השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

סיכום

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

תקציר

אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי), בשלב מאוחר של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש מאופיין על ידי אובדן הפיגמנט ברשתית אפיתל (RPE) השכבה, מה שמוביל ניוון עוקבות של מבנים חיוניים ברשתית (למשל, photoreceptors) גורם ליקוי ראייה חמור. באופן דומה, RPE- ואובדן של ירידה חדות הראייה נתפסת ב מעקב ארוך טווח למעלה של חולים עם מתקדמות הקשורות לגיל ניוון מקולרי רטוב (AMD) טיפול אנטי-כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF) intravitreal. לכן, מצד אחד, זה היסוד להפיק ביעילות תאי RPE ממקור בלתי מוגבל העשויה לשמש כטיפול חלופי. מצד שני, זה חשוב להעריך את התנהגות ושילוב של התאים נגזר במודל של המחלה פרוגרמה כירורגי, שיטות הדמיה כמו קרוב ככל האפשר לאלה חלה אצל בני אדם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המבוסס על פרסומים קודמים המתארת את הדור של דגם פרה של GA באמצעות העין ארנב לבקן, עבור הערכה של תאי גזע עובריים אדם נגזר בתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (hESC-RPE) ב ההגדרה הרלוונטית קלינית. HESC הבדיל-RPE מושתלים לתוך העיניים תמים או עיניים עם NaIO₃-induced GA כמו ניוון הרשתית בטכניקה 25 גרם transvitreal pars plana. הערכה של אזורי מנוונת המושתלים מתבצע על ידי עם מודאלים מרובים ברזולוציה גבוהה הדמיה בזמן אמת לא פולשנית.

מבוא

פרוטוקול זה מתאר את הדור של דגם פרה עם עיניים גדולות של אטרופיה גיאוגרפית (ג'י אי) המאפשר את ההערכה של אינטגרציה של hESC-RPE המושתלים במרחב subretinal. השתמשו בשיטות המתוארות כאן בפירוט בפרסומים האחרונים 3 הממחישים את הייצור של אוכלוסיה מועשר, טהור, פונקציונלי תאי RPE hESC¹, כמו גם היצירה של נזק הרשתית החיצונית הפנוטיפ GA דמוי המושרה על ידי הזרקה subretinal של פתרונות מלח הפיזיולוגיות (קרי, BSS ו- PBS) או NaIO₃ הארנב עיניים^2,3. אנחנו עוד הוכיח כי ההשעיה תת ברשתית השתלות של hESC-RPE טופס monolayers תפקודית מקיפה עם קולט אור הצלה קיבולת².

מספר יתרונות מלווים את השימוש של העין ארנב לדור של דגם GA של המחלה. קודם כל, הגודל של העין ארנב, אשר הוא 70% הנפח של עין אנושיים בוגרים, מאפשר השתלת משמעותיים קלינית באמצעות צפיפות התאים כי הוא נמוך בהרבה מאשר בשימוש שגרתי עיניים קטנות מכרסמים (1,000 תאים/µL נ' 50,000 תאים/µL)^{4 , 5}. שנית, ניתוח בחולדות הוא בדרך כלל transscleral דרך דמית, אשר פוגעת המכשול ברשתית, שעשוי להיות מפעיל לתגובה דלקתית, דחייה אפשרית⁶. שני גורמים ביחד עלול להוביל multilayering הצליעה של התאים המושתלים, ושילוב כללי ירוד של התאים המושתלים ברקמת הרשתית יליד שיבשו. עם זאת, המודל ארנב גדול-עיניים מאפשר ביצוע טכניקה כירורגית עם מכשור זהה להגדרה הקלינית. שלישית, מודל עם עיניים גדולות מאפשרת גם ברזולוציה גבוהה ויוו הדמיה וניטור של התאים המושתלים, הרשתית שמעליה עד זמן^1,2,3. לפיכך, אנו מתארים דגם פרה קליניות הרלוונטיים, חסכוניים שאמורים להיות חלופה אטרקטיבית מכרסמים לכל בעל עניין במחקר של הרשתית נורמלי וחולים ובשטח תת ברשתית.

