הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56712

⸱

13 בינואר 2018

 ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Würzburg, 2Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים הנועד במבחנה דגם chorioallantoic מצורף, בשלב הראשון של היווצרות השליה. הפרוטוקול מדגים התרבות לנתיחה, explant של allantoides מאתר על קיבוע α4β1 אינטגרין. קובץ מצורף allantois מוערך ברמה המיקרוסקופית בנקודות זמן שנקבע מראש.

תקציר

השליה היא חיונית עבור הצמיחה וההתפתחות של עוברי יונקים. מסיבה זו, רבים שינויים גנטיים ועלבונות סביר גם סביבתי זה להפריע התפתחות השליה או לפונקציה יכול לגרום לאבדן הריון מוקדם בעכברים ובבני אדם. למרות זאת, פשוט במבחנה מבחני על המסך עבור תופעות אפשריות על היווצרות השליה חסרים. כאן, אנו מתמקדים מידול הצעד הראשון וקריטיים היווצרות השליה, אשר מורכב הקובץ המצורף של allantois chorion. אנו מתארים שיטה להעריך במהירות את הקובץ המצורף של explants allantoic על α4β1 קיבוע אינטגרין, המשמש מצע chorio-מימטי. גישה זו במבחנה מאפשרת הערכה איכותית של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובים בנקודות זמן שונות ברציפות. הפרוטוקול עשוי לשמש כדי לחקור את ההשפעה של העכבר יישוב מוטציות, סמים או גורמים סביבתיים שונים, אשר קושרו הריון סיבוכים או אובדן העובר על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

מבוא

השליה היא הכרחית לצמיחה עובריים ופיתוח בסביבת הרחם. היא מהווה את הממשק חמצן, מטבוליט של exchange התזונתי בין מחזור הדם העוברי, אימהית, גם פונקציות כמו איבר האנדוקרינית ו. כל עלבון אנדוגני או אקסוגני זה פוגע פיתוח היפרדות יכול להוביל פיגור גדילה תוך רחמי, אובדן עוברית או סיבוכים בהריון, בעכברים והן בני אדם1. בעוד המספר של העכבר יישוב מוטציות הגורמות פיזיולוגיה היפרדות חריג ממשיך לגדול2, עם אחרים 219 שמפורט כרגע באתר מידענות הגנום העכבר (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), שרבים פנוטיפים אלה אינם מובנים היטב מנקודת מבט מכניסטית. בנוסף שינויים גנטיים, מולקולה קטנה סמים, נוגדנים חד-שבטיים, רעלים, פתוגנים, מטבוליטים עודף או סוכנים סביבתיים שונים עלול להשפיע על התפתחות השליה, הפונקציה3,4,5 , 6 , 7. ובכל זאת, פשוט במבחנה assays מודל שלבים קריטיים בפיתוח השליה נדירים.

פיתוח היפרדות מאתר תופעל ב- midgestation מוקדם, כאשר allantois (מבשר התפתחותית של הטבור) מתגלה מהקצה האחורי של העובר ניצן שגדל לעבר chorion8. Chorioadhesive תאים בשכבה החיצונית של ניצן allantoic לתווך את הקובץ המצורף, הפצת allantois על פני השטח של chorion (chorioallantoic "פיוז'ן"). Chorion לאחר מכן מתקפל לתוך villi בו להערכת של allantois גדל כדי ליצור את המבוך, השכבה הפנימית היפרדות איפה מזינים וחמצן מוחלפים בין דם אימהי צמוד juxtaposed sinusoids וכלי עובריים9 ,10.

