מאמר שיטה

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

DOI:

10.3791/56736

⸱

26 בפברואר 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות התפשטות כרומטין היה בשימוש נרחב כדי להעריך לוקליזציה דינמי של חלבונים שונים במהלך gametogenesis, במיוחד עבור יצירת זרע. טכניקות אלה מאפשרות ויזואליזציה של חלבון ודפוסי לוקליזציה DNA במהלך אירועים meiotic כגון כרומוזום הומולוגי זיווג, synapsis, ה-DNA תיקון. בעוד כמה פרוטוקולים תוארו בספרות, כרומטין כללי התפשטות באמצעות oocytes prophase בתרבית של טכניקות הם מוגבלים וקשה בשל העיתוי של מיוזה חניכה של השחלות עוברית. לשם השוואה, ניתן לאסוף prophase spermatocytes של עכברים זכר לנוער עם תשואות גבוהות ללא צורך microdissection. עם זאת, קשה להשיג אוכלוסיה מסונכרן טהור של תאים בשלבים מסוימים עקב הטרוגניות של אוכלוסיות meiotic, פוסט-meiotic תא הנבט ב בזרמה לנוער ומבוגרים. בשלבים מאוחרים יותר של מיוזה, זה יתרון כדי להעריך oocytes עוברים מיוזה I (MI) או מיוזה II (MII), כי קבוצות של oocytes בוגר יכול להיות שנאסף עכברים נקבה בוגרת מגורה כדי לחדש את המיוזה בתרבות. . הנה, שיטות ההכנות כרומטין meiotic להתפשט באמצעות oocytes גזור מן העובר, neonatal, השחלות למבוגרים מתוארים בליווי הדגמות וידאו. כרומוזום missegregation םיעוריא oocytes יונקים הם בתדירות גבוהה, במיוחד במהלך MI. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך ולאפיין את ההשפעות של מוטציות שונות או חשיפות סביבתיות בשלבים שונים של oogenesis. שכן, ישנם הבדלים ברורים בין oogenesis לבין יצירת זרע מהטכניקות שתוארו בתוך הם לא יסולא בפז כדי להגדיל את ההבנה שלנו של יונקים oogenesis ותכונות dimorphic מינית של דינמיקה כרומוזום וחלבון במהלך המיוזה .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך יצירת זרע, סינכרונית למחצה גלי העלייה הגדולים של meiotic בתאי הנבט במהירות ובאופן רצוף מתחדשות ב בזרמה בתחילת גיל ההתבגרות וברחבי לבגרות1. בניגוד הזכרים, מיוזה אצל נקבות מאותחלת אך ורק במהלך התפתחות העובר. בעקבות הלידה, oocytes נשארים נעצר בשלב dictyate ממושך של prophase אני עם שלפוחית-germinal שלם (GV; מעטפת הגרעין) עד גיל ההתבגרות. מיד עם תחילת גיל ההתבגרות, תת-קבוצה של oocytes המזמורים נבחרים לעבור גדילה, התבגרות, סימון אתחול של חידוש meiotic. חידוש meiotic ב oocytes וחוה מתבטאת על ידי היעלמותו של GV בתהליך המכונה התמוטטות germinal שלפוחית (GVBD). Oocyte לציפוי כרומוזום עיבוי, סגרגציה, ואחריו הגוף קוטב ההבלטה. Oocytes הופכים נעצרה על סדר MII, מומרץ כדי להשלים את החטיבה השנייה והאחרונה meiotic רק לאחר ההפריה.

פוריות נשית תלויה מאוד להצלחת meiotic prophase אני התקדמות. המפתח לכל זה היא היווצרות-חיבור פיזי בין כרומוזומים הומולוגיים הידועה בשם chiasmata, אשר מתווך על ידי תיקון המושרה מעברי חוט כפול דנ א (DSBs) באמצעות כבל מוצלב רקומבינציה2. תהליך זה מתרחש בתוך ההקשר של לפיגום עשירים בחלבון דינאמית הידועה בשם המתחם synaptonemal (SC) המהווה בין כרומוזום הומולוגי כדי להקל על שלהם synapsis3. SC הוא דמוי רוכסן tripartite מבנה המורכב שני אלמנטים לרוחב מקבילים המחוברים באמצעות חלבונים באזור המרכז שמחזיק homologs יחד במהלך מתמשך DNA לתקן. לפני synapsis, מבשרי מרכיבי לרוחב, שנקרא אלמנטים צירית, יוצרים בין האחות chromatids. Synaptonemal קומפלקס חלבונים כגון SYCP2 ו- SYCP3 טופס צירית הגורמים colocalize בצירים לכידות כרומטידה אחות במהלך prophase המוקדמות. אלה מאוחר יותר לשמש מחייב אתרים עבור החלבון נימה רוחבי, SYCP1, אשר מאפשר הרכבה יסוד מרכזי, synapsis בין מיושר homologs4. ב oocytes העכבר, synapsis מלאה מסומן על ידי הנוכחות של 20 לגמרי חופפים מתיחות SYCP3 ו SYCP1, אשר ניתן לאבחן באמצעות כרומטין להפיץ את ההכנות. Synapsis הושלמה בעת כניסתו substage pachytene, לפיה ג'יי ג'יי אברהמס בוגרת זה נועדו טופס chiasmata בין homologs מעוטרים mutL הדימרים homolog (MLH1/3) כדי לקדם את עיבוד מדויק שלהם,5,6 , 7. קיום מתחמי כרומוזומים (SMC), כולל cohesin, condensin ו- SMC5/6 מתחם מבניים חשובים עבור הרגולציה של כרומוזום dynamics ומבנה במהלך המיוזה8,9, 10,11,12. באופן קולקטיבי, אירועים אלה להבטיח bi-כיוון נכון של כרומוזומים הומולוגיים מנוגדות הפולנים פלך בעקבות פירוק של SC.