פרוטוקול

להלן כללי התנהגות בעקבות הנחיות טיפול בבעלי חיים קרולינסקה Instituet. כל הניסויים באמצעות ניו זילנד לבקן ארנבים (טבלה של חומרים) אושרו על ידי ועדת האתיקה בעלי חיים אזוריות (ל"ואסה Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (היתר: להחיות 56/15). השימוש hESC (לא להחיות 2011/745-31/3) ואת העברת מניפולציה של hESC-RPE (לא להחיות 2013/813-31/2) הוא גם בהתאם שבדי החקיקה והתקנות Institutet קרולינסקה, אושרה על ידי (ועדת האתיקה של האדם אזוריים Regionala Etikprövningsnämnden אני שטוקהולם).

1. subretinal הזרקת סודיום יודייט (NaIO₃) למודל חיות גדולות-עיניים

1. עזים ומתנגד בעלי חיים על ידי ניהול שרירית בירך בתערובת של קטמין 35 מ"ג/ק"ג ו 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מלוחים באמצעות מזרק 30 גרם, להתרחב תלמידים עם טיפות העיניים אקטואלי, באמצעות שילוב של 0.75% phenylephrine cyclopentolate ו- 2.5%. ההרדמה המתאים הוא אישר אם החיה לא מגיבים קמצוץ קשה של הרגל האחורית שלה.
2. הצב את הארנב תחת מיקרוסקופ כירורגי עם הראש מול המנתח (איור 1 א'). השתמש מפסק המכסה להסרת קרום העפעפיים, nictitans עם מטלית סטרילי כדי למזער את הסיכון של זיהום. שימוש מאוזן תמיסת מלח (BSS) כדי למנוע יובש תחת הרדמה בשתי העיניים.
3. למיקרו, להשתמש 2-יציאה (או 3 אופציונלי-port) 25 גרם transvitreal pars plana טכניקה עם trocars שאינם valved עבור החדרת מכשירים השתלה (איור 1B). המכונה vitrectomy רב-תכליתית יש יציאות לחיבור של אינפוזיה בצינורית, endoillumination, vitrector ו endolaser. לזריקות subretinal, רק endoillumination הוא חובה, מה שהופך את מלכודת 2 פורטים מספיקות. להוסיף את endoillumation דרך הנקז השמאלי העליון ומשתמשים את הנקז נכון העליון הצינורית הזרקת subretinal.
   1. תרגיל 3-port, להשתמש את הנקז הזמני נמוך יותר עבור הצינורית אינפוזיה BSS. אם כלי אופציונלי (כגון vitrector) הם בשימוש, הוסף אותם דרך הנקז נכון העליון.
   2. להוסיף את trocars העליון 2, 1-2 מ מ לימבוס בעזרת מלקחיים שנחטף ייזרק תפוס, תחסיר לחמית המכסים את האתר ההכנסה.
   3. ודא trocars הם transsclerally שנוסף בזווית 30-45° לימבוס מקבילים, והמשך לאמצע קצה הנקז. לאחר מכן הפעל את הנקז 90°, להתקדם לתוך העין, מכוון העמוד האחורי של העין. הליך זה למנוע זליגות sclerotomies לאחר ניתוח, גם להקטין את הסיכון של endophthalmitis (קרי, זיהום חיידקי בעיניים). ראה גם איור 2B למשרות הנקז.
   4. לשים עדשות מגע שטוח שימוש אחד על הקרנית להמחיש הרשתית, עם דמעות סינתטיים כמו ג'ל ליצירת קשר בין העין של עדשות מגע (איור 1 א').
   5. צייר µL 500 של NaIO₃ לתוך מזרק 1 מ"ל מחובר צינור סיומת (המופעלים על-ידי המסייע) בצינורית polytip של 38 גרם (מופעל על ידי המנתח).
   6. הכנס את המכשיר endoillumination דרך הנקז השמאלי העליון את הצינורית הזרקה דרך הנקז נכון העליון ולקדם את הצינורית דרך החלל בזגוגית לכיוון הרשתית, מכוון האזור מתחת ראש עצב הראייה.
   7. לאפשר את קצה הצינורית לאט לגעת הרשתית עד מסגיר מוחלט מוקד יהיה גלוי. הזריקה עצמה יחדור הרשתית, המאפשר משלוח subretinal. אל תתנו את הצינורית לחדור הרשתית, שכן הדבר עלול לגרום דימום.
   8. מזריקים µL 50 NaIO₃ subretinally על פני תקופה s 5. מאז יש מטוס המחשוף טבעי בין הרשתית דמית הבסיסית, bleb שקוף למחצה נראה בבירור יוצרות בהדרגה במהלך ההזרקה.
   9. במהלך ההזרקה לאט. משכי את המחט, אך לוודא שהטיפ נשמר בתוך bleb למזער ריפלוקס.
   10. לאחר הסרת הצינורית endoillumation, הזרקת, להסיר את trocars באמצעות מלקחיים שנחטף ייזרק ולהחיל לחץ קל ב-30 s sclerotomies עצמית איטום התפר-פחות משתמש הקצה או הצד הקהה של המלקחיים.
4. Post-surgically לתת 10 מ"ל של תמיסת מלח subcutaneously כדי למנוע התייבשות. לא נותנים סטרואידים אקטואלי לאחר ניתוח או אנטיביוטיקה. משככי כאבים לתת 0.5 מ של הבופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"ל subcutaneously אחרי הניתוח, כמו גם היום לאחר הניתוח.
5. לאחר השימוש, לשטוף את כל הכלים במועט אותם לכמה שניות ראשית ב-70% אתנול, שנית ב- 45% אתנול, ואת לבסוף ב מים מזוקקים. יבש אותם כראוי עם מגבת נייר.
6. להשתתף חיות עד להכרה מספקת למקם אותם כל אחד encaged. אם יש צורך (למשל, למטרות אימונוהיסטוכימיה), המתת חסד בבעלי חיים על ידי ורידיות פנטוברביטל 100 מ"ג/ק"ג (ראה טבלה של חומרים).
7. לחכות 7 ימים כדי להמשיך השתלת תאי hESC-RPE.

