מאמר שיטה

וזמינותו פשוטה מבוססת-תא Immunofluorescence לאיתור נוגדן עצמי כנגד הקולטן N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) בדם

DOI:

10.3791/56676

⸱

9 בינואר 2018

 , 
1Department of Psychiatry, Chang Gung Memorial Hospital-Linkou, 2Department and Graduate Institute of Biomedical Sciences, Chang Gung University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו ectopically לידי יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים עובריים אנושיים (HEK293) כמו אנטיגן לזהות עצמיים כנגד קולטן NMDA בדם של חולים חשוד עם דלקת אוטואימונית. שיטה פשוטה זו עשויה להיות מתאימים לסינון למטרות בהגדרות קליניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנוכחות של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי יכול לגרום לסימפטומים מנוטלי שונים של חולים מושפעת, כינה דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA. זיהוי נוגדן עצמי ספציפי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי שדרתי (CSF) חיונית לאבחון מדויק של מצב זה. קולטן NMDA הוא יון ערוץ חלבון מורכב המכיל ארבע subunits, כולל שני חובה NMDA קולטן יחידת משנה 1 (NR1), אחד או שניים קולטן NMDA 2A יחידה משנית (NR2A), 2B יחידת משנה של קולטן NMDA (NR2B), יחידת משנה של קולטן NMDA 2C (NR2C), או קולטן NMDA יחידת משנה 2D (NR2D). Epitope של נוגדן anti-NMDA הקולטן עצמי נמסר להיות נוכח בכל תחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR1 של קולטן NMDA. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה מבוססת-תא immunofluorescence יכול לשמש כבדיקת סינון כדי לזהות הנוכחות של עצמיים נגד NR1 יחידת משנה של קולטן NMDA בדם כדי להקל על מחקר קליני ובסיסי של דלקת אוטואימונית קולטן אנטי-NMDA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA הינה ישות לאחרונה המחלה יכולה להתרחש אצל חולים בכל הגילאים, והוא משפיע בעיקר המטופלות1,2. . זה אחד אנצפליטיס מאובחנים לעתים קרובות ביותר בקרב מטופלים עם אטיולוגיה לא ידועה הראשונית של דלקת קרום המוח3 החולים מושפעים עם אנטי-NMDA קולטן אנצפליטיס בדרך כלל יש prodromal סימפטומים של כאב או חום, ואחריו התפתחות מהירה של התודעה רמת השינוי ומגוון רחב של סימפטומים מנוטלי חריפה, כולל עצבנות, רגזנות , חרדה, נדודי שינה, הזיות, אשליות, תוקפנות, התנהגויות מוזרות, הפרעות התנועה, dysregulation אוטונומי, ותפיסה תוקף4,5. זיהוי מוקדם של תנאי זה במועד טיפול עם חיסוני חשובים תוצאה טובה יותר, החלמה מלאה אפילו חולים מושפעת6. לפיכך, הוא הציע כי דלקת אוטואימונית של קולטן אנטי-NMDA צריך להיחשב אבחנה מבדלת חשוב מהחולים בדלקת חריפה או התפרצות חדשה תכונות פסיכוטיות7,8.

מלבד תכונות קליני, זיהוי של נוגדן עצמי נגד קולטן NMDA דם או נוזל מוחי-שדרתי חיונית לאבחון מדויק של אנטי-NMDA קולטן דלקת אוטואימונית9. רוב הבדיקות אימונולוגי כדי לזהות את נוגדן עצמי קולטן NMDA נגד זמינים כמה מחקר מעבדות10,11, ויש אחד בלבד זמינים מסחרית מבוססת-תא immunofluorescence assay להקרנה אנטי-NMDA קולטן עצמיים12. מטרתו של מחקר זה היא לפתח וזמינותו פשוטה ללא צורך במיקור חוץ immunofluorescence מבוססת תא בנוחות ניתן במעבדה למסך את הנוכחות של אנטי-NMDA עצמיים קולטן כדי לקדם את המחקר הקליני של קולטן NMDA-נגד דלקת אוטואימונית. קולטן NMDA הוא heterotetramer יון ערוץ חלבון מורכב הביעו במפורש במוח. הוא עשוי שתי subunits NR1 חובה, ואת השילוב של subunits אחד או שניים של NR2A, NR2B, NR2C או NR2D13. מחקר קודם דיווחו כי epitope הראשי ממוקד על ידי הנוגדנים התחום N-מסוף חוץ-תאי של יחידת משנה NR15. לפיכך, ב פרוטוקול זה, אנו מבטאים את החלבון NR1-יחידת משנה רקומביננטי האנושי של קולטן NMDA מתויג עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשורת תאים אפיתל כליות עובריים אנושיים (HEK293), ולפתח assay מבוססת-תא immunofluorescence כדי לזהות מחלקת IgG של אנטי-NMDA קולטן עצמיים בדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה לוח של צ'אנג קונג ממוריאל החולים לפי Linkuo, שוויץ (102-2577A3).