מחזור התא meiotic הוא מודל חזק כדי לבחון את התפקידים של חלבונים שונים בתחזוקת הגנום עקב אינדוקציה מתוכנת תיקון עוקבות של דנ א DSBs. יתר על כן, בתרבית של המיוזה היא גם דוגמנית הרלוונטיים לצורך המחקר של שינויים epigenetic, החתמה13. עם זאת, מבחינה טכנית קשה להעריך אירועים אלה במהלך המיוזה הנשי, אשר מתקיים בעובר ו neonatal השחלות אצל יונקים (איור 1). Prophase אני יכול להיות מחולק 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ו- dictyate. במסמך זה, אנו מתארים כיצד לבודד, להבחין בין עוברי ו neonatal השחלות, האשכים (איור 2). הותאם מפעולות שתואר קודם לכן, כתב יד זה גם מתאר פרוטוקול (שלב 1) עם הפגנה וידאו להכנת prophase meiotic הנשי אני כרומטין מתפשט14,15,16,17 . בשילוב עם immunolabelling, כפי שמתואר שלבים 6-7, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מיקרוסקופי מפורט של prophase אני אירועים oocytes.

Oogenesis מועדת לשגיאות, כרומוזום missegregation אירועים במהלך החטיבה meiotic הראשון מייצג את המקור הנפוץ ביותר של מחלה גנטית רומא18,19. כתב יד זה (פרוטוקול שלב 2), נתאר פרוטוקול שבו oocytes ביים-GV בוגרת המחולצים להתקפת השחלות של עכברים הנשי למבוגרים. בתנאים תומכת, oocytes וחוה עוברים הורמון מחלמן תלויית חידוש מיוזה בעקבות בידוד ותרבות20. בעקבות חידוש meiotic, oocytes להתקדמות מיוזה, ואז לעצור-מפה של השני. Oocytes נשארים נעצר ב מפה של השני, אלא אם כן מופרית. שלבים 2-5, אנחנו להסתגל פרוטוקולים שדווחה בעבר עם הפגנה וידאו כדי לתאר כיצד לאסוף, תרבות ולהכין oocytes MI, MII כרומטין להפיץ את ההכנות21. זה כרומטין התפשטות הטכניקה מאפשר immunolabelling ברורה של חלבונים הקשורים כרומוזומים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי להבדיל בין כרומוזום טרינארית ו univalent, ולא ניתן לפתור עוד אחות אחת chromatids כדי להקל על הערכה של oocyte פלואידיות. לכן, בנוסף חשיפת דפוסי לוקליזציה של חלבונים meiotic, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כלי רב ערך עבור שחקרתי סיבות פוטנציאליות של כרומוזום missegregation במהלך MI MII.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) מאוניברסיטת ג'ונס הופקינס. הניסויים נערכו על עכברים C57BL/6J פראי-סוג.