2. subretinal השתלת תאי hESC-RPE אצל מטופלים בעלי חיים

1. ניהול 2 מ ג (100 µL) של intravitreal triamcinolone בבעלי חיים ומורדמת באמצעות מחט ההזרקה 30 g להוסיף 1-2 מ מ לימבוס ברביע התחתון באונה 1 שבוע לפני השתלת של hESC-RPE ולאחר מחדש לנהל אותו כל 3 חודשים. ודא כי נקודת הקצה לכיוון הקוטב האחורי של העין כדי למנוע מגע עדשה.
2. תרבות של טפט hESC-RPE כפי שתואר לעיל¹.
3. להסיר תא בידול מדיה (ראה טבלה של חומרים) של טפט hESC confluent 24-ובכן-RPE ולשטוף כל טוב עם µL 500 ל- PBS ללא Ca^{2 +} ו- Mg^{2 +}. חזור על פעולה זו פעם נוספת, עבור סכום כולל של 2 שוטף.
4. למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 500 µL של טריפסין לכל טוב ולאחר תקופת דגירה של 12 דקות ב 37 º C.
5. להטות את הצלחת, הסר בזהירות טריפסין (תאים צריכים להישאר מחובר לצלחת). לאסוף תאים µL 800 אמצעי בידול prewarmed טריים-37 מעלות צלזיוס על ידי עדינה pipetting, או אפילו גירוד בעת הצורך, כדי לקבל השעיה תא בודד.
   הערה: השתמש מסננת תא 40 µm אם התא גושים שנצפו.
6. ספירת תאים בתוך תא hemocytometer באמצעות 0.2% Trypan כחול, על פי הוראות היצרן.
7. הוסף 5 מ של התמיינות תאים מדיה וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר, 300 גרם x במשך 5 דקות.
8. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב טרי לעקר מסנן PBS (עברו דרך מסנן מזרק 25 מ מ) כדי ריכוז סופי של תאים 1000/µL.
9. Aliquot התליה תא הקודם לתוך 600 µL aliquots ולשמור בקירור עד, במהלך הניתוח.
10. עזים ומתנגד בעלי חיים על ידי ניהול שרירית בירך בתערובת של 35 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 5 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים מלוחים באמצעות מזרק 30 גרם. אני תלמידים עם טיפות העיניים אקטואלי באמצעות amix של 0.75% cyclopentolate ו- 2.5% phenylephrine... ההרדמה המתאים הוא אישר אם החיה לא מגיבים קמצוץ קשה ברגל האחורית שלה.
11. הצב את הארנב עם הראש מול המנתח. השתמש מפסק המכסה להסרת קרום העפעפיים, nictitans עם מטלית סטרילי כדי למזער את הסיכון של זיהום. השתמש BSS למניעת יובש תחת הרדמה בשתי העיניים.
12. למיקרו, להשתמש 2-יציאה (או 3 אופציונלי-port) 25 גרם transvitreal pars plana טכניקה עם trocars להציב באותן משרות כפי שמתואר בשלב 1.3 ובאיור 2. אם sclerotomies הקודם גלויים, לבצע הנקז הכניסה רק בסמוך, ולא דרך אלה, כדי למזער את הסיכון של זליגת לאחר הניתוח.
