מאמר שיטה

שיטת טרנספוזיציה יעיל במבחנה על-ידי מערכת יופי ישן Transcriptionally מוסדרים הארוזים לתוך וקטור Lentiviral פגומים אינטגרציה

DOI:

10.3791/56742

⸱

12 בינואר 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשיג שילוב יציב הגן עניין הגנום האנושי על ידי המערכת היפהפייה הנרדמת transcriptionally מוסדרים. הכנת השילוב של וקטורים lentiviral פגומים, התמרה של במבחנה חושית של תאים אנושיים ואת וזמינותו המולקולרית בתאי transduced מדווחים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposon היפהפייה הנרדמת (SB) היא מערכת שילוב נגיפי עם יעילות מוכחת עבור העברה גנטית, גנומיקה תפקודית. כדי למטב את מכונות transposon SB, הם מועסקים, transcriptionally מוסדרים היפראקטיביים transposase (SB100X) ו transposon מבוסס-T2. בדרך כלל, transposase ואת transposon הינם מסופקים transiently על ידי פלסמיד תרביות תאים, SB100X ביטוי מונעת על ידי יזם מכוננת. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה כדי לספק את הרכיבים SB תאים אנושיים, כי הם עמידים בפני מספר שיטות פיזיקליות, כימיות תרביות תאים, SB100X הביטוי שליטה ולשלב stably הגן עניין (גוי) דרך SB "גזור והדבק" מנגנון. הביטוי של transposase היפראקטיבי מפוקחת באופן קפדני על-ידי מערכת ט-ON, בשימוש נרחב כדי לשלוט ביטוי גנים מאז 1992. הגן עניין משני צדדיה הפוך חזרה (IR) של transposon T2. שני הרכיבים SB ארוזים בשילוב פגומים וקטורים lentiviral transiently המיוצר בתאים HEK293T. תאים אנושיים, או שורות תאים או ראשי תאים מרקמות אנושיות, הם במבחנה transiently transduced עם וקטורים ויראלי. על תוספת של דוקסיציקלין (dox, טטרציקלין אנלוגי) לתוך המדיום תרבות, כוונון של ביטוי transposase נמדד, התוצאה היא שילוב לטווח ארוך של הגן עניין הגנום של תאים שטופלו. שיטה זו היא יעילים וישימים שורת התאים (למשל, הלה תאים) ותאים הראשית (למשל, אדם ראשי keratinocytes), ובכך מייצג כלי רב ערך עבור הנדסה גנטית, העברה גנטית טיפולית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transposase SB100X היפראקטיבי מצמידים את transposon מבוסס-T2 שימש כבר ג'ין פרה טיפול יישומים1,2,3, הגנום שינויים4,5, ו pluripotent המושרה תא גזע (iPSC) התכנות6,7. בדרך כלל, הרכיבים SB transiently הינם מסופקים על ידי תרביות תאים פלסמיד וכונני מקדם מכוננת חזקה הביטוי של transposase. עם זאת, למרות השיטות חדש משופר של תרביות תאים, משלוח של מערכת שני עדיין אתגר עבור יישומים רבים. לפיכך, הפיתוח של פרוטוקול מסירה חדש יש עניין גובר. מלבד השיטות תרביות תאים פלסמיד8 ו- mRNA9, משלוח ויראלי בהתבסס על adenoviral10,11, adeno-הקשורים ויראלי (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 , lentiviral וקטורים15 הוצע בעבר. ראוי לציין, המערכת של בחירה חייבת להבטיח את משלוח ארעית של רכיבי SB בלי אינטגרציה של וקטור ויראלי. למרות זאת, הביטוי המכונן של transposase מעלה חששות בטיחות בשל הסכנה של rehopping בלתי נשלט של transposon.

לכן, רגולציה תעתיק של SB100X על-ידי מערכת ט-אן מעודן הוא האתגר הראשון. מקדם ט מגיב שונה, שהושג על ידי החלפת ייצוג המקדם cytomegalovirus מינימלי מפותחת (CMV) המקורי עם האמרגן מינימלי (-81) של הגן Timidine קינאז (TK) 1 וירוס הרפס סימפלקס (HSV-1)16, שוכפל הזרם של CDNA SB100X (pTetOTKSB100X). מוטציה rtTA2 הפוכה-טטרציקלין-transactivators-M217 מבוטא תחת השליטה של האמרגן מכוננת חזקה (מקדם phosphoglycerate, PGK) שיכפל בתוך פלסמיד שונים (pCCL-PGKrtTA2S-M2). בעת הוספת המדיום תרבות, dox מאגד את rtTA2s-אפנן M2 ו tethers ט ייצוג המקדם מורכבים או, המתקבל ב מוסדר בחוזקה אינדוקציה של הביטוי SB100X18.