1. קצירת השחלות עוברית או Neonatal והכנה של כרומטין Prophase מתפשט

  1. כדי לחלץ עוברי-14.5 – 19.5 ימים פוסט-coitum (dpc) להקריב הנקבות בהריון דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO בהתאם להנחיות IACUC.
    הערה: עבור יום כמחנכת 1 – 5 השחלות דלג לשלב 1.3. איור 1 מסכמת את שלבי meiotic prophase מועשר בגילאים שונים של אחרי לידה.
  2. פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור בצורת V. שווייץ הקרן הרחם האימהי, להפריד את העוברים השליה, העברת העוברים 35 מ מ פטרי המכילות 3 מ"ל של טרום ומחוממת 1 x פוספט מאגר, תמיסת מלח (PBS) ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: חממה fliptop להגדיר ב 37 ° C יכול לשמש כדי לשמור על הטמפרטורה. בנוסף, שלב זכוכית טמפרטורה מוסדר יכול לשמש גם כדי לשמור על טמפרטורה במהלך השחלה מניפולציה.
  3. עם מספריים כירורגיים 3.5 אינץ, להקריב עוברי או הגורים באמצעות עריפת ראש בהתאם להנחיות IACUC. מקום עוברי ערופת הראש או הגורים PBS ומחוממת מראש לפני ניתוח נוסף.
  4. לנתח את העובר או גור אחד במועד בצלוחית נפרדת 35 מ מ המכיל 3 מ"ל של PBS ומחוממת מראש ב- 37 מעלות צלזיוס. המשך על ידי חיתוך לאורך הקו האמצעי הגחון של החצי האחורי של העובר, לאורך החצי הקדמי מתחת את forelimbs ישירות מעל הינד-איבריו ואת הזנב כפי שמתואר באיור 2A–B.
  5. לפתוח את הבטן בעזרת מספריים כירורגיים 3.5 אינטש. בעזרת מלקחיים שקצהו הקנס תסיטו או להסיר את הכבד ואת לולאות של המעי הגס, חשיפת השחלות בתוך צלחת פיטרי 35 מ מ חדש המכיל 3 מ"ל של PBS ומחוממת מראש ב 37 מעלות צלזיוס (ראה מדריך איור 2B). השחלות ממוקמים מיד מתחת ומאחורי הכליה לכיוון הקיר האחורי של חלל הצפק (איור 2 ב–ג). מדריך עבור הבחנה בין זכר ונקבה גונדות ניתנת איור דו-ממדי.
    הערה: תנאים אופטימליים, במהירות לנתח את השחלות אחרי הנקבה ההרה מוקרבת.
  6. להסיר את השחלות הן מן כל העובר נקבה באמצעות זוג מלקחיים שקצהו הקנס תחת דיסקציה היקף ומקום במשקפיים השעון או בארות נפרדים של באר מרובה צלחת המכילה 0.5 עד 1.0 מ של PBS ומחוממת מראש ולשמור ב 37 º C.
  7. מקם כל זוג של השחלות במאגר 0.5 mL היפו-מיצוי (17 מ"מ ציטראט trisodium וגופרית והרכבו, סוכרוז 50 מ"מ, 5 מ"מ EDTA, 0.5 מ מ DTT, 30 מ מ טריס-HCl, מעכב פרוטאז, pH 8.2) זכוכית השעון נקי או טוב קטן של צלחת 9-ובכן, מקפיד לטבול את הפקודה comp השחלות letely. דגירה לפחות 15 דקות, אך לא יותר מ- 30 דקות.
    הערה: להפוך את מאגר היפו-מיצוי טרי ולהשתמש בתוך שעתיים של DTT בנוסף.
  8. במהלך הדגירה, באמצעות עט PAP הידרופובי המכשול, לצייר שני 22 x 22 מ מ2 ריבועים על זכוכית נקי 25 x 75 מ מ2, שקופיות מיקרוסקופ בעובי 1 מ מ כפי שמוצג באיור 3 א.
    הערה: ניתן להכין שקופיות מבעוד מועד.
  9. Pipette 45 – 50 µL של 100 מ מ סוכרוז לשקופית נקי ולהעביר זוג אחד של השחלות לירידה.
  10. באמצעות קצות שתי מחטים 27 G חדה, להקניט את השחלות לגזרים לשחרר תאים בתוך תמיסת סוכרוז. עם מלקחיים, להסיר חתיכות גדולות של השחלה, בזהירות פיפטה סוכרוז פתרון כדי לפזר את התאים.
  11. מקום 40 µL של פתרון מקבע (1% paraformaldehyde (PFA), דטרגנט 0.2% (ראה טבלה של חומרים), pH 9.2) לתוך כל ריבוע של השקופית מוכן. עם טיפ 200 µl פיפטה, להפיץ הפתרון מקבע באופן שווה על פני שקופיות.
  12. פיפטה 20 µL של המיקס סוכרוז על כל ריבוע של השקופית המכילה את מקבע.
    הערה: זה משווה ל באמצעות זוג אחד של השחלות לכל שקופית.
  13. דגירה השקופיות בחדר לחים סגורה ללילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: לילה הדגירה יכולה לנוע סביב (12-15 שעות) בטמפרטורת החדר.
  14. פותחים את המכסה קאמרית ולאפשר שהשקופיות מילה נהדרת לחלוטין.
  15. לשטוף שקופיות בתוך צנצנת Coplin המכיל 50 מ של פתרון סוכן הרטבה-PBS 0.4% (ראה טבלה של חומרים) למשך 2 דקות, אוויר יבש, והמשך פרוטוקול immunolabelling (שלב 6).
    הערה: ייתכן ניתן לאחסן את השקופיות ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, אך זה משתנה בהתאם החלבון עניין. לקבלת תוצאות מיטביות, להמשיך מיד פרוטוקול immunolabelling (שלב 6).