הקובץ המצורף של allantois chorion השלב הראשוני וקריטיים אינפורמציה במבוך, פגמים בתהליך זה הם בין הגורמים הנפוצים ביותר lethality עובריים midgestation1. למרות מספר מוטציות העכבר תוארו שבו המצורף chorioallantoic נכשל להופיע10, מסד הנתונים MGI כיום רשימות 108 מוטציות העכבר המאופיינת על ידי היתוך chorioallantoic חריג (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), האינטראקציה המערכת בין תא דם אדהזיה מולקולה-1 (VCAM-1, לידי ביטוי את והמזודרם allantoic) לבין אינטגרין α4β1 (לידי ביטוי את mesothelium כוריוני, אשר נגזר והמזודרם extraembryonic) שנראה הכרחי עבור הקובץ המצורף chorioallantoic ופיוז'ן11,12,13. נוגדן כולה-הר פראי-סוג העובר הראו כי VCAM-1 מבוטא בתוך דיסטלי לשני-שליש הקנה allantoic ביום כ עובריים (E) 7.513 (שלב somite 1-4), כי הביטוי שלה נותרת גבוהה במהלך המצורף chorioallantoic - פיוז'ן11,12. כשל מהתופעה allantoic chorion מזוהה בדרך כלל על ידי ניתוח היסטולוגית של הרחם ניצנים. אולם, גדלים allantois הן מבחינה פיזיולוגית מאוד משתנה בין ובתוך אפילו המלטות של אותו שלב התפתחותי14, allantois יכולה רק לצרף chorion מתי זה הגיע בגודל מספיק ליצור מגע גופני. המשקף השתנות טבעי, מצורף chorioallantoic לוקח מקום מתישהו בין ~ E 8.0 ו- E 9.0 בתוך הרחם, הערכה סטטיסטית אמין של תהליך זה על ידי היסטולוגיה היא לפיכך תלויים הניתוח של מספר גדול של conceptuses להשיג מספיק דגימות בשלב ההתפתחותי המתאים.

כאן, אנו מתארים שיטה להערכת המצורף allantoic לשעבר עם רחם זה פחות תלויים בגודל allantois. נדגים את הקרע של העכבר עוברי, allantoides שלהם מ- uteri של עכברים בהריון ~ 8 ימים פוסט coitum (dpc; dpc 0.5 מייעד את הגילוי של פקק הנרתיק), ואת התרבות עוקבות של allantois explants על α4β1 קיבוע אינטגרינים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה, פונקציונלי של הקובץ המצורף והפצת התנהגות של explants allantois מרובות במקביל, בנקודות זמן שונות רצופים. ניתן להשתמש בפרוטוקול למסך על ההשפעות של מוטציות יישוב, סמים או גורמים סביבתיים שונים על allantois קובץ מצורף ex-vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

העכבר הרבייה אושרה על-ידי Regierung Unterfranken ולאחר כל הבדיקות בוצעו בהתאמה קפדנית עם האיחוד האירופי וגרמנית כל החוקים והתקנות החלים לגבי טיפול ושימוש של חיות מעבדה.

1. ציפוי של Microtiter צלחות עם אינטגרין α4β1 לתרבות Explant של הרחם לשעבר Allantois

  1. לשקם את אינטגרין α4β1 מאתר lyophilized-µg/mL 200 בתוך סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לדלל את ריכוז הסופי של µg/mL 10 ב ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) PBS. פיפטה 20 µL/טוב של הפתרון אינטגרין α4β1 מדולל לתוך המספר הנדרש של בארות של צלחת microtiter (1 allantois טוב).
    הערה: למנוע את היווצרות בועות אוויר בעת ציפוי הבארות של צלחת microtiter.
  2. דגירה הלוחות microtiter עבור 60 דקות ב 37 ° C על-ידי הצבתם חממה תרביות רקמה humidified.
  3. בזהירות וארוקן את תגובת שיקוע עם פיפטה. השתמש יניקה עדינה, שיפוע הבסיס כדי להימנע מלגעת התחתון טוב עם קצה פיפטה. לשטוף בארות פעמיים על-ידי הוספת µL 50 ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) תרבות בינוני כמו של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
  4. שלב קריטי: בלוק ללא תשלום מחייב אתרים על-ידי הוספת µL 50/טוב של 0.1% (w/v) אלבומין שור (BSA) / DMEM דגירה עבור ≥ 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הצבת הלוחות microtiter חממה תרביות רקמה humidified.
    הערה: Allantois explants יכול לצרף משטחים שונים בנוכחות סרום. לכן חיוני כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים, לאחר ציפוי הבארות עם אינטגרין, לפני הוספת את allantois גזור עבור explant תרבות סרום המכיל בינוני (ראה שלב 4.4).
  5. שמור הבארות מצופה הפתרון חסימה ב 37 ° C עד הצורך בשלב 4.4.

2. הרחם דיסקציה של עכבר בהריון-Dpc 8

הערה: להפחית את שיעורי ההריון חיובי-false לפי משקל-רווח-אפליה-15.