האתגר העיקרי השני נובע תרביות תאים לא יעיל של תאים אנושיים הראשי באמצעות מספר שיטות פיזיקליות, כימיות. להעביר ביעילות transposase בתאי אדם עמיד תרביות תאים, את SB100X של ה-rtTA2s-קסטות הביטוי M2 ארוזים אל תוך שילוב שני וקטורים פגומה lentiviral (IDLVs)19: IDLVTKSB ו- IDLVrtTA2s- M2. וקטורים ויראלי מיוצרים transiently כמו וקטורים הדור השלישי HEK293T תאים20 ו- pseudotyped עם גליקופרוטאין G של הנגיף Vescicular Stomatitis (VSV-G), אשר מקנה לקשת רחבה של זיהום. וקטור חלקיקים מרוכז על-ידי ultracentrifugation, טיטרציה על ידי HIV-1 להקיא p24 immunocapture. כדי מגלי שורות תאים ותאים הראשי, וקטור חלקיקים הם ומורכבת עם polybrene, מודגרת עם התאים היעד ב נוכחות או היעדרות של dox. התרופה תלוית ההפעלה של הביטוי SB100X בתאים transduced נמדד על ידי RT-PCR (לרביעיית-PCR) כמותית18.

ברגע מוסדר ט SB100X ביטוי הוכח, טרנספוזיציה של ממשלת ישראל (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) לתוך הגנום בתא היעד עוקב אחר האירועים המולקולריים schematized בבירור על ידי בק, Mikkelsen21. שליש IDLV וקטור נושא קלטת הביטוי עבור ממשלת ישראל משובטים בין ההכנסה T2-transposon (IDLVT2) חייב להיות נבנה ונארז כאמור לעיל. לבסוף, שלושת הווקטורים IDLV יכול לשמש ביעילות מגלי תאים אנושיים (למשל, ראשי keratinocytes) במבחנה ולשלב ממשלת ישראל בנוכחות דוקסיציקלין18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פלסמידים המועסקים

הערה: פלסמיד pCCL-PGKrtTA2S-M2 היה בחביבות שסופקו על-ידי פרופסור Zappavigna (אוניברסיטת מודנה, רג'יו אמיליה, שוויץ). פלסמיד pCMVSB100X נושאת את רצף קידוד של transposase היפראקטיבי של פלסמיד transposon pT2/BH בחביבות שסופקו על-ידי פרופ ' / ח' ז' Ivics (פול ארליך המכון, Langen, גרמניה), פרופסור צ Izvak (Max Delbruck מרכז לרפואה מולקולרית, ברלין, גרמניה).

  1. עבור כל שכפול ב- Escherichia Coli (e. coli), בצע את האסטרטגיה שיבוט של הליך הבחירה ואת אנזים הגבלה או PCR הגברה של השבר להיות משובטים.
    הערה: טבלה 1 מסכמת כל פלסמידים המועסקים פרוטוקול זה. תיאור והפניות עבור כל פלסמיד הינם מסופקים.

2. ייצור וקטור ויראלי

הערה: כל הווקטורים ויראלי מיוצרים ברדס הביולוגי ברמה הבלימה אבטחה BSL2, על פי תקנות וכללים מוסדיים.

