים לנוע באופן חופשי ככל האפשר, מגבלת הרחקה למינימום במהלך כל התהליך כדי להפחית את הלחץ, אשר עשויים לשנות את התוצאות. חלב הזנב עם יד אחת ולאסוף את הדם עם האחר.
  8. חזור על שלב 2.7 בנקודות זמן נבחר בהתאם התוצאות הצפויות (למשל, ב 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180 דקות לאחר ניהול גלוקוז). אם נקודות זמן נבחר הן יותר מ 120 דקות, ודא כי העכברים יש גישה למי שתייה. ודא כי העכברים יש תמיד גישה למי שתייה. לאחר סיום הניסוי, להחזיר את העכברים לכלובים הביתה מצוידים עם מים ואוכל.
    התראה: OGTT זה מתיש מאוד עבור העכברים לכן לחכות לפחות שבוע אחד לפני ביצוע המבדק מטבולית הבאה, כגון ITT
  9. לאחר הניסוי, צנטריפוגה דגימות דם-2,500 x g, 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס. להעביר את תגובת שיקוע (פלזמה) לרוקן בארות של הצלחת ולאחסן אותו ב-20 ° C עד הניתוח.
    1. להקליט המוליזה של דגימות אם קיים (ראה סעיף 3).
  10. לקבוע רמות אינסולין פלזמה באמצעות אליסה זמינים מסחרית של קיט (ראה את הטבלה של חומרים) בעקבות הוראות היצרן של הערכה.
    הערה: בהתאם למצב צום וגם על חילוף החומרים של העכברים ובדוקים, קשיים במהלך assay זו עלולה להתרחש: רמות של אינסולין בצום לילה (נקודת זמן 0) קרובים מאוד נמוך, ולכן מגבלת זיהוי. כדי להימנע מבעיה זו, להכפיל את הכמות של נפח פלזמה מומלצת, בהתאם צונחים בחצי התוצאה של אליסה וזמינותו. מצד שני, אם עכברים להגיע לפסגה אינסולין במהלך OGTT, בעיקר בעכברים HFD-fed, רמות האינסולין עלול חורגת מהמגבלה של זיהוי: לדלל את הדגימה (למשל, 10-fold עם 0.9% NaCl) וחזור וזמינותו אליסה. המוליזה בדגימות הפלסמה עלול להוביל ההשפלה של אינסולין, וכתוצאה מכך ירידה של ערכי הבדיקה. ההשפלה תלוי זמן, טמפרטורה, ריכוז המוגלובין במדגם. תמיד לשמור דגימות hemolyzed קר או על קרח כדי להפחית אינסולין השפלה.

3. ITT

הערה: אמצעי הזהירות אותם תיאר עבור OGTT (טיפול של עכברים, דם, סוכר ושימוש וזלין) יש גם להחיל בעת ביצוע של ITT. לדוגמה, זריקות כל צריכה להתבצע בתוך 15 דקות במרווחים 1 דקות אם עכברים 15 נבדקים במקביל. עבור ITT, אוסף עוקבות של דגימות דם עם צינורות קפילר הוא אופציונלי.