  1. להקריב את העכבר על-ידי נקע בצוואר הרחם. לחטא את המעיל באזור הבטן על ידי התזה עם אתנול 70% (v/v).
    הערה: ללבוש כפפות בעת טיפול עכברים. המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה מונע זיהום כימי של allantois, אשר עלולים להפריע allantois המצורף.
  2. פתח בעור בטן על ידי ביצוע חתך קטן בקו האמצע עם מספריים. להשתמש האצבעות בכפפה כדי להחזיק את העור מעל ומתחת החתך, להפריד את העור לכיוון החזה ועל הזנב של העכבר.
  3. לתפוס את הצפק עם מלקחיים. עם היד השנייה, לעשות חתך בצורת V מ קדמי לכיוון ישבנה באמצעות מספריים, והזז את הרקמה כדי לחשוף את חלל הבטן. השתמש המלקחיים לדחוף את המעיים לצד אחד על מנת לקבל גישה אל הרחם.
  4. אתר כששתי הקרניים הרחם. להחזיק את צוואר הרחם (מקטע סימטרית) עם מלקחיים וחותכים את הרצועות עם מספריים משובחים. ואז ניתוק שתי קרניים הרחם באמצעות ניתוק של oviducts עם מספריים.
  5. להשתמש מלקחיים כדי להעביר את הרחם לתוך צלחת סטרילי 10 ס מ המכיל סטרילי, PBS בטמפרטורת החדר (RT). להסיר את רקמת שומן, כלי הדם והעצבים המקיפים את הקרניים הרחם עם מלקחיים בסדר ו/או מספריים (איור 1 א').

3. העובר לנתיחה

הערה: בצע את השלבים הבאים תחת stereomicroscope מאובזר עם טווח זום 8:1.

  1. הפרד את העוברים על ידי חיתוך בין האתרים השרשה עם מספריים. רירית הרחם שרירים של בלוטות הרחם עם מלקחיים ומשוך בנפרד כדי לחשוף את רותמי (איור 1B).
  2. באמצעות מלקחיים, להעביר את בלוטות הרחם לתוך תבשיל 10 ס מ חדש המכיל סטרילי, RT PBS.
  3. לתקן את רותמי סביב העובר עם קצות המלקחיים.
  4. אעשה חתך בצד anti-mesometrial של רותמי עם מלקחיים בסדר (איור 1C), לקלף את רותמי עם מלקחיים לחשוף את העובר (איור 1D).
    הערה: mesometrial בציצית רותמי הוא מאוד vascularized והוא יכול להיות רחב בבסיסו יותר החלק anti-mesometrial, אשר מכיל את העובר ומופיע חיוורת.
  5. לנתח את העובר עם מלקחיים (איור 1E, F).
  6. באמצעות מיקרו-כף, להעביר את העובר לתוך טיפה של PBS סטרילי הכלול תבשיל סטרילי 3.5 ס"מ.
  7. להעביר את העובר לתוך טיפת PBS ב- 3.5 ס"מ את אותה המנה באמצעות מיקרו-כף טרי, לנתח את העובר של שק החלמון באמצעות מלקחיים (איור 1 ג'י, H).
  8. לחלופין, אם יש צורך (למשל, עבור genotyping על ידי תגובת שרשרת של פולימראז), להעביר שק החלמון לתוך צינור סטרילי על ידי כ רפה בעברית עם ~ 5 PBS µL לתוך טיפ גדול דיזה 200 µL פיפטה. חנות ב-20 ° C.
    הערה: רקמת אימהי (קרי, שק החלמון הקודקוד כולל הממברנה של רייכהרט והחרוט ectoplacental) עשויים לזהם את ההכנה שק החלמון עשוי להוביל לתוצאות genotyping מוטעים. הסרת רקמות אלו הוא הקל ביותר לפני הקרע העובר מן שק החלמון.

