הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

17 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פונקציות תא-אוטונומי של גנים במוח יכולים להילמד על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה באוכלוסיות דלילה של תאים. כאן, אנו מתארים בתוך הרחם אלקטרופורציה לספק Cre recombinase לאוכלוסיות דליל לפתח נוירונים בקליפת המוח עם הגנים floxed לגרום לאובדן פונקציה בתוך vivo.

תקציר

תא-אוטונומי פונקציות עצביים של גנים יכולים להתגלות על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה של גנים באוכלוסיה דלילים וקטנים של נוירונים. כדי לעשות זאת מחייבת יצירת פסיפס שבו הם נוירונים עם הפסד או רווח של תפקוד הגן מוקף ברקמה גנטית בשלוות נפש. כאן, אנו משלבים את המערכת רקומבינציה Cre-לקס עם אלקטרופורציה בתוך הרחם על מנת ליצור פסיפס רקמת המוח יכול לשמש כדי לחקור את תפקוד התא-אוטונומי גנים בנוירונים. דנ א בונה (זמין באמצעות מאגרים), קידוד עבור תווית פלורסנט ו Cre recombinase, יוכנסו פיתוח נוירונים בקליפת המוח, המכיל גנים תמר מוקף עם אתרי loxP במוחם של עוברי העכבר באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה. בנוסף, אנו מתארים עיבודים שונים בשיטה אלקטרופורציה בתוך הרחם להגביר שרידות ו הפארמצבטית. שיטה זו כרוכה גם הקמה של כייל עבור בתיווך Cre רקומבינציה אוכלוסיה דלילה או צפופה של נוירונים. ההכנות היסטולוגית של רקמת המוח שכותרתו אינם דורשים (אך ניתן להתאים) אימונוהיסטוכימיה. המבנה משמש ערובה זה fluorescently שכותרתו נוירונים לשאת הגן של יצורים recombinase. ההכנות היסטולוגית מאפשרים ניתוח מורפולוגי של נוירונים באמצעות הדמיה קונאפוקלית של דנדריטים, עצב ובשבילים, הדנדריטים. כי הפסד או רווח של פונקציה זו מושגת ברקמת פסיפס דליל, שיטה זו מאפשרת למידת הצורך תא-אוטונומי תנאי הכרחי של ג'ין מוצרים ויוו.

מבוא

יצירת פסיפס גנטי היא פרדיגמה ניסיוני הקלאסי להבנת הפונקציה של הגן עניין. כדי לקבוע אם הגן הוא הכרחי עבור הפנוטיפ הסלולר, הגישה הפשוטה ביותר היא הגורם לאובדן של הפונקציה של הגן בכל האורגניזם (למשל נוקאאוט). עם זאת, כדי לקבוע אם גן דרושה במיוחד סוג תא מסוים, נוקאאוט של הגן בכל האורגניזם אינה בגישה חוקי. במקום זאת, דרושה שיטה וזה יגרום אובדן התפקוד של גנים בתא נתון בזמן זה הוא מוקף ברקמה wildtype (דהיינו גנטית בשלוות נפש) – במילים אחרות, יצירת פסיפס רקמות. אם התא מוטציה מראה הפנוטיפ המוטנטי, אבל התאים המקיפים אותם wildtype לא, הפונקציות ג'ין באופן אוטונומי-תא ניתוח של רקמות פסיפס, שבה מוטציה בתאים מוקפים רקמה wildtype, אידיאלי להבנת פונקציות התא האוטונומי של גנים, במיוחד במוח שבו נוירונים עכשיו, דונלד יוצרים מחוברות רשת ענפה של רקמות.

כמה צורות של רקמת המוח פסיפס סיפקו עוצמה מודלים לחקור פונקציות התא האוטונומי של גנים. התמקדו ב השתלת עצביים1,2,פסיפס X-linked נקבה3,4, ו-5,פסיפס סומאטית אנדוגני6 נמשכים שלהם מסקנות בהתבסס על פסיפס רקמת המוח. מחיקה מותנה של הגן דרך מערכת רקומבינציה Cre-סלומון היא שיטה זה לוקח את מלוא היתרונות של הזמינות הגדולה של קווים העכבר מהונדס. בשיטה זו, שני אתרים loxP הם הציגו משני צדדיו רצף הנדרש של הגן (כמו אקסון), להשאירו ולצדו אתרי loxP כי שניהם מול באותו כיוון ("floxed"). Cre recombinase excises הרצף בין אתרי loxP7. בתיווך Cre רקומבינציה יכולה להיות מושגת על ידי עכברים floxed מעבר לקו אחר העכבר, לבטא Cre recombinase יחד עם סמן פלורסנט בקבוצת משנה של תאים ("קו כתב Cre"). זה הוכח במגוון דרכים כדי לחשוף את הפונקציות של גנים של קבוצות משנה של תאים, כמו נוירונים סינאפסות או האסטרוציטים8. Cre כתב שורות יכול לבטא CreERT2 כדי לאפשר בתיווך Cre רקומבינציה להיות סמים-inducible (יחיד-נוירון תיוג עם הסתרה inducible בתיווך Cre, או חלקלק)9. באסטרטגיה אחרת נקרא ניתוח פסיפס עם כפול סמנים (גברת)10,11, בתיווך Cre רקומבינציה interchromosomal מאפשר מוטציה homozygous להיווצר לצד משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים רקמות. על הגישות הללו קו חדש של עכברים צריך להיות מיוצר בכל פעם עבור כל מועמד ג'ין או סוג של הסלולר זה נבדק. לחלופין, Cre recombinase יכול להיות מוצג נוצרו אחרי הלידה דרך iontophoresis12 או ויראלי וקטורים (כגון וירוסים adeno-הקשורים13 או lentiviruses14 נושא הסלולר סוג ספציפי היזמים). אסטרטגיה זו יוצרת חזקה ופוסט תיוג. כדי להתמקד בפיתוח נוירונים בקליפת המוח מוחי בדלילות prenatally, אסטרטגיית האידיאלי הוא בתוך הרחם אלקטרופורציה של Cre recombinase עם סמן פלורסנט.

