מאמר שיטה

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

DOI:

10.3791/56766

⸱

12 ביוני 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה פרטים של assay חשופה נקודה פשוטה עבור כימות של adeno-הקשורים וירוס (AAV) titers ויישומו ללמוד את התפקיד של הפעלת מכלול חלבונים (AAPs), שיעור הרומן של חלבונים נגיפיים שאינן מבניות נמצאו AAV כל אשר נגרמו מהזנים אליהם, בקידום ההרכבה של capsids נגזר cognate, heterologous AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד adeno-הקשורים וירוס (AAV) מקובל כמו וקטור אטרקטיבי עבור טיפול גנטי, הוא משמש גם כמו וירוס מודל להבנת הביולוגיה וירוס. ב- הכבוד האחרון, התגלית האחרונה של חלבון AAV שאינן מבניות, כינה הרכבה-הפעלת חלבון (AAP), יש שופכים אור חדש על התהליכים המעורבים הרכבה של החלבונים capsid ויראלי סמנכ לתוך capsid. אמנם רבים AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם דרושה AAP להרכבה, לאחרונה דיווחנו כי AAV4, 5, 11 הם היוצאים מן הכלל. יתר על כן, אנחנו הראו כי AAPs, שהורכב capsids של אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה בתרגום כדי תאים subcellular שונים. זה הטרוגניות בלתי צפויה של תכונות ביולוגיות ותפקידים פונקציונלי של AAPs בין AAV שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מקפים תחתונים שהחשיבות של מחקרים על AAPs נגזר מגוונות אשר נגרמו מהזנים אליהם. כתב יד זה מפרט assay כתם של נקודה פשוטה עבור כימות AAV ויישומו להעריך AAP תלות, serotype ירידה לפרטים capsid ההרכבה. כדי להדגים את התועלת של assay חשופה זו נקודה, יצאנו לאפיין capsid הרכבה ותלות AAP AAV הנחש זוחל בעבר uncharacterized AAV, כמו גם AAV5, AAV9, אשר בעבר הוכחו להיות AAP-עצמאי, תלוי-AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם, בהתאמה. וזמינותו חשף כי הנחש AAV capsid הרכבה דורש AAP הנחש, לא יקודם על ידי AAPs מ AAV5 ו AAV9. וזמינותו הראה גם כי, שלא כמו רבים serotype נפוצות AAPs המקדמים הרכבה heterologous capsid על ידי הצלב-קומפלמנטציה, הנחש AAP אינו מקדם הרכבה של AAV9 capsids. בנוסף, אנו מראים כי הבחירה של נוקלאז משפיע באופן משמעותי את המדידה של נקודה חשופה וזמינותו, לפיכך, בחירת אנזים אופטימלית היא קריטית להערכת מוצלחת של AAV titers.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס Adeno-הקשורים (AAV) הוא וירוס קטן, שאינו אפוף, חד-גדילי DNA עם הגנום של 4.7 kilobases (kb). הגנום AAV מכיל מסגרות הקריאה הפתוחה (ORFs) על הגנים נציג , קאפ . בשנת 2010, חלבון nonstructural מזוהה בעבר מקודד על ידי ORF מסגרת-העביר +1 בתוך הגן קאפ AAV2 היה התגלה על ידי סונטג. et al. ומצא כדי לשחק תפקיד קריטי האסיפה החלבונים מונומר capsid סמנכ ל AAV2 לתוך נגיפי capsid1. חלבון זה הרומן נקראה האסיפה-הפעלת חלבון (AAP) התפקיד שהיא ממלאת בקידום capsid הרכבה1.