4. allantois לנתיחה והתרבות לשעבר עם רחם על קיבוע α4β1 אינטגרין

  1. חותכים את allantois מאתר הבזליים ההכנסה שלו בקצה האחורי של העובר באמצעות מלקחיים בסדר (איור 1 H).
  2. לחלופין, אם נדרשת היערכות התפתחותית, לספור זוגות somite של העובר על ידי בדיקה חזותית באמצעות מיקרוסקופ מצויד אופטיקה חדות שלב ו 5 × ויעד × 10.
    הערה: ניתן להרחיב את העובר עם מלקחיים כדי להקל על ספירת somite. קובץ מצורף chorioallantoic ופיוז'ן להתרחש בין E 9.0 E 8.0 העוברים עם ≥ 6 somite זוגות. המפנה מתחיל העוברים עם 6-8 somite זוגות.
  3. פיפטה 40 µL/טוב של DMEM בתוספת 10% (v/v) בסרום שור עוברית-גלוטמין, אנטיביוטיקה על המספר הנדרש של microtiter מצופים מראש צלחת וולס (ראה סעיף 1).
  4. לאסוף את allantois צפים על ידי כ רפה בעברית עם ~ 5 PBS µL לתוך דיזה גדול של קצה פיפטה 200 µL. העברת allantois 1/טוב.
  5. דגירה של allantoides על ידי הצבת הלוחות microtiter חממה תרביות רקמה humidified (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) עבור למשל, 6, 12 ו- 24 שעות ביממה. על מנת למנוע הפרעה עם קובץ מצורף allantois, אל תזיז את הצלחות microtiter בין נקודות זמן אלה.
  6. בכל נקודה בזמן, ציון allantois מצורף (לדוגמה, allantois אין קובץ מצורף/צף; allantois באופן חלקי או מלא מצורף; מלא התפשטות allantois) באמצעות מיקרוסקופ מצויד שלב חדות או דיפרנציאלית אופטיקה חדות הפרעות, 5 × או 10 × אובייקטיבי (איור 2).
    הערה: נציג דוגמאות allantoides מבודדים לחלוטין המצורפת טרי מוצגות באיור2. Ex עם רחם, בקצה הדיסטלי של allantoides מבודד wildtype C57BL/6J עכברים מייחסת בתוך 4-6 שעות (זה מכונה החלקי של allantois), והוא מלא מצורף של allantois שלמה הושג בתוך ~ 12 שעות של תרבות. מאת ה' 18-24, explant שיטוח, הניח צורה מעגלית (המכונה כמו במלואם התפשטו allantois) עם CD31-חיוביות וסקולרית פלקסוס9,16.

5. כתמים מאשרות Allantois Explanted על CD31 סמן התא אנדותל

  1. האחות המדיום תרבות של מלא התפשטות explants ולתקן את התאים על-ידי הוספת µL 40/טוב של 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS.
    הערה: Paraformaldehyde הוא רעיל. ללבוש כפפות ומשקפי מגן בטיחות כדי למנוע העור, קשר עין.
  2. תקופת דגירה של 10 דקות-RT, ולאחר מכן וארוקן את תגובת שיקוע. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
  3. Permeabilize התאים לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים על-ידי הוספת µL 40/טוב של 0.1% (v/v) בסרום עז נורמלי טריטון X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (וי/v) ב- PBS למשך 30 דקות בשטיפת RT. פעמיים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS ו להסיר את המדיום הכביסה על ידי יניקה עדינה.
    הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות למשך הלילה בשלב זה.
  4. כתם תאים על-ידי הוספת µL 20/טוב של נוגדנים נגד ראשי-CD31 מדולל 1:50 ב- 0.1% (w/v) BSA/PBS בן לילה ב 4 º C. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
  5. לזהות נוגדנים העיקרי המאוגד על-ידי הוספת µL 20/טוב של נוגדנים אנטי חולדה עם התווית fluorescently עז משני 1:200 מדולל ב- 0.1% (w/v) BSA/PBS עבור h 1 RT. הגן על צלחות microtiter מן האור על ידי גלישת בנייר אלומיניום או על-ידי הצבת בחדר חשוך. לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת µL 40/טוב של PBS, ולהסיר את המדיום כביסה בשאיבה עדינה.
  6. להטביע תאים על-ידי הוספת µL 20/טוב של הרכבה בינונית. תקופת דגירה של ~ 1 h ב- RT עד המדיום הרכבה התחזק. חנות צלחות microtiter ב RT או ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
  7. תמונה מקלעת כלי הדם של allantois explants תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד עם × 5 או 10 × אובייקטיבית, מסנני קרינה פלואורסצנטית מתאימים.
    הערה: להחליפן בתמונות של מקלעת כלי הדם CD31-חיוביים של allantois התפשטה לגמרי מוצגות באיור3. סמנים אחרים עבור מקלעת כלי הדם, כגון נוגדנים מכוונת נגד Flk-1, טיסה, העניבה-1 או 2 העניבה יכול לשמש היטב16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד, explant allantoides מאתר ex-vivo, ומפרט את ההערכה איכותי של הקובץ המצורף allantois α4β1 אינטגרין, תהליך קריטי במהלך ויוו chorioallantoic פיוז'ן. התוצאות נציג באיור איור 1A–H מדגימים את השלבים רצופים של בידוד allantois החל מהרחם בהריון. אימהית רקמות המקיפים את הקרניים הרחם, כגון רקמת שומן וכלי (איור 1 א') מוסרות, העוברים הם גזור מן רירית הרחם אופנה הד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בנוכחות סרום, המהווה מקור עשיר של מולקולות פרו-דבק מטריצה חוץ-תאית כגון fibronectin, allantois explants ייצמד בקלות שונים פלסטיק, זכוכית או מסנן משטחים9,16. לפיכך, אם מטרת וזמינותו שבוצעו היא לחקור באופן ספציפי את האפקט של שינוי גנטי או כל טיפול אחר על הקובץ המצורף allantois מתאושש α4β1, זה קריטי כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים (למשל, עם סרום שור אלבומין) לאחר ציפוי המשטחים עם אינטגרין ולפני המקננת עם סרום המכיל מדיה.