2. מפה של אני אוסף Oocyte

  1. כדי להגדיל את מספר זקיקים antral מבודד בכל עכבר, intraperitoneally להזריק בגרו עכברים הנשי בתולה עם IU 5 של גונדוטרופין סרום של סוסה הרה (PMSG, הידוע גם בשם אקווין גונדוטרופין כוריוני (א)).
    הערה: עבור תשואה אופטימלית oocyte, עכברים צריך להיות 1 עד 3 חודשים של גיל, כמו מספר oocytes שנקטפו יקטן עם הגיל. כדי להכין PMSG, להמיס בקבוק של 5,000 יחב ב- 100 מ של סטרילי PBS (U/0.1 5 מ ל) בחנות aliquots לשימוש יחיד של 600 µL ב-20 ° C.
  2. לאחר 44-48 h, להכין אוסף בינוני, המינימום חיוני בינוני אלפא (MEMα) בינוני בתוספת 5% סרום שור עוברית (FBS) ו- 3 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). לחטא מדיה דרך מסנן נקבובית 0.2 µm. Decant 2.5 מ של MEMα/BSA/FBS בינוני לתוך צלחת זכוכית אחת לכל העכבר וחם עד 37 ° C בחממה2 CO 5%.
    הערה: אחרים אוסף ומדיה תרבות שאינם זמינים מסחרית (M2 ו- M16) גם משמשות.
    התראה: אנו ממליצים הסרת תרבות מנות 5% CO2 החממה אחד בכל פעם על משך זמן מוגבל למזער את החשיפה הסביבתית במהלך השלבים מניפולציה.
  3. להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO בהתאם להנחיות IACUC.
  4. פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור גדול בצורת V. באמצעות מלקחיים, תחסיר המעיים אל הראש של העכבר. לאתר כל קרן הרחם; השחלות הן מציגות proximal לכלוב הצלעות. להחזיק את oviduct עם מלקחיים בסדר וחותכים ממונה השמן השחלה באמצעות חיתוך מספריים (איור 4). המשיכו להחזיק את oviduct, עם עוד זוג מלקחיים בסדר לשחרר את השחלה בורסה, המקום לתוך תבשיל אוסף MEMα/BSA/FBS בינוני.
    הערה: כמו שלב 1, זה הכרחי כדי לשמור על השחלות ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור ב- 5% CO2. חממה fliptop מכור עד 5% CO2 מיקס יכול לשמש כדי לאפשר תחזוקה אופטימאליים של טמפרטורה ורמות2 CO. בנוסף, שלב זכוכית טמפרטורה מוסדר אמור לשמש גם כדי לשמור על טמפרטורה במהלך oocyte מניפולציה.
  5. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט בקוטר 27 (או גודל דומה), שחרר cumulus oocyte תסביכים על-ידי באופן ידני ניקב את זקיקי antral גדולים.
  6. תוך כדי התבוננות דרך מיקרוסקופ לנתיחה, לאסוף oocytes ביים-GV באמצעות פיפטה מזכוכית המופעלים באמצעות הפה של נים, או המופעל ביד מיקרומטר-מזרק (איור 5). רק לאסוף oocytes שפורסמו antral זקיקים. GV oocytes יש קוטר של 90 מיקרומטר. GV oocytes עשוי להיות מוקף 2-3 שכבות של תאים granulosa ויש קוטר סך של-200 מיקרומטר.
  7. תרבות oocytes זכוכית השעון נקי או צלחת 9-ובכן המכיל MEMα/BSA/FBS בינונית במשך 6 שעות להגיע מפה של אני-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%.
  8. המשך לשלב 4.