  1. התרבות תאים HEK293T חסיד של Dulbecco ששינה נשר בינוני בתוספת 10% HyClone סרום פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, גלוטמין 2 מ מ.
  2. יום 0: להכין חמישה הכנת לוחות/ויראלי 15 ס מ זרע 5.5x106 תאים 30 מ של המדיום.
  3. יום 1: תקנים
    1. לפני שמתחילים תרביות תאים, הכן 100 מ ל תמיסת מלח 2 x HEPES מאגר (HBS):
      NaCl (5 מ') מ ל 5.6
      HEPES (1 מ') 10.0 מ ל
      נה2HPO4 (0.5 M) 0.3 mL
      סטרילי מים 84.1 mL
      להתאים את ה-pH 7.1 עם 37% HCl.
      הערה: 2 x HBS ניתן לאחסן ב 4 º C. PH המדויק חשוב מאוד עבור תקנים יעיל. הטווח pH אופטימלי הוא 7.10 עד 7.12.
    2. הסר בינוני ומוסיפים 22.5 מ ל/צלחת של טרי בינוני 4 שעות לפני תרביות תאים.
    3. Transfect תאים HEK293T עם פלסמיד העברה, את פלסמיד אריזה pMD.Lg/pRRE.D64VInt, פלסמיד קידוד המעטפה את pMD2.G את pRSV-Rev (טבלה 1) על פי הלוח/הכמות הבאים:
      העברת פלסמיד 25.00 µg
      µg pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25
      pMD2.G 8.75 µg
      µg pRSV-Rev 6.25
      הערה: פלסמיד DNAs מוכנות לפי הפרוטוקול CsCl שתואר על ידי Maniatis22 או באמצעות ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין פלסמיד.
      1. Resuspend µg 56.25 של DNA (שילוב של פלסמידים 4) ב- 1.125 מיליליטר מים סטריליים ולהוסיף µL 125 של 2.5 מטר CaCl2 (פתרון A).
      2. להוסיף 1.250 מ של 2 x HBS שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15מל (פתרון B).
      3. להוסיף פתרון (1.250 mL) ל B (1.250 מ ל) dropwise תוך בעבוע באמצעות פיפטה מ"ל 1 או 2 (הפתרון תרביות תאים, הנפח הכולל 2.500 מ ל).
      4. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      5. באמצעות micropipette של P1000, להפיץ את כל הפתרון תרביות תאים (2.500 מ ל) טפט תא dropwise.
    4. דגירה בין לילה בחממה תרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  4. יום 2: להסיר את המדיום ולהוסיף 15 מ"ל בינוני טריים (ראה שלב 2.1).
  5. יום 3: לאסוף ולרכז את תגובת שיקוע lentiviral המכילים חלקיקים.
    1. לאסוף כל תגובת שיקוע (~ 70 מ ל) (n = 5) transfected תא צלחות, לסנן דרך מיקרומטר 0.45 וסטיית לסנן ולמלא polyallomer 2 צינורות (1 אינץ ' x 3.5 ס מ) / ויראלי הכנה.
    2. לרכז את החלקיקים וקטור על ידי ultracentrifugation ב 106,000 g x עבור 2.5 h, 15 ° C עם בלם.
    3. מיד לאחר שעצרה את ultracentrifugation (כדי למנוע resuspension של בגדר בצינור), בעדינות שופכים את תגובת שיקוע לתוך מיכל המכיל 10% מלבין ו להשעות את כדורי בקושי נראה 2 ב 100 µL ל- PBS 1 x (+1% BSA). . זה נורמלי כמו בגדר ברורים וקצרים. השתמש הווקטור מרוכז טרייה, או aliquot ולאחסן את ההכנות ויראלי ב-80 מעלות צלזיוס.
      התראה: תגובת שיקוע מכיל חלקיקים lentiviral חייב להיות מולבן ביסודיות לפני השלכת של פסולת חומרים מסוכנים.
  6. כדי titrate ההכנה וקטור ויראלי, השתמש HIV-1 להקיא p24 immunocapture ערכה לפי הפרוטוקול של היצרן.
    הערה: כדי לתקנן את הייצור וקטור ויראלי, ריאגנטים מבוססי ליפוזומים יכול להיות מועסק. למרות זאת, כייל וקטור ויראלי תלויה מאוד תרביות תאים יעילות וטוהר פלסמיד ה-DNA.

3. התמרה חושית של שורות תאים אנושיים (למשל, הלה תאים)

הערה: הלה תאים מתורבתים במדיום הנשר של Dulbecco ששונה בתוספת 10% עגל עוברית סרום פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, גלוטמין 2 מ מ. טבלה 1 מסכמת כל הווקטורים המועסקים פרוטוקול זה. תיאור עבור כל וקטור מסופק. התמרה חושית של תאים הלה מאפשר אימות של התקנון תעתיק של SB transposase בשילוב במינון הכי טוב שני וקטורים IDLV. וריאציה של מינונים IDLV עשויה להיות קשורה וקטור טיטור החלקיקים וסוג תא היעד.

  1. יום 0: זרע 2 x 105 תאים 3 מ"ל של מדיום עבור כל טוב של צלחת 6-. טוב. להכין 4 בארות.
  2. יום 1: התמרה חושית של הלה תאים.
    1. עבור כל תנאי, לדלל וקטורי lentiviral נפח סופי של 1 מ"ל בינוני (ראה הערה לעיל) בנוכחות 10 μL של polybrene (ריכוז סופי 8 μg/mL):
      דילול טוב # 1: ללעוג transduced תאים (בקרה שלילית).
      דילול עבור #2: וקטור IDLVTKSB (2,600 ng של p24).
      דילול-וולס #3, #4: וקטור IDLVTKSB (2,600 ng של p24) + IDLVrtTA2s-M2 וקטור (9,600 ng של p24).
    2. להסיר את המדיום מכל קידוח איפה הלה תאים מצופים ביום 0 ומוסיפים דילולים וקטור lentiviral המתאימה היטב.
    3. Spinoculate הצלחת. ובכן 6 ב g 754 x למשך 45 דקות ב 20-25 ° C, ואז העברת הצלחת 6-ובכן חממה התרבות התא-CO 37 ° C ו-5%2.
    4. לאחר 6-אייץ ', החלף את הווקטורים המכילות בינוני בינוני טריים בבארות כל ולהוסיף דוקסיציקלין μM 1 טוב # 4. מכניסים את הצלחת חממה התרבות התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  3. יום 3: הכנת תא צניפה לחילוץ RNA.
    1. לפני ניתוק התאים, הכן הפתרון עובד טריפסין (1 x):
      2.5% טריפסין (10 x) מ ל 5.0
      500 מ מ EDTA (ריכוז סופי = 5 מ מ) 0.5 mL
      1 x PBS 44.5 מ
    2. טריפסין חמים הפתרון עובד ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחסן טריפסין הפתרון עובד ב 4 º C.
    3. הסר בינוני ולשטוף תאים עם 1 x PBS. להוסיף 0.5 מ של הפתרון עובד טריפסין מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס מכל קידוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות (ב חממה התרבות תאים).
    4. לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מ של סרום המכיל בינוני עד בכל טוב כדי להשבית טריפסין ותאים לאסוף בשפופרת צנטרפוגה. לשטוף טוב פעם אחת עם 3 מ"ל של PBS 1 x, centrifuge התליה תא עבור 5 דקות ב 240 x g.
    5. לשטוף תאים עם 5 מ של 1 x PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 240 x g ולמחוק את תגובת שיקוע. השתמש כדורי תא שנאספו טרי או לאחסן ב- 80 ° c חלץ RNA הכולל של כדורי לבצע RT-PCR כמותי למחצה (ראה שלב 6).