בנוסף שילוב רקומבינציה Cre-סלומון דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה לייצר פסיפס רקמות ויוו, אנו מציגים מספר עיבודים להליכים אחרים שפורסמו פרוטוקולים15,16, 17,18,19,20,21. אנו מספקים מידע כדי לשפר את ההצלחה אצל נקבות בהריון-מתוזמן הרבייה. אנחנו גם מתאר שתי אסטרטגיות שלנו להציג דלילים ובהירים תיוג של נוירונים בתוך הרקמה קורטיקלית: אסטרטגיה אחת היא titrate את הרמות של קידוד לבנות יחידה Cre recombinase, סמן פלורסנט22. אסטרטגיה נוספת היא להשתמש במערכת "סופרנובה", תוכנן במיוחד עם פרמטרים אלה המוח23,24. בנוסף, אנו מציעים שיפורים על הפקת פיפטות microinjection עקבית, העבודה הניתוח אלקטרופורציה בתוך הרחם . בסופו של דבר, אנחנו חלוקה לרמות בשלבים קריטיים הכנה היסטולוגית מפושט המאפשר הניתוח של הדנדריטים, דנדריטים, עצב ובשבילים, מבלי להכתים נוספת או אימונוהיסטוכימיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) של ג'יימס מדיסון אוניברסיטת, בהתאמה, תאימות עם כל הרלוונטיים ההנחיות הרגולטוריות ומוסדיים.

1. עכבר הקמה

  1. בית צעיר (> P60) העכבר floxed homozygous זכר ונקבה ביחד כדי להגדיר של זוג מגדל25.
    הערה: פקד שלילי טוב הוא להגדיר זוג עכברים wildtype, ב- Cre איזה ביטוי recombinase לא יגרום פסיפס26מגדל נוסף.
  2. לאפשר הנקבה ללדת ולגדל את הגורים הראשונים שלה עם הזכר. להשאיר את הזכר יחד עם הנקבה להגדיל ההישרדות של הגורים. לאחר הגמילה הגורים, למשל ביום כמחנכת (P) 21, להפריד את הנקבה ואת זכר.
  3. רבייה מאתר
    1. בצע כיוונון מתוזמן של הזדווגות בין הנקביים והזכריים25. השתמש ברמזים חזותיים כדי לקבוע מחזור ייחום של נקבה27ובדוק מהנרתיק פקקים בבוקר לאחר ההזדווגות25.
    2. אם פקק, להפריד, ולשקול את הנקבה. ספירת היום יום עובריים (E) 0.5.
    3. המשך שקילה הנקבה כל 3-5 ימים כדי לקבוע אם היא בהריון. נקבות בהריון תהיה העלאה של 10-20% במשקל הגוף 7-10 ימים לאחר ההתעברות (E0).
      הערה: שלב זה מאשר הריון קודם לכן בצורה מהימנה יותר מאשר בדיקה ויזואלית25.
    4. אם הנקבה לא בהריון, חזור על השלבים 1.3.1-1.3.3.
  4. לאחר ההריון הוא אישר, לבחור את התאריך של אלקטרופורציה בתוך הרחם . כדי למקד שכבה II/III קורטיקלית אבות עצביים כפירמידה, מבצעים אלקטרופורציה ב E15.5.

2. הגדרת דנ א

  1. לבחור DNA בודד לבנות את הקודים Cre recombinase, כמו גם סמן פלורסנט, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)28,29. לחלופין, השתמש במערכת "סופרנובה", תיאר בפירוט פרסומים קודמים23,24. ראה רשימת חומרים לדוגמה בונה.
  2. להגביר את construct(s) ה-DNA מ שלב 2.1 ב e. coli באמצעות טכניקות מיקרוביולוגית תקן30.
  3. לטהר את מבנה ה-DNA עם ערכת טיהור פלסמיד נטולת אנדוטוקסין ההוראות של היצרן. Elute הבונה עם אנדוטוקסין ללא מים.
    הערה: בחירת ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין מעל ערכת טיהור הסטנדרטי הוא קריטי.
  4. לרכז את eluate DNA ל 1-3 מ"ג/מ"ל בהתאם להזמנה צפיפות תיוג26.
    הערה: כייל נוגדנים תמיד צריך שתוקם בעת עבודה עם תבנית ה-DNA חדש, בהתחשב בכך שיש להם באורכים שונים, היזמים. לשקול הזרקת בונה על מספר ריכוזים שונים ו/או כמויות כדי להעריך את הביטוי. לדוגמה, זריקה של 1 µL או µL 1.5 על 2.0 mg/mL GFP. Cre הוא מסוגל לגרום דליל (µL 1) או צפופה (µL 1.5) תיוג של שכבה II/III חזותי נוירונים כפירמידה קורטיקלית26.
  5. להוסיף 0.4% trypan blue 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS; 137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2HPO4, מ מ 1.8 ח'2PO4 H2O, מותאם pH 7.4 עם HCl) 1:10 לפתרון ה-DNA מרוכז.
  6. להוסיף 10 x PBS 1:10 תמיסה מרוכזת ה-DNA.
  7. חנות הפתרון DNA מרוכזת בשעה 4 ° C. הפתרון ניתן לאחסן ללא הגבלת זמן.