3. מפה של השני (MII) Oocyte אוסף

  1. כדי להגדיל oocytes מבודד בכל עכבר, intraperitoneally להזריק בגרו עכברים הנשי בתולה עם IU 5 של PMSG. לאחר 44-48 שעות, intraperitoneally להזריק 5 IU של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG).
    הערה: עבור תשואה אופטימלית oocyte, עכברים צריך להיות 1 עד 3 חודשים של גיל, כמו מספר oocytes שנקטפו יקטן עם הגיל. כדי להכין hCG, להמיס בקבוק של 10,000 U ב- 200 מ ל PBS (U/0.1 5 מ ל). אחסן aliquots לשימוש יחיד של 600 µL ב-20 ° C.
  2. לאחר 12-14 שעות, להכין MEMα/BSA/FBS אוסף בינוני, כפי שמתואר בשלב 2.2, לעיל.
  3. להקריב את העכברים דרך נקע בצוואר הרחם או חנק2 CO בהתאם להנחיות IACUC.
  4. פתח את חלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטרילי, עושה חור גדול בצורת V. באמצעות מלקחיים, תחסיר המעיים אל הראש של העכבר. לאתר כל קרן הרחם, השחלות הן להציג proximal לכלוב הצלעות. להחזיק את oviduct עם מלקחיים בסדר וחותכים ממונה השמן השחלה באמצעות חיתוך מספריים (איור 4). לאחר מכן להסיר את השחלה ואת oviduct, מניחים צלחת אוסף המכיל MEMα/BSA/FBS בינוני.
    הערה: כמו שלבים 1 ו- 2, זה הכרחי כדי לשמור על השחלות ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור ב- 5% CO2. חממה fliptop מכור עד 5% CO2 מיקס יכול לשמש כדי לאפשר תחזוקה אופטימאליים של טמפרטורה ורמות2 CO. בנוסף, שלב זכוכית טמפרטורה מוסדר אמור לשמש גם כדי לשמור על טמפרטורה במהלך oocyte מניפולציה.
  5. באמצעות מזרק 1 מ"ל עם 27 G (או גודל דומה) או חדים מלקחיים, יפער חור ampulla של oviduct כדי לשחרר את oocytes MII.
    הערה: יש להיזהר לא לגרום נזק את oocytes ב ampulla. Ampulla יופיעו נפוח ולא שקוף כזה oocytes הם גלויים (איור 4).
  6. קציר oocytes MII מ ampulla של oviduct לתוך תבשיל חדש אוסף בינונית בעזרת פיפטה מזכוכית המופעלים באמצעות הפה של נים, או המופעל ביד מיקרומטר-מזרק (איור 5).
  7. המשך לשלב 4.

4. oocyte ומזוהות והסרה Zona Pellucida

  1. להכין 300 IU/mL של hyaluronidase בינוני MEMα בתוספת 3 מ"ג/מ"ל של BSA כדי מערטל oocytes של סביב cumulus תאים (2.5 מ ל/עכבר) זכוכית שעון, והשאר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    הערה: Hyaluronidase יעילות יורד בחדות לאחר h 1 של הכנה. עבור MII oocytes, טיפול hyaluronidase אינו נדרש.
  2. לחשוף oocyte-תלולית מכלולי תא ל 300 IU/mL של hyaluronidase ב MEMα/BSA למשך 3 דקות כדי מערטל oocytes של קומולוס תאים המקיפים אותם.
    התראה: לא יעלה על 3 דקות חשיפה hyaluronidase, כפי. יהרוס את oocytes.
  3. כדי לשטוף את oocytes, העברה oocytes טרי חימם צלחת בינונית MEMα/BSA. באמצעות פיפטה זכוכית קטנים המופעלים באמצעות הפה או נים (מעט גדול יותר מקוטר oocyte, המהווה כ 90 מיקרומטר), pipette את מתחמי למעלה ולמטה כדי לנתק לחלוטין את התאים קומולוס. אפשר את oocytes לשחזר בחממה תוך כדי הכנה. השלב הבא.
  4. הפתרון של Tyrode חומצי חמים, MEMα/BSA ומדיה של Waymouth ל- C ° 37 (500 µL/עכבר). µL המקום 300 בכל טוב של צלחות זכוכית קטן 9-. טוב.
  5. כדי להסיר את pellucida zona (מסוג ZP) להעביר 5 – 10 oocytes לתוך הפתרון של Tyrode. לחשוף את oocytes רק 30-45 שס. הפתרון.
    הערה: מעט מדי חשיפה הפתרון לא יסיר את מסוג ZP לחלוטין, אשר ימנע את oocytes מתפרצת, כרומוזומים מלהתפשט. חשיפה מוגזמת לפגוע ולהרוג את oocyte. צופה את התמוססות מסוג ZP תחת המיקרוסקופ ניתוח יכול לסייע אופטימיזציה זמן החשיפה.
    התראה: באמצעות הפתרון של Tyrode טריים הוא קריטי, כמו הפונקציה יורדת עם הגיל. להשתמש טוב טרי של הפתרון של Tyrode עבור כל קבוצה של מטופלים כדי להבטיח העיכול אחיד של מסוג ZP oocytes.
  6. מיד לאחר הסרת מסוג ZP, לשטוף את oocytes על ידי העברת לתוך בינוני MEMα/BSA/FBS ומחוממת. חזור על שלב זה לשטוף.
    הערה: היה זהיר בעת העברה, כמו oocytes. בקלות להישאר ביחד, פיפטה מזכוכית או הסרת נימי הבאים מסוג ZP. מראש להרטיב את פיפטה מזכוכית או נים במדיום של Waymouth יצמצם oocytes נשארים יחד.
  7. העברת ולאפשר את oocytes להתאושש במשך 30 דקות של Waymouth בינוני ב 37 ° C בחממה2 CO 5%.
  8. המשך לשלב 5.