ORFs עבור AAP כבר מזוהה bioinformatically בתוך הגנום של כל parvoviruses הסוג של Dependoparvovirus, אך לא בתוך הגנום של וירוסים של סוגים שונים של הפרוו משפחה1,2. מחקרים פונקציונלי של חלבון זה הרומן התמקדו בתחילה AAP מן הטיפוס AAV2 (AAP2), אשר הקימה את התפקיד החיוני של AAP2 המיקוד חלבונים סמנכ ל unassembled גרעינון הצטברות, היווצרות לתוך באופן מלא התאספו3,1,capsids4. חוסר היכולת של capsids AAV2 להרכיב, בהעדר ביטוי AAP היה עצמאי מאושרות על ידי מספר קבוצות, כולל שלנו1,2,3,4,5 . מחקרים מאוחרים יותר על AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם 1, 8 ו- 9 לאשר את תפקיד מכריע של AAPs capsid הרכבה, כמו VP3 חלבונים מונומר של AAV1, 8, 9 היו מסוגלים ליצור של capsid שהרכבתם בהעדר ביטוי משותף של AAP2.

לאחרונה, דרך גישות הכוללות שימוש נקודה כמותיים כתם מבחני, חקרנו את היכולת של AAV1 12 VP3 מונומרים להרכיב לתוך capsids העדר ביטוי AAP ואת היכולת של AAP1 ל- 12 כדי לקדם את הרכבה של מונומרים VP3 מ heterologous אשר נגרמו מהזנים אליהם. מחקר זה גילה את AAV4, VP3 5, ו 11 מונומרים יכולים להרכיב ללא AAP. בנוסף, זה היה נמצא כי 8 מתוך שנים עשר AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם שבדקנו (קרי, כולם חוץ AAP4, 5, 11, 12) מוצג בעל יכולת רחבה כדי לתמוך capsid הרכבה של heterologous capsids serotype AAV, בעוד AAP4, 5, 11 ו- 12 מוצגים באופן משמעותי יכולת מוגבלת בזה כבוד6. אלה ארבע אשר נגרמו מהזנים אליהם נמצאים רחוק phylogenetically אחרים AAP אשר נגרמו מהזנים אליהם2,3. יתר על כן, המחקר חשף הטרוגניות משמעותי בהגרסא המקומית subcellular של AAPs שונים6. יתר על כן, המחקר הראו כי איגוד חזק AAP ועם שהורכב capsids גרעינון, סימן ההיכר של AAV2 capsid הרכבה, לא בהכרח ניתן להרחיב אחרים אשר נגרמו מהזנים אליהם כולל AAV5, 8, 9, המציגים החרגת nucleolar שהורכב capsids6. לכן, המידע שנרכש מתוך המחקר של כל serotype מסוים AAP אינה ישימה בהרחבה כל AAP לביולוגיה. הטבע תמוה כזה לביולוגיה AAP מדגיש את הצורך לחקור את תפקיד והתפקוד של כל AAP מ הקנוני והן קאנונית AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם.

התפקיד הביולוגי של AAP בהרכבה capsid יכול להיות מוערך על ידי קביעת שארוז מלא AAV נגיפי חלקיקים titers המיוצר כליה עובריים אנושיים (HEK) 293 תאים, הקו הסלולרי הנפוץ ביותר לייצור וקטור AAV, עם או בלי חלבון AAP ביטוי. השיטות הסטנדרטיות עבור כימות AAV הם ה-PCR כמותי (qPCR)-מבחני מבחני מבוסס7,8 ו- dot כמותי המבוסס על כתם9. שיטות נוספות AAV כימות חלקיק נגיפי כמו מקושרים-אנזים immunosorbent assay10,11 או מדידת צפיפות אופטית12 אינם אידיאליים עבור דוגמאות נגזר אשר נגרמו מהזנים רבים אליהם שונה AAV או דגימות מזוהם עם זיהומים (lysates גולמי או תרבות המדיה), לעתים קרובות הדגימות שימשו AAV מחקר. כיום, qPCR נמצא בשימוש נרחב ביותר עבור כימות AAV; עם זאת, הצורך להכיר פוטנציאליים אזהרות של וזמינותו מבוססי qPCR, כמו וזמינותו יכול לגרום כייל משמעותי הווריאציות13,14ושגיאות מערכתית. מבחני מבוססי ה-PCR מושפעים על ידי מספר פוטנציאלי משתנה מתערב גורמים, כגון הנוכחות של covalently סגורה מסוף סיכות בתבניות PCR המעכבות הגברה13. אפילו אדם מנוסה יכול להציג את הפוטנציאל גורמים מבלבלים לתוך מבוסס-qPCR assay ביודעין13. לעומת זאת, מבחני חשופה נקודה כמותית הם טכניקה קלאסית ביולוגיה מולקולרית אינו כרוך הגנום הגברה ומשתמש עיקרון פשוט עם סיכון מינימלי של שגיאות לעומת מבחני מבוסס qPCR. השיטה זו פחות מבחינה טכנית מאתגר; לכן, התוצאות assay הן לשחזור באופן סביר אפילו על ידי אנשים חסרי ניסיון.