3. הגדרת פיפטה

  1. שימוש של פולר נימי זכוכית, משוך על פיפטה עם רב מאוד (10-15 מ מ) להתחדד וטובים מאוד עצה, אופייני של מדי סוכר הזרקת תאי גזע עובריים או העברת גרעין31.
    הערה: כדי למנוע פסולת שמזהם את מדי סוכר, הם צריכה להיעשות תוך יומיים של הניתוח.
    1. כיילו את פולר נימי זכוכית על-ידי ביצוע מבחן הרמפה, ההוראות של היצרן. שימוש הערך החום שנוצר כדי לתכנת את משיכת פרוטוקול באמצעות הפרמטרים הבאים: חום = (ערך מבחן כבש + 15), למשוך = 30, ול = 120, זמן = 100, לחץ = 200. הכנס את נימי זכוכית, הדקו את התפסים על פולר ולאחר להפעיל פרוטוקול מושך מתוכנתים, יצירת נר על נימי זכוכית.
    2. להבטיח כי האורך להתחדד הוא בין 10-15 מ מ באמצעות מיקרוסקופ אור מורכבות (למשל 10 X המטרה)31.
  2. לשבור בחזרה על פיפטה להקים טיפ עם קצוות קשים בקוטר 20-25 מיקרומטר.
    1. מרכז מחיקה חד-רובדי הפעילות (ראה רשימת חומרים) מעל 50 מל גביע ומתח לנגב מתוח עם יד אחת. עם היד השנייה, להחזיק ודחף של פיפטה (להתחדד בצד למטה) בניצב, מלא דרך מרכז המחיקה, גורמת להפסקה להתחדד31.
      הערה: לדחוף את פיפטה במלואן דרך המחיקה יהיה לייצר טיפ קוטר מיקרומטר 20-25 בערך 70% מהזמן.
    2. אשר תחת מיקרוסקופ אור מורכבות (למשל 20 x המטרה).
      התראה: שימוש הגנה העין תוך שבירת הזכוכית.
  3. לכייל פיפטה מאת שואבת 1 µL של 0.4% trypan blue ב- 1 x PBS לתוך piptte מלא חלקית ולאחר מכן שסיימה את פיפטה עם סימנים 1 µL המבוסס על הגובה של µL 1 ב הפיפטה באמצעות סמן עמידים אלכוהול שקצהו פיין. השתמש את פיפטה מכוילת לסיים את פיפטות אחרים לפני השלכת. שמור פיפטות בעל פיפטה חינם מפני אבק וחלקיקים אחרים.