    1. לשים עדשות מגע שטוח שימוש אחד על הקרנית להמחיש הרשתית, עם דמעות סינתטיים כמו הג'ל הקשר בין העין של עדשות מגע (איור 1 א').
    2. לאחר עצה נכונה מיצוב (ראה שלבים 1.3.5 ו 1.3.6), להזריק subretinally µL 50 של השעיה לערבב בעדינות hESC-RPE (50,000 תאים). המטרה של המרכז של אזור₃ pretreated NaIO מאופיינת רפלקס אופייני "מתכתי" אנדו-תאורה. הרשתית neurosensory צריך להפריד בקלות ליצור bleb בבירור. סומק שהמחט סטרילית H₂O בין ארנבים/לאחר השימוש כדי למנוע המחט סתימת עקב תא קיבוץ. שינוי המחט בעת סתימת הוא הבחין.
    3. במהלך ההזרקה לאט. משכי את המחט אבל לוודא שהטיפ נשמר בתוך bleb למזער ריפלוקס.
    4. לאחר הסרת הצינורית endoillumation, הזרקת, להסיר את trocars באמצעות מלקחיים שנחטף ייזרק ולהחיל לחץ קל ב-30 s sclerotomies עצמית איטום התפר-פחות משתמש הקצה או הצד הקהה של המלקחיים.
13. Post-surgically לתת 10 מ"ל של תמיסת מלח subcutaneously כדי למנוע התייבשות. לא נותנים סטרואידים אקטואלי לאחר ניתוח או אנטיביוטיקה. משככי כאבים לתת 0.5 מ של הבופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"ל subcutaneously אחרי הניתוח, כמו גם היום לאחר הניתוח.
14. לאחר השימוש, לשטוף את כל הכלים במועט אותם לכמה שניות, ראשית ב-70% אתנול, שנית ב- 45% אתנול, ואת לבסוף ב מים מזוקקים. יבש אותם כראוי עם מגבת נייר.
15. להשתתף חיות עד להכרה מספקת למקם אותם כל אחד encaged. אם יש צורך (למשל למטרות אימונוהיסטוכימיה), המתת חסד בבעלי חיים על ידי ורידיות פנטוברביטל 100 מ"ג/ק"ג.

3. in Vivo רשתית והדמיה Subretinal

1. השתמש בהתקן טומוגרפיה (SD-אוקטובר) בתחום ספקטרלי אופטית קוהרנטית עם התוכנה הנלווית (ראה טבלה של חומרים) כדי להשיג את חתך הרוחב b סריקות של מטופלים בעלי החיים, על פי הוראות היצרן. כדי למנוע טשטוש תמונה, הקפד לשמור על לחות הקרנית על ידי שטיפה בתמיסת אקטואלי כל s 30-60.
   1. מקום החיות ומורדמת ומורחבים תלמידו (ראה שלבים 1.1 ו- 2.10) הר מתכווננת להשיג נתיב פתוח של מקור האור כלי ברשתית ארנב.
   2. להשיג לפחות 3 סריקות OCT עם בו זמנית ophthalmoscopy לייזר אינפרא אדום-קונפוקלי סריקה (IR-cSLO) השתקפות הפניה תמונות המייצגות את החלק, מרכזי, העליונים והתחתונים של האזור מוזרק.
   3. להשיג en-פרצוף הפונדוס בתמונות עם cSLO כחול, ירוק, אינפרא אדום ו ססגוניות לייזר השתקפות (קרי, מספר צבעים לייזר בו זמנית), בהתאמה.
   4. לכידת תמונות autofluorescence אור כחול (BAF) באמצעות היכולת לייזר אור כחול של המכשיר SD-אוקטובר.