בדו ח זה, אנו מתארים את הפרטים מתודולוגי של נקודה כמותיים חשופה assay באופן שגרתי להשתמש עבור כימות וקטור AAV ואנו מספקים דוגמא של איך ליישם את הבדיקה כדי ללמוד את תפקיד קידום מכלול AAPs במשותף אשר נגרמו מהזנים אליהם (AAV5 ו- AAV9), בעבר uncharacterized AAP מן הנחש AAV14. בטבע, סמנכ ל AAV חלבונים וחלבונים AAP מבוטאים חבר העמים של גן יחיד (קרי, סמנכ ל- AAP cis-קומפלמנטציה), ואילו בוזמינותו המתוארים כאן, סמנכ ל ו- AAP חלבונים מסופקים טרנס מ בשני פלסמידים נפרדות (כלומר, סמנכ ל- AAP טרנס-קומפלמנטציה). מאז ניתן לבטא כל חלבון סמנכ ל או AAP מ אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה מן כל פלסמיד עצמאית, הוא הופך אפשרי לבדוק heterologous שילובים סמנכ ל- AAP להרכבה capsid (קרי, סמנכ ל- AAP קרוס-קומפלמנטציה). בקצרה, AAV VP3 מ שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם מתבטא בתאים HEK 293 מאת פלסמיד תקנים דנ א כדי לארוז של הגנום וקטור AAV ב נוכחות או היעדרות של serotype cognate של AAP, או בנוכחות של serotype heterologous AAP. בעקבות הפקה, תקשורת תרבות, lysates תא נידונים assay כתם נקודה לכמת את הגנום הנגיפי בתוך הקליפה capsid. השלב הראשון של וזמינותו חשופה נקודה הוא להתייחס דגימות עם נוקלאז להסיר מזהמים פלסמיד DNAs ואת הגנום AAV unpackaged בדגימות. כך להגדיל את האותות רקע בפרט כאשר דגימות ולזרימה הם לבדיקה. זה ואז ואחריו טיפול פרוטאז כדי לשבור את capsids ויראלי ונשחרר הגנום הנגיפי עמידים נוקלאז פתרונות לדוגמה. הגנום הבא, נגיפי שפגע בסימני, מחק על קרום, hybridized גשש DNA ספציפיים גנום ויראלי עבור כימות. ב וזמינותו דוגמה דיווחו כאן, נדגים כי הנחש AAV VP3 דורש הנחש AAP להרכבה capsid ולקדם כי הנחש AAP לא ההרכבה של AAV9 capsids בניגוד רבים AAPs נגזר אשר נגרמו מהזנים אליהם תלויי-AAP יכולה לקדם גם הרכבה של heterologous serotype capsids. לבסוף, אנחנו מדווחים על הקונה חשוב qPCR או נקודה מבוססי חשופה AAV כימות assays כי הבחירה של נוקלאז משפיעה באופן משמעותי על תוצאות וזמינותו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: מתכונים פתרונות של מאגרים עבור פרוטוקול זה הינם מסופקים בכל טבלה 1. הפרוטוקול המתואר להלן הוא סמנכ ל- AAP קרוס-קומפלמנטציה נקודה חשופה וזמינותו ללמוד את התפקידים של החלבונים AAP capsid ההרכבה. שיטת העבודה וזמינותו חשופה כמותיים נקודה כללית יותר עבור טיטור וקטור AAV מטוהרים מוסבר במקטע תוצאות נציג .