1. הכנת פלסמיד ביטוי NR1-GFP

  1. מיקס 10 ng של NR1-GFP פלסמיד עם 100 µL של זן תאים המוסמכת Escherichia coli DH5α ב mL 1.5 סטרילי צנטריפוגה שפופרת, pipet התערובת בעדינות למעלה ולמטה בעיות 4 - 6 פעמים, דגירה הצינור על קרח למשך 20 דקות.
  2. דגירה הצינור ב 42 ° C עבור 1 דקות באמבט מים, להסיר את הצינור לאמבט מים, להוסיף 1 מ"ל lysogeny מרק (LB) בינוני לתוך הצינור, דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות לשעה.
  3. להפיץ את µL 50 של התערובת על צלחת אגר LB המכיל אמפיצילין (0.1 mg/mL), דגירה של צלחת אגר LB ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור בן לילה.
  4. לבחור מושבה בודדת מהצלחת לילה LB אגר באמצעות טיפ סטרילי, ו מערבולת הטיפ ב צינור התרבות חיידקי המכיל 5 מ ל LB בינונית, אמפיצילין (0.1 mg/mL). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור ברעידות בן לילה.
  5. Aliquot 3 מ"ל של התרבות חיידקי לילה לתוך בקבוקון 500 מ"ל המכיל 250 מ ל LB סטרילי בינוני אמפיצילין (0.1 mg/mL). דגירה. הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות. לבדוק באופן קבוע את צפיפות סיב אופטי (OD) של התרבות חיידקי-גל של 600 nm באמצעות ספקטרומטר עד OD600 מגיע 0.6-1.0.
    הערה: מערבבים היטב 800 µL של התרבות חיידקי לילה עם 200 גליצרול µL להכין את המניה גליצרול, ולאחסן את המניה גליצרול תחת-80 ° C לשימוש עתידי.
  6. להכין NR1-GFP פלסמיד ביטוי מן התרבות חיידקי 250 מ
    1. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C.
    2. Resuspend בגדר חיידקים 10 מ"ל resuspension מאגר המכיל RNase A; מערבולת ביסודיות עד סבך לא נתפסת.
    3. להוסיף 10 מ ל מאגר פירוק המתלה חיידקי בעדינות להפוך את התערובת 4 - 6 פעמים, דגירה lysate בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.
    4. להוסיף 10 מ ל משקעים טרום מקורר מאגר lysate, היפוך בעדינות את התערובת 4 - 6 פעמים.
    5. שופכים את lysate לתוך החבית של מחסנית מסנן עם הכיפה על; לחכות 10 דקות ב- RT.
    6. להסיר את הכובע של הצינור לשקע מחסנית הכנס פומפה לתוך הדיו, לחץ בעדינות על הבוכנה. לאסוף את המסוננות lysate לתוך צינור 50 מ ל.
    7. להוסיף 2.5 מ ל קניינית מאגר מהיצרן כדי המסוננת lysate, לערבב את התערובת על ידי היפוך הצינורית כ 10 פעמים, דגירה התערובת בקירור למשך 30 דקות.
    8. החל את התערובת lysate מסוננים עמודה מסנן זה היה מראש equilibrated עם 10 מ"ל equilibration מאגר. לאפשר את העמודה לנקז חוק המשיכה.
    9. לשטוף את העמודה עם מאגר לשטוף 30 מ ל פעמיים, ולאחר מכן elute DNA מן העמודה באמצעות מאגר • תנאי 15 מ"ל.
    10. להוסיף אלכוהול איזופרופיל 10.5 מ ל (0.7 כרכים) מאגר ה-DNA eluted, מערבבים היטב, וכן centrifuge את התערובת ב g x 20,000 למשך 30 דקות ב 4 º C.
    11. Decant את תגובת שיקוע בקפידה בגדר DNA עם אתנול 70% ללא אנדוטוקסין מ ל פעם אחת, וקונטה צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 10 דקות.
    12. Decant את תגובת שיקוע, מתייבשים בגדר למשך 5-10 דקות בשכונה כימי, להמיס בגדר ב- 300-500 µL אנדוטוקסין ללא מאגר.
    13. לקבוע את הריכוז פלסמיד על ידי מדידת ספיגת הפתרון ב UV 260/280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים.
      הערה: להכין את הביטוי פלסמיד GFP שימוש באותו הפרוטוקול.