החזק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי SFB688 פתוח דויטשה (ל א).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים מסוג בר C57BL/6Jמס' מלאי מעבדת ג'קסון: 
70% (v/v) אתנולVWR International930031006
מלקחיים בתבנית סטנדרטיתFine Science Tools11000-12מלקחיים המשמשים לפתיחת חלל הבטן.
מלקחיים לניתוח מיקרוכלי מדע עדינים11254-20Dumont # 5 ביולוגיה רפואית עם קצה עדין וחד. 
מספריים משובחים Fine Science Tools14094-11להבים ישרים.
מספריים קפיציות Fine Science Tools15012-12מספריים קפיציים של נויס עם להבים 14 מ"מ לדיסקציה של ניצני הרחם.
מיקרו-כפיתקארל רוטAT18.15 מ"מ קוטר כף.
לוחות מיקרוטיטרibidi81501אנו משתמשים בשקופיות אנגיוגנזה סטריליות לא מצופות (נפח פנימי 50 ומיקרו; L) עם משטח הידרופובי שאינו מטופל בתרבית רקמות כדי להפחית את הלא-α 4β קשירה מתווכת אחת לפלסטיק.
צלחת 10 ס"מNunc150350כלי תרבית רקמות סטריליים.
צלחת 3.5 ס"מNunc150288כלי תרבית רקמות סטריליים.
קצות פיפטות פתח גדולות BiozymVT0140Xקצות פיפטה נמוכים, 200 µL.
α 4β 1 אינטגריןמו"פ D Systems6054-A4עכברי α 4β 1 אינטגרין מבוטא ומטוהר באופן רקומביננטי מקו תאי שחלה של אוגר סיני.
תמיסת מלח פוספט בופר (PBS)Sigma AldrichD8537ללא Ca2+ ו-Mg2+.
דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM)PAN BiotechP04-03600הפורמולה מכילה 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט ו-3.7 גרם/ליטר NaHCO3 אך ללא L-גלוטמין, שמתווסף בנפרד.
פניצילין/סטרפטומיציןGibco (ThermoFisher Scientific)15140-122100 x (10,000 U/mL פניצילין ו-10,000 ומיקרו; g/mL streptomycin) תמיסת מלאי.  הכן ואחסן אליקוטים ב-20 מעלות; C כדי למנוע הקפאה/הפשרה.
L-גלוטמיןPAN BiotechP04-80100100 x (200 מ"מ) פתרון מלאי. הכן ואחסן אליקוטים ב-20 מעלות; C כדי למנוע הקפאה/הפשרה.
סרום בקר עוברי BiochromS 0115אנו משתמשים ב-FBS מומת חום (מחומם ל-56 מעלות; C למשך 30 דקות עם ערבוב כדי לנטרל את המשלים).
אלבומין בסרום בקר (BSA)סיגמא אולדריץ'A7030אנו משתמשים באלבומין נטול פרוטאז וחומצות שומן. הכן פתרון של 0.1% (w/v) ב-DMEM. מסנן סטרילי את התמיסה דרך מסנן תרבית תאים חד פעמי עם 0.22 µ m גודל נקבוביות וממברנה קושרת חלבון נמוכה, ולאחסן את המינון בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
para-פורמלדהידקארל רוט0335.2להכנת תמיסת פורמלדהיד ב-PBS, שקלו אבקת para-formaldehyde במכסה מנוע מאוורר, והוסיפו אותה ל-PBS שחומם מראש לכ-60 מעלות; C בכוס על צלחת ערבוב. הוסף 1 N NaOH טיפתי עד שהתמיסה מתבהרת. יש לתת לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר, ולסנן דרך מזרק מסנן 0.22 מ"מ. התאימו את ה-pH עם HCl מדולל ל-6.9 בקירוב, והתאימו לנפח הסופי עם PBS. אנו מצטטים ומקפיאים את התמיסה, אך ניתן לאחסן אותה גם ב -4 מעלות; C למשך כארבעה שבועות. 
Triton X-100Sigma AldrichX100השתמש בקצות פיפטה רחבות כדי לטפל בטריטון X-100 לא מדולל.
סרום עזים רגילSigma AldrichG9023כדי לחסום קשירה לא ספציפית של נוגדנים בניתוחי אימונופלואורסצנטיות.
α-CD31 נוגדניםBD Biosciences550274נוגדנים חד-שבטיים נגד עכברים מטוהרים, שיבוט MEC 13.3.
נוגדנים משניים נגד חולדות עיזיםThermo FisherA-11006עז נגד חולדות IgG (שרשראות כבדות וקלות), נספג צולב, מסומן פלואורסצנטי עם Alexa Fluor 488. תוויות פלואורסצנטיות אחרות אפשריות גם כן.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381מדיום הרכבה לציטוכימיה. MW ~ 31,000
Labovert לייץלבוברט מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך מצויד במטרה של 4 x ו-10 x לספירת זוגות סומיטים. מיקרוסקופים אחרים לניגודיות פאזה (כגון אלה המשמשים באופן שגרתי בתרבית רקמות) מתאימים גם הם.  
M80Leica MicrosystemsM80סטריאומיקרוסקופ עם טווח זום של 8:1 (מניב הגדלה בין 7.5 x ל-60 x) לדיסקציה של עובר ואלנטואה.
DM4000BLeica MicrosystemsDM4000Bמערכת מיקרוסקופ להיסטולוגיה עם תאורת LED. אנו משתמשים במטרות HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 ו-HC PL FLUOTAR 10 x/0.30. ניתן להשתמש במיקרוסקופים אחרים המצוידים בניגודיות פאזה ואופטיקה פלואורסצנטית כדי להבקיע חיבור אלנטואה.
מצלמה דיגיטליתJVCKY-F75Uמצלמת לכידה דיגיטלית 3-CCD המחוברת למיקרוסקופ LED DM4000B. אנו משתמשים בתוכנת דיסקוס (Hilgers) כדי להפעיל גם את המיקרוסקופ וגם את המצלמה.
מיקרוסקופ קונפוקליLeica MicrosystemsSP5מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר של אנדותל במקלעת כלי הדם של צמחי אלנטואה. תמונות אימונופלואורסצנטיות צולמו עם מטרה של פי 40.
000664 של Dulbecco