4. התמרה חושית של התאים הראשי של האדם (למשל, keratinocytes)

הערה: keratinocytes ראשי האדם הם נזרע על גבי לקרינה אולם 3T3-J2 תאים (שכבה מזין)23, מתנה נחמדה יאן Barrandon (EPFL, לוזאן, שווייץ).

  1. לגדול העכבר שוויצרי 3T3-J2 בתאים ששינה נשר בינוני של Dulbecco בתוספת 10% התורם סרום שור פניצילין U/mL 50-סטרפטומיצין, גלוטמין 4 מ מ (בינוני 3T3).
  2. לצמוח keratinocytes מצופה על גבי התאים לקרינה אולם 3T3-J2 cFAD בינוני, בינוני נשר שונה של Dulbecco F12 מדיה תערובת של חזיר (3:1) המכילים סרום שור עוברית (10%), פניצילין-סטרפטומיצין (1%), גלוטמין (2%) אינסולין (5 µg/mL), אדנין ( 0.18 מ מ), הידרוקורטיזון (0.4 µg/mL), טוקסין הכולרה (0.1 nM), ו תריודוטירונין (2 ננומטר).
  3. יום 0: זרע 3 x 105 אולם מוקרן 3T3-J2 תאים, בעבר מדולל 3T3 בינוניים עד ריכוז סופי של תאים5 עונה 1 פרק 10/mL, בבאר בכל צלחת 6-. טוב. להכין 9 בארות.
  4. יום 1: התמרה חושית של keratinocytes ראשי
    הערה: התמרה חושית של keratinocytes מאפשר כימות של התקנון תעתיק של SB transposase בשילוב במינון הכי טוב שני וקטורים IDLV (על-ידי לרביעיית-PCR) וכדי לאמת את השילוב של גוי (GFP) בתאי המטרה (על-ידי cytofluorimetric ניתוח).
    1. לפני ניתוק התאים, הכן את הפתרון עובד טריפסין:
      0.5% טריפסין-EDTA (10 x) מ ל 5.0
      500 מ מ EDTA (ריכוז סופי = 5 מ מ) 0.5 mL
      1 x PBS 44.5 מ
    2. טריפסין חמים הפתרון עובד ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחסן טריפסין הפתרון עובד ב 4 º C.
    3. כדי לנתק keratinocytes subconfluent בתרבות, הסר בינוני, לשטוף תאים עם 1 x PBS ולהוסיף 1 מ"ל של הפתרון עובד טריפסין ומחוממת מראש מכל קידוח. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות החממה התרבות תאים.
    4. לאחר הדגירה, resuspend התאים של באר ביסודיות ולהעביר התליה תא שפופרת צנטרפוגה המכיל 2 מ של סרום המכיל בינוני (אם תאים רבים עדיין מחוברים, דגירה דקות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס). לשטוף טוב פעם אחת עם 3 מ ל 1 x PBS או בינונית טרייה ולהוסיף את הפתרון שטיפה ברכבת התחתית צנטריפוגה עם התליה תא.
    5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    6. לשטוף תאים עם 5 מ של 1 x PBS, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    7. צינור פוליפרופילן 15-mL, לדלל 1.6x10 keratinocytes5 ב 1 מ"ל של cFAD בינוני, דילול אחת עבור כל תנאי.
    8. לדלל lentiviral וקטורים ב 1 מ"ל של מדיום cFAD בנוכחות 20 μL של polybrene (ריכוז הסופי של µg/mL 8 בווליום הסופי של 2 מ ל):
      דילולים וולס #1, #2, #3: ללעוג transduced תאים (שליטה שלילי ללא וקטורים).
      דילולים וולס #4, #5: וקטור IDLVTKSB (13,000 ng של p24) + IDLVrtTA2s-M2 וקטור (48,000 ng של p24).
      דילולים וולס #6, #7, #8, #9: וקטור IDLVTKSB (13,000 ng של p24) + IDLVrtTA2s-M2 וקטור (48,000 ng של p24) + וקטור IDLVT2 (9,160 ng של p24).
    9. מגלי בתאים השעיה על-ידי הוספת כל דילול וקטור lentiviral (1 מ"ל) כדי המתלה תקין המתאים (1.6x10 keratinocytes5 ב 1 מ"ל).
    10. להסיר את המדיום מתאי לקרינה אולם 3T3-J2 נזרע יום 0 ו keratinocytes צלחת transduced (1.6x10 keratinocytes5 ב- 2 מ"ל) עלתה עליהם. לאחר transducing היטב המשך פעם הבאה.
    11. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן להעביר את התאים עד 37 ° C בחממה התרבות התא במשך 6 שעות.
      הערה: תעשה לא keratinocytes, ראשי spinoculate הכדאיות והתפשטות חריפה יושפעו.
    12. לאחר 6 שעות, להוסיף 1 מ"ל של מדיום cFAD כל טוב. הוסף μM 1 דוקסיציקלין (ריכוז סופי) בבארות #5 #8, #9. לחזור תאים 37 מעלות צלזיוס.
  5. יום 2: להחליף cFAD בינוני 3 מ"ל של מדיום KC עם 10 ננוגרם למ"ל EGF.
  6. יום 3: Trypsinize ולשטוף תאים מבארות #1, #4 ו 5 # כמתואר קודם (ראה 4.4.1 כדי 4.4.6). הקפאת תאים כדורי ב- 80 ° C כדי לחלץ RNA הכולל לניתוח לרביעיית-PCR (ראה שלב 7).
  7. Trypsinize תאים מן #2, #6 ו- #8 כמתואר בצעדים 4.4.1 כדי 4.4.5 ולבצע ניתוח cytofluorimetric לביטוי GFP (ראה שלב 5).
  8. שמור את התרבות מבארות #3 #7, #9 עבור הטווח לפחות 3-4, מספיקות לדלל IDLVT2 האו ם משולב וקטור (5 ימים עבור האדם keratinocytes הראשית מצופה בשכבה מזין).
  9. יום 6: כ 5 ימים לכתוב התמרה חושית, trypsinize תאים (ראה שלבים 4.4.1 כדי 4.4.5) מבארות #3 #7, #9 לבצע ניתוח cytofluorimetric לביטוי GFP (ראה שלב 5).
    הערה: תזמון ניסוי ויעילות התמרה חושית מושפעות מאוד לפי סוג התא הראשי ולפי השתנות של הדוגמאות שנאספו.