2. תקנים של תאים HEK293 עם NR1-GFP ביטוי פלסמיד

  1. Aliquot µL 200, ג'לטין 2% לפתרון אחד טוב של צלחת התרבות 48-ובכן, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
  2. האחות הפתרון ג'לטין מתאי 5 x 104 HEK293 היטב, הזרע ב 200 µL בינוני התרבות התא המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) כל היטב. דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה humidified שסופק עם 5% CO2 בן לילה.
    הערה: תאים נספרו באמצעות של hemocytometer.
  3. ביום הבא, להחליף את המדיום תרבות בילה µL 200 טרי בינוני תרבות המכיל 10% FBS לכל טוב.
  4. עבור כל יחידה, להכין פתרון A על ידי ערבוב 100 ננוגרם של פלסמיד NR1-tGFP עם 20 µL תרבות בינוני, פתרון B על ידי ערבוב 0.8 ריאגנט תרביות תאים µL 20 µL תרבות בינונית. הכפל את מספר בארות דרושים כדי להכין את הנפח הכולל עבור כל ניסוי.
  5. להכין פתרון C על ידי ערבוב פתרון A ו- B פתרון, דגירה התערובת ב RT למשך 20-30 דקות.
  6. Aliquot µL 40 לפתרון C כל טוב המכילה תאי HEK293, מערבולת את הצלחת בעדינות, דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס חממה humidified שסופק עם 5% CO2 בן לילה.
  7. בדוק את הביטוי של NR1-GFP חלבון רקומביננטי בתאי המארח במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם 40 X-200 X הגדלה (עירור/פליטה: 482/502 nm), והמשך וזמינותו מבוססת-תא immunofluorescence.
    הערה: Transfect את פלסמיד ביטוי GFP לתוך התאים HEK293 תוך שימוש באותו הפרוטוקול.