5. MI וכפולות כרומטין Oocyte MII

  1. באמצעות עט PAP, צייר מלבן2 11 x 44 מ"מ על השקופית זכוכית כפי שמוצג באיור 6A.
  2. מעיל השקופית עם שכבה דקה של מקבע (1% paraformaldehyde, 0.2% 100 טריטון-X H2O, pH 9.2) על ידי pipetting µL 100 של מקבע אותן לשקופית, נדנדה השקופית אחורה וקדימה. הקש על השקופית כדי להיפטר מקבע עודף.
  3. לאסוף בין 5-10 oocytes עם מחט פיפטה פה קטן עם כמו מדיה קטן ככל האפשר וגרור את המחט בשורה לרוחב השקופית מצופים מקבע בעת הפקדת את oocytes מ- 1 ס מ מעל לשקופית לתוך הפתרון מקבע. יש לבצע פעולה זו באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה על מנת להבטיח כי נצברים את oocytes, כי הם שלו.
    הערה: oocytes צריך פרץ מיד בשקופית. הגובה בו הם oocytes להפקיד השפעת מידת כרומטין מתפשטת. ראה תוצאות נציג איור 6 לפרטים נוספים.
  4. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר בחדר סגור humidified בין לילה כדי לאפשר את כרומטין לדבוק.
  5. לאפשר את השקופיות מילה נהדרת לחלוטין ולשטוף שקופיות בתוך צנצנת Coplin המכיל 50 מ של 0.4% סוכן הרטבה-H2O, pH 8.0.
  6. המשך לשלב 6.

6. Immunolabelling

  1. הכנת המאגר דילול נוגדנים (ADB) שמתואר בטבלה 1.
  2. להכין שני כדים Coplin המכילים 50 מ של שטיפת (WB) בופר (10% ADB מדולל ב- PBS), ואת אחד צנצנת Coplin המכיל 50 מ ל WB 0.05% פתרון דטרגנט (למשללהוסיף 250 µL של 10% סבון 50 מ ל WB).
  3. לשטוף את השקופיות שהוכנו בסעיף 1 ו-5 של פרוטוקול זה 10 דקות בצנצנת אחת Coplin, המכיל 50 מ של WB.
    התראה: אל תתנו את השקופיות יבש בשלב כלשהו במהלך immunolabelling.
  4. לשטוף את השקופיות 10 דקות Coplin צנצנת המכילה 50 מ ל WB, פתרון דטרגנט 0.05%. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin הנותרים המכילים 50 מ של WB פתרון עבור 10 דקות.
  5. הקש את עודף שקופית נוזלי ולכסות עם 100 µL של נוגדנים ראשי הנבחרת מדולל ב- ADB. דגירה ב 4 ° C בין לילה בחדר לחים סגור.
    הערה: הדגירה יכולה להתקצר 2 כדי 3 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס. השתמש כרכים קטנים של נוגדנים (למשל, 50 µL) על ידי כיסוי השקופית עם coverslip או מצלמות-מיקרוסקופים.
  6. לשטוף שקופיות בתוך צנצנת Coplin המכיל 50 מ של 0.2% סוכן הרטבה-PBS פתרון, pH 8.0.
  7. חזור על שלבים 6.2-6.5.
  8. הקש את עודף שקופית נוזלי ולכסות עם 100 µL של הנבחרת נוגדנים משניים מדולל ב- ADB. דגירה שקופיות 1 עד 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך תא סגור לח.
  9. רחץ בשקופיות 2 פעמים עבור 10 דקות בתוך צנצנות Coplin המכיל 50 מ של 0.2% סוכן הרטבה-PBS פתרון, pH 8.0.
  10. רחץ בשקופיות 2 פעמים עבור 5 דקות בצנצנות Coplin המכיל 50 מ של 0.2% סוכן הרטבה-H2O פתרון, pH 8.0.

7. הרכבה שקופיות

  1. Prophase כרומטין ממרחים מוכנים בשלב 2, להוסיף 100 µL של הרכבה בינונית המכיל 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 1.5µg / mL). עבור כרומטין MI, MII מתפשט מוכן בשלב 5, להוסיף 50 µL של הרכבה בינונית המכיל דאפי (1.5µg / mL). בעדינות כתם נוזלי עודף משם.
  2. מקום של coverslip 22 מ"מ x 60 מ"מ על העליונה, לאטום עם לק ברורה. לאחסן בקופסה שקופית 4 ° C או-20 ° C עד הערכה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    הערה: ברז בקלילות על מכסה להיפטר עודף הרכבה בינונית לפני איטום עם לק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תארנו שתי טכניקות בשביל להמחיש והערכה הכרומוזומים. oocytes meiotic. הטכניקה הראשונה היא ששירתה לקראת הערכת התקדמות prophase של השחלות עובריים ו neonatal. Prophase כרומטין התפשטות ההכנות בעל ערך רב להמחשת תהליכים דינאמיים רבים במהלך המיוזה, כולל כרומוזום זיווג, synapsis, desynapsis, רקומבינציה הומולוגית, ו שיפוץ כרומוזום epigenetic. . הנה, הראו את התועלת של שיטה זו להמחשת חזקים וניתוח כמותי של כבל מוצלב-צורה oocytes שנקטפו C57BL/6J עוברי (איור 3B