5. Cytofluorimetric ניתוח על keratinocytes ראשי transduced

הערה: זרימה cytometer נקבעה עם לייזר כחול (488 ננומטר), לייזר אדום (633 ננומטר) מסננים עבור זיהוי של קרינה פלואורסצנטית GFP, APC הוא מועסק (ראה טבלת חומרים).

  1. להפלות keratinocytes משכבת מזין 3T3-J2, תווית transduced keratinocytes מנותקת-ביום 3 וביום 6 (ראה שלבים 4.7 ו- 4.9) עם העכבר monoclonal APC-נוגדן אנטי-מזין מצומדת.
    1. להכנת 4 מיליליטר מכתימה את המאגר עבור כל דגימה:
      5% FBS 200 ΜL
      500 מ מ EDTA (ריכוז סופי = 2.5 מ מ) 20 μL
      ΜL PBS 1 x 3780
    2. רחץ מנותקת תאים עם 1 מ"ל של צביעת מאגר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    3. בשפופרת עבור רכישת cytometry זרימה, resuspend 5 x 10 תאים4 ב 100 μL מאגר מכתימים ולהוסיף 2 μL של נוגדן אנטי-מזין (1:50). מערבבים היטב, תקופת דגירה של 30 דקות על קרח בחושך.
    4. לאחר 30 דקות, לשטוף עם 2 מ של צביעת מאגר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 580 x g וזורקים את תגובת שיקוע. Resuspend ב μL 200 של צביעת מאגר.
    5. רוכשים APC ו- GFP אותות על ידי ניתוח cytofluorimetric18. השבר תאים GFP+ של אוכלוסיית תאי APC– מציין transduced keratinocytes.
      הערה: אם רצונך בכך, לתקן את הדגימה מוכתם לפני cytometry זרימה עם 2% paraformaldehyde ב- PBS 1 x וחנות ב 4 ° C בחושך עד ההפעלה.
  2. ניתוח נתונים cytometry זרימה ידי היחס בין אחוז GFP+תאים על הקצה (5 ימים) ואת אחוז GFP+תאים יומיים לפרסם התמרה חושית, מנורמל לרמה שיורית של IDLVT2-transduced תאים.

6. חצי כמותית RT-PCR

הערה: השתמש הצנטרפוגה תרמי של ה-PCR.