3. מבוססת-תא Immunofluorescence Assay

  1. האחות המדיום בילה מן הבארות, ואז תשטוף בכל טוב עם µL 200 של פוספט buffered מלוחים (PBS) שלוש פעמים.
  2. להוסיף 200 µL של 4% paraformaldehyde פתרון כל טוב; דגירה את הצלחת ב RT למשך 15 דקות.
  3. האחות הפתרון paraformaldehyde מן הבארות, ולשטוף את כל טוב עם µL 200 ל- PBS שלוש פעמים.
  4. להוסיף 200 µL של חלב רזה 10% ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS) פתרון אחד טוב, דגירה את הצלחת ב RT עבור h 1 ברעידות עדין.
  5. האחות של חלב רזה 10% הפתרון PBST מן הבאר, ולאחר מכן לשטוף פעם הבארות עם 200 µL PBST.
  6. דגירה הבארות עם פלזמה מדולל (בטחונות ב PBST) כמו נוגדן ראשוני עם טלטול עדין-RT לשעה.
    הערה: פלזמה מתקבל מהדם של חולים החשודים יש דלקת אוטואימונית.
  7. האחות פלזמה מדולל מן הבארות, ולשטוף כל טוב עם 200 µL של PBST שלוש פעמים.
  8. להוסיף 200 µL של עז בן אנוש אנטי איג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 (1:1, 000 דילול ב- PBST) כדי מכל קידוח, דגירה לצלחת תרבות ב RT עם טלטול עדין לשעה.
  9. תשאף עז האנושי אנטי איג מצומדת עם אלקסה עבור חיל הים 594 פתרון, ולשטוף כל טוב עם 200 µL של PBST שלוש פעמים.
  10. להוסיף 100 µL גליצרול פתרון (50% גליצרול PBS, כוללות של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)) כל טוב.
  11. לצפות, תמונה התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות 10 X עינית, ו- 4 X 10 X, 20 X מטרות.
    הערה: השתמש במסנן המתאים עבור כל צבע: עבור NR1-GFP (עירור/פליטה = 482/502 nm), עבור אלקסה עבור חיל הים 594 (עירור/פליטה = 561/594 nm), עבור דאפי (עירור/פליטה = 358/461 ננומטר). לנהל את הפקד שליליים באמצעות התאים HEK לבטא GFP באותה דרך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בממוצע, אנחנו יכולים להשיג 200-300 µg ביטוי נטולת אנדוטוקסין פלסמיד NR1-GFP GFP מתרבות חיידקי 250 מ ל ביצוע הפרוצדורות המתוארות בסעיף 1 של הפרוטוקול. כמות של 100 ng/טוב של פלסמיד הביטוי שימשה תרביות תאים של תאי HEK293 תרבותי בצלחת 48-ובכן, כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. h 24-30 לאחר תרביות תאים, התאים הביע את NR1-GFP, חומרים GFP עשוי לזהות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 1A מציג את התמונה של התאים מארח לבטא את NR1-GFP, בעוד דמות 1D מר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר מבוססת תא אימונולוגי מבחני למסך את הנוכחות של עצמיים כנגד קולטן NMDA שדווחו בספרות, כולל חיים מבוססת-תא immunofluorescence assay11, קבוע מבוססת-תא immunofluorescence assay9 , ואת וזמינותו מבוססי cytometry זרימה14. וזמינותו immunofluorescence מבוססת תא חי יש לבצעו מיד לאחר ההכנה של תאים ectopically לבטא את החלבון NR1, בזמן וזמינותו מבוססי cytometry זרימה דורש צוות מיומן וציוד מיוחד. Assay קבוע מבוססת-תא immunofluorescence הוא assay יותר נוח ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי צ'נג קונג רפואי קרן (גרנט מספר CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ו- CMRPG3E0633).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GRIN1 (מתויג GFP) - קולטן גלוטמט אנושי, יונוטרופי, N-מתיל D-אספרטט 1 (GRIN1), גרסת תעתיק NR1-1Origene (רוקוויל, מרילנד, ארה"ב)RG219368שיבוט NR1-cDNA מתויג עם רצפי tGFP C-terminal
pCMV6-AC-GFPOrigene (רוקוויל, מרילנד, ארה"ב)PS100010וקטור יונקים עם תג tGFP מסוף C
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen (הילדן, גרמניה)12362
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב)11668-019
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניתרמו פישר31985-070
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטתרמו פישר11995-065
סרום בקר עוברי מאופיין, מקור ארה"בGE Healthcare מדעי החייםSH30071.01
נוגדן משני IgG (H+L) אנטי-אנושי עיזים, Alexa Fluor 594 מצומדThermo FisherA-11014
בקרה חיובית: קולטן אנטי-גלוטמט (סוג NMDA)Euroimmun AG, Lü beck, גרמניהCA 112D-0101
Euroimmun Assay Kit

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
  2. Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
  3. Pruss, H., et al. Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin. Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).
  4. Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. Autoimmune encephalopathies. Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).
  5. Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).
  6. Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).
  7. Chapman, M. R., Vause, H. E. Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment. Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).
  8. Gable, M., Glaser, C. Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project. Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).
  9. Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis. Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).
  10. Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).
  11. Irani, S. R., et al. N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes. Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).
  12. Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay. Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).
  13. Mayer, M. L. Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes. Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).
  14. Ramberger, M., et al. Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay. PLoS One. 10 (3), e0122037(2015).
  15. Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis. J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).
  16. Dahm, L., et al. Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease. Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).
  17. Jézéquel, J., et al. Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project. Biol Psychiatry. , (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HEK293NR1 GFPPBSTGlycerol DAPI

מאמרים קשורים