תוצאות

נציג ויוו תמונות של BAF, IR-cSLO ו- SD-אוקטובר של הרשתית ארנב רגיל לבקן מוצגים באיור2. שימו לב לשכבות הרשתית השונות עם רמות ייחודי של השתקפות אור שנתפסו על ידי המכשיר SD-אוקטובר.

דמויות 1A , איור 1B, מודגם ההתקנה כדי ליצור תת ברשתית מגדלים פורחים: מפסק המכסה ממוקם, העמדת בעפעפיים כדי לאפשר החדרת 3 trocars (איור...

דיון

ב פרוטוקול זה, מתואר הדור של מודל גדול-עיניים של GA ושימוש בו פרה להערכת hESC-RPE אינטגרציה ויוו .

לתרגום של טיפולים משובי עבור GA ומחלות קשורות לתוך המרפאה⁷, חשוב לפתח, לייעל שיטות בנאמנות ללכוד שיטות קליניות השתלת והדמיה. הארנב הוא בהיבט הזה אטרקטיבי: יש לו עין גדולה יחסית המאפשר ניתוח תוך עיני ושימוש הדמיה רגיל, בקלות שוכנו וזול לעומת חיות גדולות-עיניים אחרות.

אנו מתארים את השימוש transvitreal תקן 25-מד pars plana vitrectomy טכניק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום בידול NutriStem hESC XF – bFGF ו- – TGFb	תעשיות ביולוגיות	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS ללא Ca2+ ו-Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
מסננת תאים 40 μ m ניילון	VWR	732-2757
מחט 30 גרם 0.5 אינץ' ’; 0.3 מ"מ x 13 מ"מ	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 מ"מ מסנן מזרק	Acrodisc	PN4612
0.4% טריפאן כחול	ThermoFisher Scientific Corp		15250061 שימוש ב-0.2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% אתנול	Solveco AB	1047
קטמינול, 100 מ"ג/מ"ל	Intervet, Boxmeer	511519	השתמש ב-35 מ"ג/ק"ג קטמין
רומפון וטרינר, 20 מ"ג/מ"ל	Bayer Animal Health	22545	השתמש ב-5 מ"ג/ק"ג קסילזין
טריסנציה, 40 מ"ג/מ"ל	אלקון נורדי A/S	412915	2 מ"ג
ציקלופנטולאט-פנילפרין תוך-זגוגית, 0.75% + 2.5%	APL	321968	יש להשתמש בטיפה אחת בכל עין
Viscotears	Laboratoires Thé תמיסת
	Apotea AB	7053249369080
וטרינר Allfatal 100 מ"ג/מ"ל	Omnidea	77168	השתמש בצינור הארכה פנטוברביטלי 100 מ"ג/מ"ל
(פטיש)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G צינורית תת-רשתית פוליטיפ	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
לשימוש חד פעמי עדשה	שטוחה Volk
Barraquer Colibri מפסק מכסה	AgnTho's AB	42-020-030
מכנסיים ללא שסתומים	Alcon Nordic A/S	8065751448
מלקחיים עם טפרים	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS מכונת ויטרקטומיה	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
מכשיר SD-OCT	היידלברג	ספקטרליס הנדסי HRA+OCT	השתמש ב-Heidelberg Eye Explorer גרסה 1.9.10.0
24 לוחות באר	Sarstedt	83.3922
נויבאואר המוציטומטר	VWR	631-0925
ארנבים לבקנים ניו זילנדיים	Lidkö pings Rabbit Farm, שוודיה
		hESC-RPE	ראה מספר סימוכין 1
Buprenodale Vet, 0.3 מ"ג/מ"ל	Dechra	660500	השתמש ב-0.5 מ"ל בופרנורפין תת עורי