4. בתוך הרחם אלקטרופורציה

  1. במקום Graefe מלקחיים מספריים איריס, הרטמן יתושים מלקחיים, ארוגים גזה ספוגים, שקצהו טבעת מלקחיים, צלחות פטרי על מגש נירוסטה, עוטפים ברדיד אלומיניום. הכנס אוטוקלב מגש על saline 0.9% 1 ליטר (0.9% wt/כרך NaCl במים). אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס ו kPa 3.5 במשך 40 דקות להסיר את החיטוי ולמקם באזור הניתוח מחוטא.
    הערה: חיוני כדי לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח.
  2. חממו את הבקבוק בלוק 1 ליטר מלוחים באמבט מים קטן עד 38 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני הניתוח.
  3. להתחבר האלקטרודות פינצטה-סוג של דוושת רגל הגנרטור (ראה רשימת חומרים). בעקבות הוראות היצרן, להגדיר את הגנרטור להעביר חמישה 50 מילישניות פולסים של 50 V (עם מרווח 950 ms) כאשר מופעלות על ידי דוושת רגל. לחטא האלקטרודות פינצטה-סוג ומניחים על אזור הניתוח מחוטא.
  4. להפוך של חרוט האף הרדמה כפי שפורסמו בעבר32, אבל להשתמש הקצה של האצבע הכפפות latex nitrile או כדי ליצור בדיאפרגמה שמתאים בצורה מאובטחת על הפתיחה האף חרוט. חותכים חור מספיק גדול כדי להתאים על האף של העכבר הסרעפת.
  5. עמוק עזים ומתנגד עכברים בהריון ב E15.5 ב חדר אינדוקציה עם איזופלוריין (2-4%) מילוי חמצן טהור זורמים ב- 1 ליטר/דקה. לאחר מין ~ 1, לבחון את רפלקס שקמה בעצמה אחרי שמפילים (בעדינות להטות את התא אינדוקציה, להבטיח העכבר, לא בסדר עצמה). לשקול את העכבר כדי לקבוע מינונים של שיכוך כאבים מנוהל מאוחר יותר במהלך הניתוח.
  6. להעביר את העכבר האזור הכירורגי ולפקח בשאיפה איזופלוריין (1-2%) בחמצן טהור זורמים ב- 1 ליטר/דקה דרך קונוס האף כדי לשמור על העכבר במישור כירורגי. להשתמש מלקחיים כדי לבדוק את רפלקס פדלים (לצבוט הכפה בעדינות ולוודא כי העכבר אינו מחזיר רפלקס) כדי לוודא ההרדמה. לפקח על קצב נשימה ומאמץ, מחפש עמוק, נשימה רגיל (~ 70-100 נשימות לדקה), הקרומים הריריים הם ורודים. צבעה ולחה.
  7. להחיל משחה אופטלמולוגיות וטרינרי מספיק מעל העיניים כדי לכסות אותם לחלוטין להגנה מפני ייבוש במהלך ההליך.
  8. פלקס דיסק מתכת activator נרתיק אטום מלא supersaturated תמיסת מלח (ראה רשימת חומרים), הפעלת של התגבשות אקסותרמית של המלח. להניח 2 מגבונים חד-רובדי פעילות על התיק, במקום בעכבר על המשקה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
  9. עיסוי קרם depilatory אל אזור הבטן עם ספוגיות כותנה עד הבטן פרווה מתמוסס (כ 20-40 s), לאחר מכן לנגב את הפרווה בטן. בזהירות תנקה כל קרם שאריות ו דפילציה הנותרים עם 70% אתנול וביו -כותנה מטליות. הצב fenestrated תלוי כירורגי סטרילי באזור הבטן.
  10. באמצעות הטכניקה aseptic, משוך את העור בבטן ולהרחיקו עם מלקחיים Graefe, עושים חתך קו האמצע הגחון ~ 2 ס מ על העור בעזרת מספריים איריס, המבטיח כי השריר הבסיסית לא מתאים.
    הערה: מקובל חלופה ביצוע חתך במספריים מלקחיים ואיריס Graefe היא להשתמש אזמל, כפי שפורסם בעבר17.
  11. למצוא את linea alba להמחיש האמצע של שרירי הבטן הישרים. למשוך שריר הבטן ולהרחיקו עם מלקחיים Graefe, ולגרום חיתוך קו האמצע ~ 2 ס מ נוסף שם עם מספריים איריס, לחשוף את חלל הבטן (הרחם הוא שקוף, העוברים יהיה גלוי מתחת). ודא כי שבבסיס רקמת הרחם, מעיים לא מתאים. לבצע את החתך בלבד גדול מספיק (בדרך כלל ~ 2 ס מ) להוציא ולחשוף את הרחם בנוחות.
    הערה: מקובל חלופה ביצוע חתך במספריים מלקחיים ואיריס Graefe היא להשתמש אזמל, כפי שפורסם בעבר17.
  12. באמצעות טיפ סטרילי µL 10 micropipette, לוותר על carprofen (מומס saline 0.9% סטרילי) ב 4 מ"ג/ק"ג לתוך חלל הבטן על שיכוך כאבים.
  13. תהדק את המלקחיים יתוש אחד של הרטמן על הקצה השמאלי של החתך הבטן הישר rectus. הנח המלקחיים על פטרי שהתהפכה משמאל של החתך, לשמור על הצד השמאלי של החתך. מהדק עוד מלקחיים יתושים הרטמן על הקצה הימני של החתך הבטן הישר rectus ולנוח המלקחיים על צלחת פטרי שהתהפכה בצד ימין של החתך, לשמור על הצד הנכון של החתך. הניחו ספוג גזה סביב האזור. של החתך.