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההכנות התפשטות כרומטין לאפשר לחוקרים ללמוד באופן כרונולוגי הנשי מיוזה יונקים ו לוקליזציה דינמי של חלבונים המעורבים. בכפולות כרומטין עובריים ו neonatal מאפשרים ניתוח קרוב של אירועים ברחבי meiotic prophase. מפה של מפה של השני ואני כרומטין כפולות יכול לשמש כדי להבחין בין האחות יחיד chromatids מ זיווג כרומוזומים הומולוגיים לזווג, והאחיות וכן להעריך פלואידיות. לשם השוואה, הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות יתרון בהשוואה oocyte כל immunolabelling, המייצרת לעיתים קרובות רמות גבוהות של האות רקע זה מקטין את הרזולוציה של חלבוני כרומט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIGMS (R01GM11755) כדי P.W.J על ידי מלגת גרנט אימונים מ הלאומי סרטן המכון (NIH) (CA009110) ג. ה, ג'יי-אייץ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10X פוספט חוצץ מלח (PBS) pH 7.4איכות ביולוגית119-069-161
60 מ"מ x 15 מ"מ צלחות פטרידנווילT1106
35 מ"מ x 12 מ"מ צלחות פטרידנווילT1103
מלקחיים עדיניםVWR300-050
מספריים מיקרו דיסקציהטד פלה1340
ניתוח  מספריים, קצה חד, 41/2 אינץ'VWR82027-578
שעון זכוכית מרובע 1 5/8Carolina Biological Supply Company742300חיטוי לפני כל שימוש
סוכרוזסיגמאS8501
טריסודיום ציטראט דיהידראטסיגמאS1804
EDTAסיגמאE6758
טריזמה בסיססיגמאT1503
1,4-Dithiothreitol (DTT)Sigma646563להוסיף למאגר ההיפוטוני מיד לפני השימוש
מעכב פרוטאז 50xRoche11873580001להוסיף למאגר ההיפוטוני מיד לפני השימוש
מזרק טורברקולין עם מחט (1 סמ"ק, 27 גרם x 1/2 אינץ')Becton, Dickinson (BD)309623
שקופיות זכוכית אולטרה פרוסט אטם זהב (25X75 מ"מ, עובי 1 מ"מ)Thermo3063-002
עט Super PAP, גדול (חוסם נוזלים)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)71310
16% Paraformaldehyde AmicousElectron Microscopy Sciences (EMS)15710
Triton X-100SigmaT8787חומר ניקוי בכתב יד
תא לחות כתמים חיסוניירוק עד240-9020-Z10
צנצנות קופליןפישר08-815
פוטו-פלו 200מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)74257חומר הרטבה בכתב יד
גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG)SigmaG4877אחסן כמויות ב-20C
גונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG)SigmaC0434אחסן aliquots ב-20C
PYREX צלחות ספוט עם תשעה חללים קעוריםפישר13-748Bחיטוי לפני כל שימוש
נימי זכוכיתפישר22260943להכנת מחטי איסוף ביציות
מותג Parafilm MSigmaBR701501להכנת מחטי איסוף ביציות
צינורות גומי לטקס (קוטר פנימי 3.2 מ"מ x 6.4 מ"מ קוטר חיצוני)פישר14-178-5Bלהכנת מחטים
לאיסוף ביציותצינורות גומי לטקס (קוטר פנימי 6.4 מ"מ x קוטר חיצוני 11.1 מ"מ)פישר14-178-5Dלהכנת מחטי איסוף ביציות
אף גומי סיליקון גמיש, פיה מפלסטיק קשיח ו-15 אינץ' של צינורות לטקססיגמאA5177-5EAלהכנת מחטי איסוף ביציות
ראש מיקרומטר Mitutoyo150-208להכנת מחטי איסוף ביציות
מזרק 5 מ"לBD Biosciences309646להכנת מחטי איסוף ביציות
מסנן מזרק 0.45 μ m פילטרקורנינג431220להכנת מחטי איסוף ביציות
זכוכית פסטר פיפטה 5 3/4 "פישר13-678-6Aלהכנת מחטי איסוף ביציות
83 x 0.5 מ"מ קצה פיפטהדנווילP3080להכנת מחטי איסוף ביציות
&אלפא;-MEMInvitrogen11415049
Waymouth'sMedia Life Technologies
סרום בקר עובריפישרA3160602
אלבומין סרום בקר (BSA)SigmaA3311למדיית תרבית ביציות
500 מ"ל יחידות סינון 0.22umDenvilleF5227
HyaluronidaseSigmaH3506
Tyrode' s פתרוןSigmaT1788אחסן כמויות ב -20C
סרום סוססיגמאH-1270עבור ADB / מאגר כביסה
אלבומין סרום בקר (BSA)SigmaA1470עבור מאגר ADB / כביסה
VECTASHIELD מדיום הרכבה נגד דהייה עם DAPIVector LabsH-1200
שקופיות כיסוי מיקרוסקופ (22 מ"מ x 60 מ"מ)פישר12-544-G
לק שקוףאמזון N/A
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes>
SteREO Discovery.V8Zeiss495015-0001-000
Observer Z1Zeiss
Name>CompanyCatalog NumberComments
>Primary Antibodies
Mouse anti-MLH1Life TechnologiesMA5-15431גורם דילול- 1:100
ארנב נגד SYCP1Life TechnologiesPA1-16763גורם דילול- 1:1000
עז אנטי-SCP3סנטה קרוזsc-20845גורם דילול- 1:50
נוגדנים לחלבון אנטי צנטרומר אנושימשולבים15-235גורם דילול- 1:100
ארנב אנטי- TOPOIIAbcamab109524גורם דילול- 1:100
עכבר אנטי-היסטון H4 (די מתיל K20, טרי מתיל K20)Abcamab78517מקדם דילול- 1:500
ארנב אנטי-Rec8באדיבות ד"ר קארן שינדלרN/Aגורם דילול- 1:10,000
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>נוגדנים משניים
חמור נגד עיזים IgG (H+L) Alexa Fluor 568 מצומדThermo-Fisher ScientificA-11057גורם דילול- 1:500
חמור נגד עכבר IgG (H+L) Alexa Fluor 488 מצומדThermo-Fisher ScientificA-21202גורם דילול- 1:500
חמור נגד ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor 647 מצומדThermo-Fisher ScientificA-31573גורם דילול- 1:500
עיזים נגד עכבר IgG (H+L) Alexa Fluor 568 מצומדThermo-Fisher ScientificA-11004גורם דילול- 1:500
נוגדן משני אנטי אנושי IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 488Thermo-Fisher ScientificA-11013גורם דילול- 1:500
עיזים נגד ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor 568 מצומדThermo-Fisher ScientificA-11011גורם דילול- 1:500
11220035