  1. לחלץ סך RNA מ transduced או לשלוט תאים באמצעות ערכת טיהור RNA, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
    הערה: RNA הכולל שניתן לאחסן ב- 80 ° c
  2. לסנתז cDNA בתגובה 20 µL באמצעות 100 ננוגרם של RNA הכולל וערכת רוורס טרנסקריפטאז, על-פי הפרוטוקול של היצרן.
    הערה: cDNA שניתן לאחסן ב-20 ° C.
  3. עיצוב תחל ספציפיות עבור SB100X, rtTA2s-M2 ו- GAPDH (גן משק בית).
    עיצובים המוצע:
    SB קדימה פריימר: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
    SB הפוך פריימר: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
    rtTAM2 להעביר פריימר: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
    rtTAM2 הפוכה פריימר: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
    GAPDH להעביר פריימר: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
    GAPDH הפוכה פריימר: 5'–CCACCACCCTGTTGCTGTAG–3'
  4. ביצוע PCR נפח התגובה האחרונה של 50 µL. בפרט, להרכיב כל צינור PCR את התגובה הבאה:
    cDNA (1:5 דילול) (מתוך שלב 6.2) 1.00 µL
    קדימה פריימר (10 מיקרומטר מניות) 1.00 µL
    הפוך פריימר (10 מיקרומטר מניות) 1.00 µL
    dNTPs (10 מיקרומטר מניות) 1.00 µL
    מאגר (+ MgCl2) (10 x מניות) 5.00 µL
    . אנזימים (5 מניות U/µL) 0.25 µL
    µL במים סטריליים 40.75
  5. השתמש בתוכנית הבאה של הצנטרפוגה תרמי: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ואז להמשיך עם 95 ° C ל 30 s, 58 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s 34 מחזורים עבור SB100X, 32 מחזורים עבור rtTA2s-M2 , ומחזורי 25 עבור GAPDH.
  6. הכנת ג'ל agarose 1%. להמיס 1g של agarose ב- 100 מ של TBE 1 x (10 x מניות מדולל במים סטריליים), גביע או את הבקבוק. ממיסים במיקרוגל, מתערבל בכל דקה עד agarose זה התפרקה לחלוטין. מגניב של agarose נמס עד שהוא מגיע כ 50 ° C, ולאחר מכן להוסיף 5 µL של אתידיום ברומיד (10 mg/mL במלאי). יוצקים agarose נמס במגש ג'ל התאספו עם מסרק, לליהוק ג'ל.
  7. טען דוגמאות (10 µL כל אחד) על הג'ל agarose ולבצע אלקטרופורזה.
  8. במידת הצורך, לרכוש ג'ל התמונה ולבצע ניתוח densitometric על הלהקות PCR.

7. כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR)

הערה: מערכת זיהוי רצף מסחרי הוא מועסק. תחל PCR ו- 6-carboxyfluorescein (FAM) רגש גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) נרכשים באופן מסחרי.