  14. באמצעות הטבעת מלקחיים (ללא בורג הגבלת המצורפת), משוך את הרחם בין כל שני העוברים שכנות ללא ריסוק או ופצעו כל רקמות. להתחיל לשלוף כל העוברים דרך החתך, להניח אותן על גבי פד ספוג. כשאני מוציאה את העוברים האחרון של חלל הבטן, ודא כי לא למשוך על השחלות או צוואר הרחם. ברגע נחשף, חיוני לשמור על הרחם לח עם מלחית. הרחם מכילה בדרך כלל בין 5 ו 8 עוברי.
    הערה: זה ניתן להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין מלוחים17.
  15. להתחבר פיפטה מכוילת של מכלול צינור ליניקת (ראה רשימת חומרים), ולהזריק µL אחת בדיוק של הפתרון דנ א מוכן בשלב 2 בקיר הרחם לתוך החדר הלטראלי של כל העובר. החדרים הצדדיים מופיעים שני טלאים telencephalon הגבי של העובר (תיקונים הם כהים יותר סביב רקמות של telencephalon). להשתמש את האגודל והאצבע במהלך microinjection ואלקטרופורציה לתמרן את העוברים, חשיפת החדרים הצדדיים ומאפשר את העוברים להיות דחף בעדינות בקיר הרחם במהלך ההזרקה. לאשר זריקה מוצלחת על ידי התבוננות trypan blue מילוי החדר הלטראלי.
  16. במקום הקתודה של פינצטה-סוג אלקטרודות (ראה רשימת חומרים) על הרחם, ישירות מעל קליפת המדיאלי, סימטרית כדי למקד את קליפת הראייה (פילוח חלופי אזורי המוח ידרוש אלקטרודה שונים השמה)16, 26. במקום האנודה על הרחם, רק נחות, והשתרשה עמוק בלבה הראש של העובר.
  17. לאשר אנודת ואת קטודית, נוגעות הרחם המקיף את העובר במקומות המתאימים. עם דוושת, לעורר את המשלוח של חמש 50 מילישניות פולסים של 50 V (עם מרווח 950 ms) על פני האלקטרודות.
    הערה: מוזרק,-אניון DNA ינוע לכיוון הקתודה ו ישולבו לתוך אזור חדרית התאים הקרובים הקתודה.
  18. להחזיר את הרחם חלל הבטן בכיוון זהה שהיא נמצאה. השתמש תמיסת מלח כדי לשמן את הרחם בזמן מנחה אותו באופן ידני, מאוד בעדינות, מטפל לא לעקור עוברי שררה ברחם.
  19. לסגור את שרירי הבטן בתפרים נספגים (ראה רשימת חומרים) באמצעות תפר קטעה פשוטה, לקשור את הקצוות עם קשר של המנתח. לא קליפ שהקצוות קרוב מדי את הקשר או שהקשר יהפוך התיר.
    הערה: זה קריטי תפר שרירי הבטן כך קצוות הפצע סגורים לגמרי סגור, אך מבלי לגרום בישול לבן של השריר. קשרים צריך להיות צמוד אז הם לא יכולים להיות התיר.
  20. סגור את שכבת העור בתפרים נספגים (תפר קטעה פשוטה, קשר מנתח, כמו שלב 4.19). למרוח כמות קטנה של רקמות דבק כדי לאחות את הפצע. החל רקמות דבק על הקשרים כדי למנוע unfastening. השתמש micropipette כדי להסיר כל דבק רקמות המקיפים את הפצע. זה יכול להיות aspirated מאת micropipette.
  21. להוריד את רמות איזופלוריין של 0.5-1.5%. ברגע רקמות דבק יבש (מבחן על-ידי נגיעה הכפפות כדי דבק), להסיר את איזופלוריין ולאפשר הנשי להחלים לבד בכלוב חמים. לנהל הבופרנורפין intraperitoneally-0.03 נקודות מ"ג/ק"ג בעזרת מזרק 1 מ"ל 26G, ½" מחט.
  22. להמשיך לעקוב אחר העכבר עד העכבר הוא התאושש לחלוטין, להתנהג בדרך כלל (כלומר לטפח, לחקור את הכלוב, אכילה או שתייה). ברגע התאושש, הנח הנשי בחזרה לכלוב עם זכר.
    הערה: אם כל השלבים עוקבים, העכבר בדרך כלל להכרה בתוך 2 דקות, מיד מתחילים לנוע את הכלוב, מראה שום סימנים של אי נוחות.
  23. אם העכבר מוצגים סימנים של אי נוחות (למשל שפופות יציבה, הפרשות פורפירין)33, לנהל carprofen-0.1 מ"ג/מ"ל באספקת המים. אם יש כמה סימנים של אי נוחות, או אם אי נוחות נמשכת במשך יותר מ 4 שעות למרות carprofen מינהל, מיד המתת חסד העכבר על ידי מתן זריקה קטלנית בקרום הבטן של קטאמין (240 מ"ג/ק"ג) - חריגות השירותים הווטרינריים (48 מ"ג/ק"ג)- קוקטייל איזופרומאזין (1.85 מ"ג/ק"ג) בעזרת מזרק 1 מ"ל 26 G, ½" מחט, ופעל עם צורה משנית המאושרות של המתת חסד33.
  24. כדי לשפר את ההישרדות של עוברי electroporated לאחר הלידה, שמור את הכלוב שקט מחזיק בחדר, ללא רעשים ורעידות. להעשיר את הסביבה עם igloos פלסטיק, חומרי קינון של תוספי מזון כגון זרעי חמניות (ראה רשימת חומרים). אין להעביר או להפריע את הכלוב, במיוחד במהלך 3 הימים הראשונים לאחר parturition.

5. היסטולוגית לקראת זריחה מיקרוסקופ

הערה: פרוטוקול זה היסטולוגיה ממוטבת עבור הכנת הרקמה מבעלי חיים שגילם יום לאחר הלידה (P) 13 שהיו electroporated בתוך הרחם. כדי להכין טישו מבעלי חיים צעירים לאחר הלידה (P0-P13), מומלץ לעקוב אחר כל השלבים (כולל זלוף transcardial), למרות המוח צריך להיות מוטבעת אגר לפני הכנת מקטעים (שלב 5.9). אפילו עשוי להיות מוכן רקמות מעוברים בתוך 1-2 ימים לאחר אלקטרופורציה, בשיטות שתוארו קודם לכן18,20.

  1. הכנת paraformaldehyde (PFA) פתרון.
    הערה: זה הכרחי כדי להכין PFA טריים, תוך יום אחד של הניסוי.
    התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים.
    1. כדי להפוך 50 מ של 4% מחברים, חום 40 מ"ל מים 60 מעלות צלזיוס. להוסיף 2 g PFA תוך כדי ערבוב עם זכוכית מוט או ערבוב בר. הוסף 10 µL של NaOH M 10 כל 2 דקות עד PFA מתמוסס.
    2. הוסף 5 מ של 10 x PBS ולהביא פתרון נפח סופי של 50 מ ל מים.
    3. לאחר הבאת פתרון ל 50 מ ל, להתאים pH ל 7.4 כנדרש עם 10 מ' פתרון HCl. אפשר מגניב ולאחסן ב 4 º C.
  2. המתת חסד עכבר עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (240 מ"ג/ק"ג) - חריגות השירותים הווטרינריים (48 מ"ג/ק"ג) - איזופרומאזין (1.85 מ"ג/ק"ג) קוקטייל באמצעות מזרק 1 מ"ל 26G, ½" מחט. Transcardially perfuse PBS קר כקרח x 1 mL 10 או 20, ואחריו 25 או 40 מ"ל טריים, קפואים 4% PFA17. להשתמש באמצעי אחסון נמוך יותר עבור עכברים צעירים (P0-P13) כמחנכת ואמצעי אחסון גבוה יותר עבור עכברים בוגרים (P14 ומעלה).
  3. מיד לאחר זלוף, לערוף קארקאס העכבר בין עצם העורף C1 חוליה עם מספריים גדולים, הקילוף, למחוק את רוב העור שמסביב הגולגולת באמצעות מספריים איריס במיוחד העור, חזיתי שמסביב, הקודקוד ואת העורף עצמות. לשמור את הגולגולת ואת המוח ללא שינוי.
  4. מניחים את הגולגולת ואת המוח 10 מ ל 4% מחברים צינור חרוטי 50 מל במשך 24 שעות ביממה ב 4 ° C לתקן שלאחר רקמות. לאחר מכן להוסיף 30 מ ל 1 x PBS צינור חרוטי כדי לדלל את פתרון 1% מחברים עבור אחסון ב 4 º C.
    הערה: השתמש צינור חרוטי נפרד עבור כל הגולגולת והמוח צורך לתקן פוסט. לא דגירה המוח 1% PFA לתקופה העולה על שבועיים, או קרינה פלואורסצנטית יתחיל לדעוך.
  5. ובמקום במוח הגולגולת על משטח שטוח עם יחיד-רובדי פעילות מגבונים לחלח עם 1 x PBS. השתמש זוג מלקחיים (ראה רשימת חומרים) כדי להסיר את כל העור שנותר או קרום המקיפים את הגולגולת.
  6. באמצעות פינצטה, הסר תחילה את עצם העורף ולאחר מכן הסר בזהירות לעצמות, הזזת את הפינצטה החוצה מפני השטח של המוח. הסר בזהירות בכל קרומי המוח כדי למנוע נזק קליפת המוח.
  7. וודג בגב הפינצטה לתוך המוח לאורך הגולגולת לנתק את כל עצבי, מסירים את המוח.
  8. צעירה מוח (P0-P13) כמחנכת
    1. להפוך 25 מ של 4% אגר על-ידי חימום PBS 1 x 25 מ ל עד 80 ° C. מערבבים, להמיס 1 g אגר עם בר מוט או ערבוב זכוכית).
    2. פתרון מגניב עד 35 ° צלזיוס תוך לבחוש. מקום במוח במיכל קטן (למשל הכובע של צינור חרוטי 50 מ ל), שופכים אגר פתרון המוח. לאפשר אגר להקשיח.
  9. לעשות חתך הילתית באופן ידני באמצעות תער קצה חד דרך המוח, כ 0.5 מ מ rostral כדי bregma. לבצע חתך הילתית עוד דרך המוח כ 0.5 מ מ סימטרית קליפת הראייה. במקום בריכה של דבק מגע דבק בקוטר זהה, בעוד rostral של המוח על התקליטור הדגימה מיקרוטום רוטטת במרכז. חבר את הקצה rostral של המוח מעל הבריכה של דבק, המבטיח כי השטח rostral של רקמת מאוגדת לדיסק הדגימה עם דבק.
  10. הר מאגר מגש על גבי רוטטת מיקרוטום ולאבטח עם ידית clamping מובנה. להכניס להב הסכין מחזיק, והר מחזיק סכין על גבי רוטטת מיקרוטום עם בורג clamping מובנה. לאבטח הדגימה דיסק עם המוח על גבי מגש המאגר באמצעות מובנית clamping המכשיר. הגדר הגדרת מהירות עד 5.70 (= 0.285 מ מ/s) וקביעת תדירות 5.33 (: 53.3 Hz).
  11. למלא את התא מעל הרמה של המוח 1 x PBS ולהוריד את הלהב לתוך מגניב. להתחיל לקחת 100 מיקרומטר מקטעים הילתית דרך הרקמות.
  12. אם לא דורש עיבוד נוסף, כגון 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) גרעיני להכתים או אימונוהיסטוכימיה.
    1. להשתמש במכחול משופעת בסדר להעביר חלקים ישירות מ- האזמל הקטן רוטטת לשקופית מיקרוסקופ, התאמת סעיפים 4-6 על כל שקופית.
    2. לאפשר הסעיפים להתייבש על ידי הפתילה פתרון משם עם מברשת משופעת בסדר, כך פרוסות המוח כבר לא להיסחף בשקופיות.
    3. אז, במקום טיפה אחת של mountant (ראה רשימת חומרים) על כל מקטע בשקופית.
    4. בעדינות שכבה של coverslip 24 x 50 מ מ על גבי, להבטיח כי 1) אין בועות אוויר הטופס על הסעיפים, סעיפים 2) אל תזוז, mountant 3) מכסה במלואה את האזור בין שקופיות coverslip. אפשר את mountant לרפא לפחות 24-48 שעות.
  13. כתם גרעינים עם דאפי לבדיקה היסטולוגית של סחוס בקליפת המוח
    1. להשתמש במכחול משופעת בסדר להעביר כל מקטע לתוך פתרון המכילה 10 µg/mL דאפי (ראה רשימת חומרים) מדולל ב- 1 x PBS מהפתרון מניות (20 מ"ג/מ"ל דאפי במים).
    2. דגירה בפתרון דאפי למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להשתמש במכחול משופעת בסדר כדי להעביר מקטע דאפי פתרון 1 x PBS דגירה ב- PBS 1 x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. העברת סעיף שתיים יותר פעמים טרי 1 x PBS למשך 5 דקות. לאחר מכן, שימוש במכחול משופעת בסדר, העברת המקטע לשקופית מיקרוסקופ, בצע את השלבים הבאים 5.11.2-5.11.4, ולהמשיך עם שלב 5.13.
  14. חום צלחת פטרי זכוכית המכילים Valap (חלקים שווים וזלין לנולין, פרפין) על פלטה חמה בקביעה בחום נמוך עד נמס לחלוטין. חותם נחשף קצות השקופיות על-ידי צחצוח על Valap נמס.
  15. כדי לבדוק קרינה פלואורסצנטית ברקמה, שימוש במיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה רשימת חומרים) ולהגדיר מסנן נאותה לצפייה fluorophore את (למשל דאפי: עירור 325-375 ננומטר, פליטה 435-485 ננומטר; GFP: עירור 450-490 nm, פליטה 500-550 ננומטר)17. תמונות קונאפוקלית עשוי להילקח עם נמוך - (4 X, מפתח נומרי, NA = 0.20), בינוני-(20 X, NA = 0.75), ואת ובעוצמת (60 X, NA = 1.40) מטרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הסינגל לבנות GFP. Cre (ראה רשימת חומרים) היה electroporated-E15.5, דמיינו את P14. בהתאם את הריכוז של הבונה את עוצמת הזריקה, תוצאה של דלילה או צפופה ניתן להשיג22,26. לדוגמה, הזרקה של 1 µL של 2 מ"ג/מ"ל GFP. תוצאות Cre בהתפלגות דלילה של תאים עם תוויות, אשר יכול להיות בהיר (איור 1 א'), המותאמות לשפות אחרות של שכבה II/III (איור 1B). מכיוון הרקמה הוא בעובי 100 מיקרומטר, רוב ובש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנחנו מציגים את השילוב של אלקטרופורציה בתוך הרחם עם Cre recombinase בעכברים floxed כדי ליצור פסיפס רקמת המוח. היתרון בגישה זו הוא כי קו עכבר חדש לא צריך להיווצר בכל פעם תת סוג הסלולר שונים כדי להיות ממוקד: בתוך הרחם אלקטרופורציה יכול לשמש למטרה נוירונים סינאפסות, נוירונים מעכבות או עכשיו תלוי בזמן, דונלד המיקום של אלקטרופורציה15,16,17,18,19