  1. ההכנות לפני הניסוי
    1. מהר עכברים כבר לפחות שעתיים לפני הזרקת אינסולין, תוך הבטחת כי העכברים יש גישה למי שתייה (למשללהסיר מזון ב־8: 00, מבחן עכברים 2-5 שעות מאוחר יותר).
    2. לדלל אינסולין 1:1,000 ב- 0.9% NaCl (מניות: אינסולין U/mL 100; ריכוז בעבודה 0.1 U/mL) ולהכין 20% גלוקוז (D-(+)-תמיסת גלוקוז מומס מים מזוקקים) ינוהלו אם והעכברים הופכים מתת.
      הערה: ITT מבוצעת בדרך כלל לאחר מהיר קצר כדי למנוע היפוגליקמיה אשר ייתכן אחרת מתרחשים בין לילה התענה חיות. ריאגנטים כל המנוהלים החיות חייב להיות תרופתי כיתה וסטרילי.
  2. מודדים את משקל גוף של עכברים, לסמן את הזנב, חותכים קצה הזנב באמצעות מספריים חדות, למדוד את רמות הגלוקוז בדם הבזליים כמתואר קודם לכן OGTT בשלב 2.4.
  3. הזרקת אינסולין
    1. כדי להזריק אינסולין intraperitoneally (0.75 U אינסולין/ק"ג משקל גוף, מחושב מראש), לרסן את העכבר בשיטת עורפה.
    2. השתמש רעננה, סטרילי 27 או 30 מד מחט עבור כל חיה למנוע אי נוחות, את הסיכון של זיהום כלשהו-ההזרקה.
      הערה: עיקור של העור יכולים להאריך את משך הזמן של אינסולין המינהל, ובכך עלול לגרום הפרעות נוספות לחיה. לכן, לא מומלץ.
    3. להטות את הראש העכבר מטה בזווית קלה כדי לחשוף את הצד הבטני של החיה. הצב מחט סטרילית עם שפוע, בזווית של 30 מעלות הרביע הימני. התחתון של הבטן של החיה (איור 3b). התחל את הטיימר מיד לאחר מוזרק העכבר הראשון.
      הערה: במינון נמוך ITTs (0.1 U/kg) ניתן לבצע כדי להעריך באופן ספציפי את הרגישות לאינסולין בכבד. באשר OGTT, חישוב הנפח הזרקת מבוסס על משקל הגוף הוא הליך רגיל, בעוד מבסס את המינון על גוף רזה מסה היא עדיפה אם נתוני הרכב גוף הינם זמינים.
  4. למדוד את רמות הגלוקוז בדם בנקודות זמן נבחר (למשל, לאחר 15, 30, 45, 60, 90 דקות).
    הערה: כמו אינסולין יש חצי-זמן קצר של ~ 10 דקות עכברים13, ההבדלים מאוחר לאחר ניהול אינסולין (למשל, לאחר 2 h) אינן משקפות בהכרח השפעה ישירה של פעילות האינסולין. להזריק תמיסת גלוקוז 20% למקרה עכבר הופך hypoglycemic (את רמות הגלוקוז בדם מתחת 35 מ"ג/ד"ל) נמצא בסיכון למות.
  5. אחרי הפעם האחרונה נקודות, מקום העכברים בחזרה לתוך הכלובים הביתה מוכן עם שפע של מזון ומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מדגימה על לוח זמנים סכמטית phenotyping מטבולית של עכברים על דיאטות. בגיל כ- 6 שבועות, עכברים להניחה על HFD, בעוד קבוצת-LFD עשוי לשמש קבוצת הביקורת. חשוב, משקל הגוף צריך להיות נחוש מדי שבוע כדי לבחון אם יש עלייה במשקל הגוף הצפוי. כל סוג של לחץ (למשל, רעש או התנהגות תוקפנית זכר) יכולה להפריע עלייה במשקל הגוף, צריך לחסל מיד. כל קוהורטה של עכברים לניסויים דיאטה צריכה להכיל לפחות 10 עכברים כי הדיאטה-ניסויים אלו זמן רב, והם ליניאריים בתדירות גבוהה (...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עם שכיחות גבוהה של סוכרת ומחלות המשויך באוכלוסיית העולם, יש דרישה חזקה למחקר פונה את המנגנון המולקולרי, מניעה וטיפול של מחלות19. פרוטוקול הציג מתאר שיטות ומבוססת על הדור של עכברים HFD, מודל בעלי חיים חזקים בשימוש עבור מחקר מטבולית, כמו גם את הולכה של OGTT, ITT, אשר הם כלי חזק ההערכה של שינויים מטבוליים לכל הגוף כגון עמידות לאינסולין. השיטות הציג נייר זה עשוי להיות שימושי ללמוד את התפקיד של גנים חשודים, גורמים סביבתיים, כמו גם טיפולי תרופתי, תזונתיים, פיזי או גנטיות על כל הגוף גלוקוז-מטבוליזם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן מדעי רפואי של ראש העיר של העיר וינה, את und Laboratoriumsmedizin לדנציג Österreichische בווריה Chemie פסיכולוג קליני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זן עכבר: C57BL/6Jמעבדת ג'קסון664LFD/HFD
Accu Chek Performa - גלוקומטררוש6870228OGTT/ITT
Accu Chek Performa - רצועותRoche6454038OGTT/ITT
D-(+)-תמיסת גלוקוזSigma-AldrichG8769OGTT
Actrapid - אינסוליןנובו נורדיסק417642ITT
מחטי האכלה לשימוש חוזרכלי מדע עדינים#18061-22OGTT; מד 22 (-24 מד לעכברים צעירים)
מזרקי מינון עדין אומניפיקסבראון9161406VOGTT/ITT
מחט אינסולין סטריקנית (30 גרם x 1/3 אינץ'; ø 0.30 x 13 מ"מ)בראון304000ITT; עכברים רזים
סטריקנים (G 27 x 3/4 אינץ'; ø 0.40 x 20 מ"מ)   בראון4657705ITT; עכברים על
צלחות HFD 96 Well PCR, ללא חצאית, גמישותBraintree Scientific, Inc.SP0016OGTT
אינסולין עכבר רגיש במיוחד ערכת ELISACrystam Chem90080OGTT
דיאטת מכרסמים עם 60% קק"ל% שומןמחקר דיאטות בע"מD12492עכברים
בדיאטת מכרסמים HFD עם 10% קק"ל% שומן.Research Diets IncD12450Bעכברים על מותג LFD
מיקרו המטוקריט נימיסיגמא-אולדריץ'BR749321OGTT/ITT
וזלין - קרםריביירהP1768677OGTT/ITT

מקורות

  1. Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
  2. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
  3. Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
  4. Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
  5. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
  6. Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
  7. Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
  8. Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
  9. Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).
  10. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
  11. Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
  12. Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
  13. Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
  14. First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
  15. McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
  16. Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
  17. NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from: http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf (2017).
  18. Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
  19. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
  20. Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
  21. Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
  22. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  23. Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
  24. Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
  25. Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
  26. Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
  27. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
  28. Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
  29. Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
  30. Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
  31. Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
  32. Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
  33. Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
  34. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
  35. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , Chapter 29 Unit 29B 23(2007).
  36. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
  37. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
  38. Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906(2013).
  39. Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
  40. Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדידת גלוקוז בדםרגישות לאינסוליןשטח תחת העקומהELISA לאינסוליןדגימת דם מהזנבפנוטיפ מטבולי
חקר In Vivo מטבוליזם הגלוקוז עכברים הניזונה דיאטה עתירת שומן באמצעות בדיקת הגלוקוז אוראלי סובלנות (OGTT) ובדיקה עמידות לאינסולין (ITT)
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.