  1. ראו רטרו-שעתוק, שלב 6.2.
  2. השתמש בתוכנה כדי לעצב תחל ולאחר בדיקה ספציפית עבור SB100X.
    עיצוב המוצע:
    SB.2 להעביר פריימר: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
    SB.2 הפוכה פריימר: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
    בדיקה SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
  3. לבצע PCR בזמן אמת ב- 96-ובכן צלחות עם שילוב PCR מאסטר ומערבבים תחל + רגש, באמצעי אחסון התגובה האחרונה של 25 µL. בפרט, שקול את התגובה הבאה עבור כל טוב:
    cDNA (1:10 דילול במים סטריליים) 1.00 µL
    2 x מיקס מאסטר 12.50 µL
    צבעי יסוד + 20 x רגש לערבב 1.25 µL
    µL במים סטריליים 10.25
    הערה: לבצע תגובות כל דולר. כדי למנוע שגיאות pipetting, להכין תערובת לפחות n + 3 תגובות (ללא cDNA). Aliquot באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
  4. הפעל PCR בזמן אמת באמצעות התוכנית הבאה: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז 40 מחזורי 95 ° C עבור 15 s ו- 60 ° C 1 דקות, להחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
  5. ניתוח נתונים לרביעיית-PCR על ידי נרמול הביטוי יחסי (ערך RQ) SB100X לרמה של GAPDH של המדגם cDNA אותו על ידי 2–ΔΔCT כימות, באמצעות תוכנה לניתוח נתונים טיפוסי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בהליך המובאים כאן, שלושה וקטורים IDLV נושאת את הרכיבים SB מוסדר (SB100X, rtTA2S-transposon M2 ו- T2-GFP) היו באריזה, נהגה לספק ביעילות, בחוזקה לווסת את המערכת SB בתאים אנושיים. איור 1A מציג ערכה עבור במבחנה התמרה חושית של הלה תאים, אשר נערך כדי להעריך את התקנון תעתיק של SB transposase עם השילוב הטוב ביותר במינון של שני וקטורים IDLV (דיווח בטבלה מס ' 2). התקנון תעתיק של SB100X היה נמדדת לרביעיית-PCR (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה נגישים נרחב stably שילוב של גוי לתוך הגנום של התאים היעד על ידי היפהפייה הנרדמת-מתווכת טרנספוזיציה. למרות שהמערכת SB פותחה כדי לספק שיטה nonviral לעריכה הגנום, העברה יעילה של מכונות אינטגרציה (transposase ו- T2 transposon) הוא חובה. לכן, להשתמש במערכת SB בתאי ראשי בקושי transfectable, משלוח ויראלי של רכיבים SB היה נרדף בשנים האחרונות10,12,15. עם זאת, אף אחד הווקטורים ויראלי מועסק עד עכשיו התיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים פרופסור Zappavigna, אוניברסיטת מודנה, רג'יו אמיליה, שוויץ סיפק לנו pCCL-PGKrtTA2S-M2 פלסמיד. אנו גם להכיר פרופ Ivics צ (פול Ehlrich המכון, Langen, גרמניה), פרופסור צ Izvak (Max Delbruck מרכז לרפואה מולקולרית, ברלין, גרמניה) עבור pCMVSB100X ו pT2/BH פלסמידים. עבודה זו נתמכה על ידי דברה בינלאומי ומשרד איטלקית של אוניברסיטת ומחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דולבקו s שונה Eagle' מדיום עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ללא L-גלוטמיןלונזהBE12-614Fמדיום תרבית תאים.
סרום HyClone Fetal Bovine (ארה"ב), מאפייןGE Healthcare Life SciencesSH30071.03סרום המשמש HEK293T תרבית תאים לייצור חלקיקים לנטי-ויראליים.
פניצילין 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/mlLonzaDE17-602Eריאגנטים למדיום תרבית תאים.
L-גלוטמין 200mMLonzaBE17-605Eמגיב למדיום תרבית תאים.
מגיב נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS7653להכנת HBS 2X.
מאגר HEPES, מלאי 1M בתמיסת מלח רגילהLonzaBE17-737EReagent להכנת HBS 2X.
דיסודיום מימן פוספט דיהידראט (Na2HPO4· 2H2O), מגיב 99.5%Merck106580להכנת HBS 2X.
חומצה הידרוכלורית - מגיב ACS 37% (HCl)Sigma-Aldrich320331Reagent להכנת HBS 2X.
מים סטריליים להזרקהFreseniusKabi-Reagentלהכנת HBS 2X.
0.45 ומיקרו; m מסנן PESSWhatman10462100מסננים המשמשים להסרת פסולת תאים מסופרנטנט ויראלי.
צינורות פוליאלומר בקמן326823בקמן קולטרלריכוז וקטורי IDLV על ידי אולטרה-צנטריפוגה.
PBS-1X עם Ca, MgLonzaBE17-516Fמאגר לשטיפת תאים והשעיית חלקיקים לנטיויראליים.
אלבומין סרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA2153(אופציונלי) מאגר להשעיית חלקיקים לנטי-ויראליים.
ערכת לכידת חיסון HIV-1 Gag p24NEK50001KT פרקין אלמרלטיטרציה של חלקיקי IDLV.
PolybreneSigma-Aldrich107689Reagent לשיפור יעילות ההעברה.
טריפסין (10X) 2.5% ב-HBSS ללא Ca, מגיב MgGIBCOBE17-160Eלניתוק תאי HeLa (תמיסת מלאי, לדילול).
מלח דיסודיום חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)100938BAnalaR BDHReagent להכנת תמיסת עבודה של טריפסין.
0.5% טריפסין-EDTA, ללא פנול אדום (10X)GIBCO15400-054מגיב לניתוק קרטינוציטים (תמיסת מלאי, יש לדלל
סרום בקר תורם, מקור ניו זילנדGIBCO16030-074סרום לתרבית תאים 3T3-J2 של עכבר שוויצרי (שכבת הזנה).