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
  2. Keeney, S. Spo11 and the Formation of DNA Double-Strand Breaks in Meiosis. Genome Dyn Stab. 2, 81-123 (2008).
  3. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), (2015).
  4. Vries, F. A., et al. Mouse Sycp1 functions in synaptonemal complex assembly, meiotic recombination, and XY body formation. Genes Dev. 19 (11), 1376-1389 (2005).
  5. Baker, S. M., et al. Involvement of mouse Mlh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13 (3), 336-342 (1996).
  6. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31 (4), 385-390 (2002).
  7. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171 (3), 447-458 (2005).
  8. Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS Journal. 282 (13), 2426-2443 (2015).
  9. Lee, J. Roles of Cohesin and Condensin in Chromosome Dynamics During Mammalian Meiosis. J. Reprod Dev. 59 (5), 431-436 (2013).
  10. Verver, D. E., Hwang, G. H., Jordan, P. W., Hamer, G. Resolving complex chromosome structures during meiosis: versatile deployment of Smc5/6. Chromosoma. 125 (1), 15-27 (2016).
  11. Hopkins, J., et al. Meiosis-specific cohesin component, Stag3 is essential for maintaining centromere chromatid cohesion, and required for DNA repair and synapsis between homologous chromosomes. PLoS Genet. 10 (7), e1004413(2014).
  12. Hwang, G., et al. SMC5/6 is required for the formation of segregation-competent bivalent chromosomes during meiosis I in mouse oocytes. Development. 144 (9), 1648-1660 (2017).
  13. Kota, S. K., Feil, R. Epigenetic transitions in germ cell development and meiosis. Dev Cell. 19 (5), 675-686 (2010).
  14. Taketo, T. Microspread ovarian cell preparations for the analysis of meiotic prophase progression in oocytes with improved recovery by cytospin centrifugation. Methods Mol Biol. 825 (1), 173-181 (2012).
  15. Sun, X., Cohen, P. E. Studying recombination in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 1-18 (2013).
  16. Kim, J. H., Ishiguro, K., Kudo, N., Watanabe, Y. Studying meiosis-specific cohesins in mouse embryonic oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 47-57 (2013).
  17. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  18. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  19. Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Hum Mol Genet. 16, R203-R208 (2007).
  20. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs In vivo and In vitro: I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  21. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957 (1), 203-212 (2013).
  22. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים