פונקציות תא-אוטונומי של גנים במוח יכולים להילמד על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה באוכלוסיות דלילה של תאים. כאן, אנו מתארים בתוך הרחם אלקטרופורציה לספק Cre recombinase לאוכלוסיות דליל לפתח נוירונים בקליפת המוח עם הגנים floxed לגרום לאובדן פונקציה בתוך vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תא-אוטונומי פונקציות עצביים של גנים יכולים להתגלות על ידי גרימת הפסד או רווח של פונקציה של גנים באוכלוסיה דלילים וקטנים של נוירונים. כדי לעשות זאת מחייבת יצירת פסיפס שבו הם נוירונים עם הפסד או רווח של תפקוד הגן מוקף ברקמה גנטית בשלוות נפש. כאן, אנו משלבים את המערכת רקומבינציה Cre-לקס עם אלקטרופורציה בתוך הרחם על מנת ליצור פסיפס רקמת המוח יכול לשמש כדי לחקור את תפקוד התא-אוטונומי גנים בנוירונים. דנ א בונה (זמין באמצעות מאגרים), קידוד עבור תווית פלורסנט ו Cre recombinase, יוכנסו פיתוח נוירונים בקליפת המוח, המכיל גנים תמר מוקף עם אתרי loxP במוחם של עוברי העכבר באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה. בנוסף, אנו מתארים עיבודים שונים בשיטה אלקטרופורציה בתוך הרחם להגביר שרידות ו הפארמצבטית. שיטה זו כרוכה גם הקמה של כייל עבור בתיווך Cre רקומבינציה אוכלוסיה דלילה או צפופה של נוירונים. ההכנות היסטולוגית של רקמת המוח שכותרתו אינם דורשים (אך ניתן להתאים) אימונוהיסטוכימיה. המבנה משמש ערובה זה fluorescently שכותרתו נוירונים לשאת הגן של יצורים recombinase. ההכנות היסטולוגית מאפשרים ניתוח מורפולוגי של נוירונים באמצעות הדמיה קונאפוקלית של דנדריטים, עצב ובשבילים, הדנדריטים. כי הפסד או רווח של פונקציה זו מושגת ברקמת פסיפס דליל, שיטה זו מאפשרת למידת הצורך תא-אוטונומי תנאי הכרחי של ג'ין מוצרים ויוו.
מבוא
יצירת פסיפס גנטי היא פרדיגמה ניסיוני הקלאסי להבנת הפונקציה של הגן עניין. כדי לקבוע אם הגן הוא הכרחי עבור הפנוטיפ הסלולר, הגישה הפשוטה ביותר היא הגורם לאובדן של הפונקציה של הגן בכל האורגניזם (למשל נוקאאוט). עם זאת, כדי לקבוע אם גן דרושה במיוחד סוג תא מסוים, נוקאאוט של הגן בכל האורגניזם אינה בגישה חוקי. במקום זאת, דרושה שיטה וזה יגרום אובדן התפקוד של גנים בתא נתון בזמן זה הוא מוקף ברקמה wildtype (דהיינו גנטית בשלוות נפש) – במילים אחרות, יצירת פסיפס רקמות. אם התא מוטציה מראה הפנוטיפ המוטנטי, אבל התאים המקיפים אותם wildtype לא, הפונקציות ג'ין באופן אוטונומי-תא ניתוח של רקמות פסיפס, שבה מוטציה בתאים מוקפים רקמה wildtype, אידיאלי להבנת פונקציות התא האוטונו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) של ג'יימס מדיסון אוניברסיטת, בהתאמה, תאימות עם כל הרלוונטיים ההנחיות הרגולטוריות ומוסדיים.
1. עכבר הקמה
- בית צעיר (> P60) העכבר floxed homozygous זכר ונקבה ביחד כדי להגדיר של זוג מגדל25.
הערה: פקד שלילי טוב הוא להגדיר זוג עכברים wildtype, ב- Cre איזה ביטוי recombinase לא יגרום פסיפס26מגדל נוסף. - לאפשר הנקבה ללדת ולגדל את הגורים הראשונים שלה עם הזכר. להשאיר את הזכר יחד עם הנקבה להגדיל ההישרדות של הגורים. לאחר הגמילה הגורים, למשל ביום כמחנכת (P) 21, להפריד את הנקבה ואת זכר.
- רבייה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הסינגל לבנות GFP. Cre (ראה רשימת חומרים) היה electroporated-E15.5, דמיינו את P14. בהתאם את הריכוז של הבונה את עוצמת הזריקה, תוצאה של דלילה או צפופה ניתן להשיג22,26. לדוגמה, הזרקה של 1 µL של 2 מ"ג/מ"ל GFP. תוצאות Cre בהתפלגות דלילה של תאים עם תוויות, אשר יכול להיות בהיר (איור 1 א'), המותאמות לשפות אחרות של שכבה II/III (איור 1B). מכיוון הרקמה הוא בעובי 100 מיקרומטר, רוב ובש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנחנו מציגים את השילוב של אלקטרופורציה בתוך הרחם עם Cre recombinase בעכברים floxed כדי ליצור פסיפס רקמת המוח. היתרון בגישה זו הוא כי קו עכבר חדש לא צריך להיווצר בכל פעם תת סוג הסלולר שונים כדי להיות ממוקד: בתוך הרחם אלקטרופורציה יכול לשמש למטרה נוירונים סינאפסות, נוירונים מעכבות או עכשיו תלוי בזמן, דונלד המיקום של אלקטרופורציה15,16,17,18,19
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
המחברים תודה לתמיכתה הנדיבה של ג'יימס מדיסון אוניברסיטת המחלקה של הביולוגיה ואת ג'יימס מדיסון אוניברסיטת מיקרוסקופ אור מתקן הדמיה. ד ר מארק ל' גבריאלה לקבלת עצות מועילות בנוגע צעיר רקמות כמחנכת הכנה, ד"ר ג'סטין וו בראון, קורי Cleland ל' לתיאום נדיב של חומרים כירורגי בחלל. מחקר זה מומן בחלקו על ידי מענק מחקר שיתופי 4-VA, שותפות שיתוף פעולה לקידום של חבר העמים של וירג'יניה (G.S.V.), וכן על ידי וירג'יניה האקדמיה של המדע קטן פרויקט במענק מחקר (G.S.V.). תמיכה בנדיבות סופק על ידי הקרן בטי ג'ו האוהב באטלר 58 לתואר ראשון מלגות מחקר (ל K.M.B.), פארל הקיץ מחקר מלגה (K.M.B.), ג'יימס מדיסון האוניברסיטה השנייה המאה מלגה (K.M.B.), ג'יימס המלגה מאוניברסיטת מדיסון סנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| עכברי C57BL/6J | מעבדת ג'קסון | #000664 | ראה "1. הגדרת עכבר" (שלב 1.1, "עכברים מסוג פרא") |
| GFP. Cre וקטור ריק | AddGene | #20781 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 "מבנה DNA יחיד המקודד ל-Cre recombinase כמו גם סמן פלואורסצנטי"). GFP. וקטור ריק של Cre היה מתנה מטיילר ג'קס. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (סופרנובה) | AddGene | #69138 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 מערכת "סופרנובה") ו-http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (סופרנובה) הייתה מתנה מטאקוג'י איוואסאטו. |
| pK031.TRE-Cre (סופרנובה) | AddGene | #69136 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 מערכת "סופרנובה") ו-http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (סופרנובה) הייתה מתנה מטאקוג'י איוואסאטו. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.1 מערכת "סופרנובה") ו-http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (סופרנובה) הייתה מתנה מטאקוג'י איוואסאטו. |
| ערכת מקסי פלסמיד EndoFree (10) | Qiagen | #12362 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.3 "ערכת טיהור פלסמיד ללא אנדוטוקסין") |
| אבקת טריפאן כחולה, דרגת BioReagent | Sigma | T6146-5G | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "טריפאן כחול") |
| נתרן כלורי, ACS, 2.5 ק"ג | VWR | BDH9286-2.5 ק"ג | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "NaCl") |
| אשלגן כלורי, ACS, 500 גרם | VWR | # 97061-566 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "KCl") |
| נתרן פוספט דו-בסיסי, ריאגנט פלוס, 100 גרם | סיגמא-אולדריץ' | S0876-100G | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "Na2HPO4") |
| אשלגן פוספט מונובסיסי, ReagentPlus, 100 גרם | Sigma-Aldrich | P5379-100G | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "KH2PO4") |
| חומצה הידרוכלורית, מגיב ACS, 500 מ"ל | Fisher Scientific | A144-500 | ראה "2. הגדרת DNA" (שלב 2.5 "HCl") |
| P-97 מכשיר חולץ מיקרופיפטה | P-97 | ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.1 "חולץ נימי זכוכית") | |
| נימה שוקת ברוחב 3.0 מ"מ | מכשיר סאטר | FT330B | ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.1 "חולץ נימי זכוכית") |
| נימי זכוכית דקים בקיר, 4 אינץ', 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.1.1 "נימי זכוכית") |
| מגבונים רכים חד-שכבתיים, 4.5 אינץ' | Phenix | LW-8148 | ראה "3. הגדרת פיפטה" (שלב 3.2.1 "ניגוב משימות חד-שכבתי"); ניתן להשתמש במגבונים חד-שכבתיים אחרים (למשל Kimwipes). |
| מלקחיים של Graefe, 7 ס"מ, ישר, 0.7 מ"מ 1x2 שיניים | World Precision Instruments | #14140 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מלקחיים גראף") |
| מספריים לאיריס, 11.5 ס"מ, ישר, 12 חבילות | World Precision Instruments | #503708-12 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מספריים לקשתית") |
| מלקחיים יתושים של הרטמן, 9 ס"מ, ישר, 12 חבילות | מכשירים מדויקים בעולם | #503728-12 | ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.1 "מלקחיים נגד יתושים הרטמן") |
| ספוגים לא ארוגים לשימוש כללי, 2 אינץ' x 2 אינץ', | Medrepexpress | #2204-c | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "ספוגי גזה לא ארוגים") |
| מלקחיים עם קצה טבעת, 10 ס"מ, ישר, 2.2 מ"מ ID | World Precision Instruments | #503203 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מלקחיים עם קצה טבעת") |
| צלחות פטרי פיירקס הושלמו, OD וזמנים; H 100 מ"מ ופי זמנים; 20 מ"מ | סיגמא-אולדריץ' | CLS3160102-12EA | ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.1 "צלחות פטרי") |
| מגש מכשירים מסוג שטוח, נירוסטה, 13-5/8 אינץ' x 9-3/4 אינץ' x 5/8 אינץ' | אמזון | B007SHGAHA | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.1 "מגש נירוסטה") |
| פינצטה פלטינה, 5 מ"מ | BTX | #45-0489 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.3 ו-4.16 "אלקטרודות מסוג פינצטה") |
| ECM 830 דוושת רגל | BTX | #45-0211 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.3 ו-4.17 "דוושת רגל") |
| גנרטור ECM 830 | BTX | #45-0052 | ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.3 "גנרטור") |
| מערכת הרדמה איזופלורן של בעלי חיים בודדים עם קופסת אינדוקציה קטנה | מכשיר הרווארד | #72-6468 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.4 ו-4.6 "חרוט אף", שלב 4.4 "תא אינדוקציה") |
| משחה עיניים | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.7 "משחת עיניים וטרינרית") |
| ג'ל חלל (AIMS) | VWR | #95059-640 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.8 "שקית אטומה מלאה בתמיסת מלח רוויה") |
| קרם ג'ל להסרת שיער, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.9 "קרם אפילציה") |
| 10ul מתנע קצה שמירה נמוך (960 טיפים/pk) | מוצרי מחקר פניקס | TSP-10LKIT | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.12 "סטרילי 10 ומיקרו; L קצה מיקרופיפטה") |
| מכלולי צינור שואב לפיפטות מיקרו-נימיות מכוילות | Sigma-Aldrich | A5177 | ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.15 "מכלול צינור שואב") |
| תפר נספג קלוע, 4-0, מחט NFS-2 (FS-2), 27 " | Medrepexpress | MV-J397 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.19 "תפרים נספגים") |
| " LiquiVet Rapid" דבק רקמות | Medrepexpress | VG3 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.20 "דבק רקמות") |
| מזרקים היפודרמיים, פוליפרופילן, קצה נעילת לואר, קיבולת 1.0 מ"ל | סיגמא-אולדריץ' | Z551546-100EA | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.21 "מזרק 1 מ"ל") |
| BD מד מחטי מזרק Precisionglide 26, L 1/2 אינץ'. | סיגמא-אולדריץ' | Z192392-100EA | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.21 "26G, ½ ” מחט") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | ראה "4. באלקטרופורציה ברחם" (שלב 4.24 "חומרי קינון") |
| זרעי חמניות, שמן שחור, | ביו-סרב | S5137 | ראה "4. באלקטרופורציה של הרחם" (שלב 4.24 "זרעי חמניות") |
| פרפורמלדהיד, 97% | אלפא Aesar | A11313 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.1.1 "PFA") |
| פינצטה חסכונית #3, 11 ס"מ, 0.2 x 0.4 מ"מ טיפים | מכשירי דיוק עולמיים | #501976 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.5 "פינצטה") |
| אבקת אגר | אלפא Aesar | #10752 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.8.1 "אגר") |
| סכיני גילוח חד-צדדיים, להב #9 | Stanley Tools | #11-515 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.9 "סכין גילוח חד קצה") |
| דיסק דגימה S D 50 מ"מ | Leica | #14046327404 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.9 "דיסק דגימת מיקרוטום רוטט") |
| מגש חיץ מכלול S | Leica | #1404630132 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "מגש חיץ") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "מיקרוטום רוטט") |
| סכיני גילוח כפולים | Personna | BP9020 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "להב") |
| מחזיק סכין S | Leica | #14046230131 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.10 "מחזיק סכינים") |
| סטודיו אלמנטים של Golden Taklon ידית קצרה סט מברשות עגולות | אמזון | B0089KU6XE | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.1 "מכחול עדין") |
| Superfrost Plus Slides | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | #71869-11 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.1 "שקופית מיקרוסקופ") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 מ"ל | Thermofisher | P36970 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.3-5.12.4 "תושב") |
| זכוכית כיסוי, 24 x 50 מ"מ, מס' 1 | מוצרי מחקר פניקס | MS1415-10 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.12.4 "כיסוי") |
| 4&פריים;,6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד (DAPI) | סיגמא-אולדריץ' | D9542 | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.13.1 "DAPI") |
| שלב קבוע מיקרוסקופ זקוף | אולימפוס | BX51WI | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "מיקרוסקופ אור") |
| סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon | TE2000/C2si | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "מיקרוסקופ קונפוקלי") |
| 4x מטרה, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "יעד הספק נמוך") |
| יעד פי 20, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "יעד הספק בינוני") |
| 60x מטרה, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | ראה "5. היסטולוגיה" (שלב 5.15 "יעד בעל עוצמה גבוהה") |
מקורות
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