בשר חזיר s F12 mediaGIBCO21765בינוני לקרטינוציטים.
סרום בקר עובריLonzaDE14-801Fסרום למדיום תרבית תאי HeLa.
סרום בקר עוברי, מוסמך, אוסטרליה מקורGIBCO10099-141סרום למדיום תרבית קרטינוציטים ראשוני אנושי.
אינסולין מלבלב בקרסיגמא-אולדריץ'I5500ריאגנטים לגידול קרטינוציטים.
אדניןVWR1152-25ריאגנטים לגידול קרטינוציטים.
הידרוקורטיזוןVWR3867-1ריאגנטים לגידול קרטינוציטים.
רעלן כולרה מ- Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052ריאגנטים לגידול קרטינוציטים.
TriiodothyronineSigma-AldrichT5516ריאגנטים לגידול קרטינוציטים.
של EGFאוסטרליGF-010-9לגידול קרטינוציטים.
נוגדן נגד מזין מצומד APC חד שבטי עכברMiltenyi Biotech130-096-099לתיוג שכבת מזין.
ערכת טיהור RNeasy Plus Mini KitQiagen74134RNA.
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051ערכת טרנסקריפטאז הפוך.
תערובת דאוקסינוקלאוטיד, 10 מ"מ (dNTP)מגיב סיגמא-אולדריץ'D7295ל-PCR חצי כמותי.
UltraPure DNase/RNase ללא מים מזוקקים(כל)-ריאגנט ל-PCR חצי כמותי ול-qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start פולימראזPromegaM740BTaq פולימראז.
אגרוז, לביולוגיה מולקולריתסיגמא-אולדריץ'A9539מגיב לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
UltraPure TBE Buffer, 10XInvitrogen15581028Reagent לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, לדילול (1X) ב-ddH2O.
אתידיום ברומידסיגמא-אולדריץ'E1510מגיב לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
דוקסיציקליןסיגמא-אולדריץ'D-9891תרופה לגרימת ביטוי טרנספוזאז בתאי HeLa ובקרטינוציטים
, TaqMan Universal PCR Master Mix, Applied Biosystem4304437-TaqMan Universal PCR Master Mix כולל פריימרים ובדיקה.
צינור צנטריפוגה מפוליפרופילן 15 מ"ל בהירות גבוהה, תחתית חרוטית, עם מכסה בורג איטום כיפה,352096סטריליים של פלקון קורנינגלאיסוף תאים והכנת דילול וקטורי.
צלחת תרבית תאים 150 מ"מ שטופלה ב-TC עם רשת 20 מ"מ,של פלקון קורנינג353025לייצור ויראלי.
6 צלחת תרבית תאים מולטי-באר שטופלה ב-TC, עם מכסה, עטופה בנפרד,צלחת תרבית תאים סטרילית של פלקון קורנינג353046עבור HeLa והתמרת קרטינוציטים ראשונית אנושית.
צינורות מיקרוצנטריפוגה Safe-Lock, נפח 1.5 מ"לEppendorf0030 120.086צינורות להכנת דילול.
צינורות מיקרוצנטריפוגה Safe-Lock, נפח 2 מ"לEppendorf0030 120.094צינורות להכנת דילול.
צינורות PCR 0.2 מ"ל עם כובעים שטוחים, צינורות RNase, DNase, DNA ומעכבי PCR ללאכל)ל-PCR חצי כמותי.
צלחת תגובה אופטית מהירה של MicroAmp עם 96 בארות עם ברקוד, 0.1 מ"לApplied Biosystem4346906-96 בארות עבור qRT-PCR.
צינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל, ללא צינורות352052 בזמכסה לרכישת ציטומטריית זרימה.
פיפטות סרולוגיות חד פעמיות, פוליסטירן, עטופות בנפרד, סטריליות (נפחים שונים)(כל)- פיפטות ליישומי תרבית רקמות סטריליות.
טיפים לסנן, סטרילי, ו-RNase, DNase, DNA ו-Pyrogen ללא (נפחים שונים)(כל)-טיפים לסנן ליישומי קולטור רקמות סטריליות וביולוגיה מולקולרית.
מד pH(כל)-ציוד למדידת HBS 2X pH.
PCR Thermal Cycler(כל)-ציוד ל-PCR חצי כמותי.
ציוד אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז(כל)-ציוד לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של PCR חצי כמותי.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BD-Flowציטומטר.
7900HT מערכת PCR מהירה בזמן אמתיישומי Biosystem7900HTציוד עבור qRT-PCR.
צנטריפוגות ספסל לעיבוד דגימות יעיל ביישומי תרבית תאים, בקירור, עם דליי מיקרופלייט.(כל)- צנטריפוגה לעיבוד תרבית תאים וספינוקולציה.
אופטימה L-90K אולטרה-צנטריפוגה מצוידת ברוטור SW32TIבקמןלייצור חלקיקים לנטי-ויראליים.
ציוד למעבדה לתרבית תאים וביולוגיה מולקולרית (למשל, קולט אדים למינרי Class II המיועד לעבודה הכוללת חומרי BSL2, אינקובטור תרביות תאים, מקררים ומקפיאים (+4 & deg; C, -20 ו-deg; C, -80 ו-deg; C), מיקרופיפטות ועזרת פיפט).
מעילי מעבדה מגן, כפפות, מיגון פנים בהתאם לכללי ותקנות המכון, בפרט לייצור והתמרה של חלקיקים לנטיויראליים.
את צינורות ערכת ).ריאגנטים ביולוגיים צינורות צלחת תרבית תאים סטרילית ( BD קולטר-אולטרה-צנטריפוגה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712(2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344(2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771(2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Sleeping Beauty SystemTranscriptional RegulationIntegration Defective Lentiviral VectorGene Of InterestHyperactive TransposaseTet ON SystemPrimary KeratinocytesFlow CytometryReal Time PCRDoxycycline Induction

מאמרים קשורים