מקורות

  1. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).
  2. Segerer, G., et al. An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation. Sci Rep. 6, 35160(2016).
  3. Kane, S. V., Acquah, L. A. Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy. Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).
  4. Xu, X., Vugmeyster, Y. Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics. AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).
  5. Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).
  6. Racicot, K., Mor, G. Risks associated with viral infections during pregnancy. J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).
  7. Grandjean, P., et al. Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives. Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).
  8. Inman, K. E., Downs, K. M. The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus. Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).
  9. Arora, R., Papaioannou, V. E. The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation. Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).
  10. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).
  11. Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development. Development. 121 (2), 549-560 (1995).
  12. Gurtner, G. C., et al. Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation. Genes & development. 9 (1), 1-14 (1995).
  13. Kwee, L., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121 (2), 489-503 (1995).
  14. Downs, K. M., Gardner, R. L. An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated. Development. 121 (2), 407-416 (1995).
  15. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).
  16. Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. Study of the murine allantois by allantoic explants. Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).
  17. Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha. Placenta. 47, 12-23 (2016).
  18. Zeigler, B. M., et al. The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential. Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).
  19. Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. Functional atlas of the integrin adhesome. Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דיסקציה של האלנטואיסאינטגרין אלפא 4 בטא 1עובר עכברהיווצרות שליהמיקרוסקופיית ניגודיות פאזהצביעת CD31קיבוע בפרפורמאלדהידשטיפה ב-PBS
דיסקציה והתרבות Explant של Allantois מאתר לניתוח במבחנה של קובץ מצורף Allantoic
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.