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים תודה לתמיכתה הנדיבה של ג'יימס מדיסון אוניברסיטת המחלקה של הביולוגיה ואת ג'יימס מדיסון אוניברסיטת מיקרוסקופ אור מתקן הדמיה. ד ר מארק ל' גבריאלה לקבלת עצות מועילות בנוגע צעיר רקמות כמחנכת הכנה, ד"ר ג'סטין וו בראון, קורי Cleland ל' לתיאום נדיב של חומרים כירורגי בחלל. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק מחקר שיתופי 4-VA, שותפות שיתוף פעולה לקידום של חבר העמים של וירג'יניה (G.S.V.), וכן על ידי וירג'יניה האקדמיה של המדע קטן פרויקט במענק מחקר (G.S.V.). תמיכה בנדיבות סופק על ידי הקרן בטי ג'ו האוהב באטלר 58 לתואר ראשון מלגות מחקר (ל K.M.B.), פארל הקיץ מחקר מלגה (K.M.B.), ג'יימס מדיסון האוניברסיטה השנייה המאה מלגה (K.M.B.), ג'יימס המלגה מאוניברסיטת מדיסון סנטניאל (ל C.J.H.), ג'יימס מדיסון אוניברסיטת לוסי רובינסון חיפוש ' 30 אנדרטת מלגה (Z.L.H.) ו ג'יימס מדיסון קולג האוניברסיטה של מדע, מתמטיקה בפקולטה סיוע מענק (G.S.V.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברי C57BL/6Jמעבדת ג'קסון#000664ראה "1. הגדרת עכבר" (שלב 1.1, "עכברים מסוג פרא")
GFP. Cre וקטור ריקAddGene#20781ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 "מבנה DNA יחיד המקודד ל-Cre recombinase כמו גם סמן פלואורסצנטי"). GFP. וקטור ריק של Cre היה מתנה מטיילר ג'קס.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (סופרנובה)AddGene#69138ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 מערכת "סופרנובה") ו-http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (סופרנובה) הייתה מתנה מטאקוג'י איוואסאטו.
pK031.TRE-Cre (סופרנובה)AddGene#69136ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 מערכת "סופרנובה") ו-http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (סופרנובה) הייתה מתנה מטאקוג'י איוואסאטו.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 מערכת "סופרנובה") ו-http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (סופרנובה) הייתה מתנה מטאקוג'י איוואסאטו.
ערכת מקסי פלסמיד EndoFree (10)Qiagen#12362ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.3 "ערכת טיהור פלסמיד ללא אנדוטוקסין")
אבקת טריפאן כחולה, דרגת BioReagentSigmaT6146-5Gראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "טריפאן כחול")
נתרן כלורי, ACS, 2.5 ק"גVWRBDH9286-2.5 ק"גראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "NaCl")
אשלגן כלורי, ACS, 500 גרםVWR# 97061-566ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "KCl")
נתרן פוספט דו-בסיסי, ריאגנט פלוס, 100 גרםסיגמא-אולדריץ'S0876-100Gראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "Na2HPO4")
אשלגן פוספט מונובסיסי, ReagentPlus, 100 גרםSigma-AldrichP5379-100Gראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "KH2PO4")
חומצה הידרוכלורית, מגיב ACS, 500 מ"לFisher ScientificA144-500ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "HCl")
P-97 מכשיר חולץ מיקרופיפטהP-97ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.1 "חולץ נימי זכוכית")
נימה שוקת ברוחב 3.0 מ"ממכשיר סאטרFT330Bראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.1 "חולץ נימי זכוכית")
נימי זכוכית דקים בקיר, 4 אינץ', 1 / 0.75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.1.1 "נימי זכוכית")
מגבונים רכים חד-שכבתיים, 4.5 אינץ'PhenixLW-8148ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.2.1 "ניגוב משימות חד-שכבתי"); ניתן להשתמש במגבונים חד-שכבתיים אחרים (למשל Kimwipes).
מלקחיים של Graefe, 7 ס"מ, ישר, 0.7 מ"מ 1x2 שינייםWorld Precision Instruments#14140ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מלקחיים גראף")
מספריים לאיריס, 11.5 ס"מ, ישר, 12 חבילותWorld Precision Instruments#503708-12ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מספריים לקשתית")
מלקחיים יתושים של הרטמן, 9 ס"מ, ישר, 12 חבילותמכשירים מדויקים בעולם#503728-12ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.1 "מלקחיים נגד יתושים הרטמן")
ספוגים לא ארוגים לשימוש כללי, 2 אינץ' x 2 אינץ',Medrepexpress#2204-cראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "ספוגי גזה לא ארוגים")
מלקחיים עם קצה טבעת, 10 ס"מ, ישר, 2.2 מ"מ IDWorld Precision Instruments#503203ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מלקחיים עם קצה טבעת")
צלחות פטרי פיירקס הושלמו, OD וזמנים; H 100 מ"מ ופי זמנים; 20 מ"מסיגמא-אולדריץ'CLS3160102-12EAראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.1 "צלחות פטרי")
מגש מכשירים מסוג שטוח, נירוסטה, 13-5/8 אינץ' x 9-3/4 אינץ' x 5/8 אינץ'אמזוןB007SHGAHAראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מגש נירוסטה")
פינצטה פלטינה, 5 מ"מBTX#45-0489ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.3 ו-4.16 "אלקטרודות מסוג פינצטה")
ECM 830 דוושת רגלBTX#45-0211ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.3 ו-4.17 "דוושת רגל")
גנרטור ECM 830BTX#45-0052ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.3 "גנרטור")
מערכת הרדמה איזופלורן של בעלי חיים בודדים עם קופסת אינדוקציה קטנהמכשיר הרווארד#72-6468ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.4 ו-4.6 "חרוט אף", שלב 4.4 "תא אינדוקציה")
משחה עינייםHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.7 "משחת עיניים וטרינרית")
ג'ל חלל (AIMS)VWR#95059-640ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.8 "שקית אטומה מלאה בתמיסת מלח רוויה")
קרם ג'ל להסרת שיער, Sensitive FormulaVeet#062200809951ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.9 "קרם אפילציה")
10ul מתנע קצה שמירה נמוך (960 טיפים/pk)מוצרי מחקר פניקסTSP-10LKITראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.12 "סטרילי 10 ומיקרו; L קצה מיקרופיפטה")
מכלולי צינור שואב לפיפטות מיקרו-נימיות מכוילותSigma-AldrichA5177ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.15 "מכלול צינור שואב")
תפר נספג קלוע, 4-0, מחט NFS-2 (FS-2), 27 "MedrepexpressMV-J397ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.19 "תפרים נספגים")
" LiquiVet Rapid" דבק רקמותMedrepexpressVG3ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.20 "דבק רקמות")
מזרקים היפודרמיים, פוליפרופילן, קצה נעילת לואר, קיבולת 1.0 מ"לסיגמא-אולדריץ'Z551546-100EAראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.21 "מזרק 1 מ"ל")
BD מד מחטי מזרק Precisionglide 26, L 1/2 אינץ'.סיגמא-אולדריץ'Z192392-100EAראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.21 "26G, ½ ” מחט")
Nestlets Nesting MaterialAncareNES3600ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.24 "חומרי קינון")
זרעי חמניות, שמן שחור,ביו-סרבS5137ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.24 "זרעי חמניות")
פרפורמלדהיד, 97%אלפא AesarA11313ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.1.1 "PFA")
פינצטה חסכונית #3, 11 ס"מ, 0.2 x 0.4 מ"מ טיפיםמכשירי דיוק עולמיים#501976ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.5 "פינצטה")
אבקת אגראלפא Aesar#10752ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.8.1 "אגר")
סכיני גילוח חד-צדדיים, להב #9Stanley Tools#11-515ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.9 "סכין גילוח חד קצה")
דיסק דגימה S D 50 מ"מLeica#14046327404ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.9 "דיסק דגימת מיקרוטום רוטט")
מגש חיץ מכלול SLeica#1404630132ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "מגש חיץ")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "מיקרוטום רוטט")
סכיני גילוח כפוליםPersonnaBP9020ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "להב")
מחזיק סכין SLeica#14046230131ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "מחזיק סכינים")
סטודיו אלמנטים של Golden Taklon ידית קצרה סט מברשות עגולותאמזוןB0089KU6XEראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.1 "מכחול עדין")
Superfrost Plus Slidesשירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית#71869-11ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.1 "שקופית מיקרוסקופ")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 מ"לThermofisherP36970ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.3-5.12.4 "תושב")
זכוכית כיסוי, 24 x 50 מ"מ, מס' 1מוצרי מחקר פניקסMS1415-10ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.4 "כיסוי")
4&פריים;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד (DAPI)סיגמא-אולדריץ'D9542ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.13.1 "DAPI")
שלב קבוע מיקרוסקופ זקוףאולימפוסBX51WIראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "מיקרוסקופ אור")
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקליNikonTE2000/C2siראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "מיקרוסקופ קונפוקלי")
4x מטרה, NA = 0.20NikonCFI Plan Apo Lambda 4Xראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "יעד הספק נמוך")
יעד פי 20, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20Xראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "יעד הספק בינוני")
60x מטרה, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X Oilראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "יעד בעל עוצמה גבוהה")
4 שכבות סטרילי

מקורות

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641(2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747(2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח פסיפס גנטימחקר פנוטיפ נוירונליהזרקת מבנה DNAכיול טריפאן בלו (Trypan Blue)ניתוח דימיון קונפוקאליטכניקת סימון דלילההתמקדות בשכבות קורטיקליות
גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.