1. בניית VP3 AAP, נציג AAV2 לבטא פלסמידים

  1. בנייה של pCMV-AAVx-VP3 (x. אשר נגרמו מהזנים = אליהם)
    1. PCR-להגביר ORF VP3 כולה (1.6 kb) באמצעות פולימראז ה-DNA של אמינות גבוהה והזוג פריימר הבאים: VP3 קדימה, CTAA-RE1-CACC-N25 (25 קודם נוקלאוטידים של ORF VP3); VP3 הפוכה, TCTT-RE2-N25 (נוקלאוטידים 25 אחרונה של ORF VP3).
      הערה: RE1 ו- RE2 הם אתרים עבור אנזימי הגבלה (במיל ') לקראת שיבוט. CTAA, TCTT טרמינל 5', 3' tetranucleotides הוסיף כדי להקל על עיכול אנזים הגבלה לקראת סוף שני גדילי ה-DNA. CACC הוא רצף קונצנזוס קוזאק.
    2. לשכפל את המוצרים RE-digested PCR בין המתאימה RE באתרים של וקטור ביטוי בתרבית של העושה את האדם cytomegalovirus מיד מוקדם-(CMV-IE) משפר-יזם עבור ביטוי ברמה גבוהה.
      הערה: לקראת שיבוט מולקולרי, לעכל 5 µg של ה-DNA של עמוד השדרה פלסמיד עם restriction enzyme(s)-ריכוז של DNA 4 U/µg לשעה בטמפרטורה האופטימלית. עבור ה-PCR שברים, להגדיל את היחידות של אנזימים בשימוש (למשל, U 10/µg של המוצר VP3 ORF PCR 1.6 kb), זמן הדגירה ארוך יותר (למשל, 4 שעות) בשל עלייה של מספר אתרי זיהוי אנזים הגבלה עבור אורך יחידה. מידע שימושי ביולוגיה מולקולרית אנזימים ונהלים שיבוט כולל חיידקי השינוי ניתן למצוא במקום אחר15,16,17.
  2. בניית pCMV-דגל-AAPx (x. אשר נגרמו מהזנים = אליהם)
    1. PCR-להגביר כולו ORF AAP (0.6 kb) למעט חומצת אמינו הראשונה ביותר באמצעות פולימראז ה-DNA של אמינות גבוהה והזוג פריימר הבאים: AAP קדימה, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (נוקלאוטידים 25 מ נוקלאוטיד הרביעית ב AAP ORF); AAP הפוכה, TCTT-RE2-N25 (נוקלאוטידים 25 אחרונה של ORF AAP).
      הערה: GACTACAAGGACGACGATGACAAA קודי תג דגל, אשר הוכח יש4,אין השפעות מזיקות5 אבל יכול להיות מושמט אם מיותרים.
    2. לשכפל את המוצרים RE-digested PCR בין האתרים המתאימים של וקטור בתרבית של ביטוי עם ה CMV-IE enhancer-מקדם15,16,17.
  3. בניית pHLP-נציג
    1. Digest 5 µg של פלסמיד pAAV-RC2 (7.3 kb) עם 20 יחידות כל אחד של Xho ו- Xcm, ולטהר את הדנ א באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי או על-ידי מיצוי פנול-כלורופורם.
      הערה: פינוי 1.8 kb Xho אני-Xcm שאני קטע מ- 7.3 kb pAAV-RC2 פלסמיד התוצאות בהפסד של capsid סמנכ ל ביטוי חלבון תוך שמירה על הביטוי נציג חלבון.
    2. ה-DNA בוטה מסתיים עם 6 יחידות של T4 DNA פולימראז, agarose ג'ל-לטהר את מקטע ה-DNA 5.5 kb, ואת עצמי מאתרים ומפסיקים את המקטע מטוהרים בעזרת 50 ל- 100 ננוגרם של DNA ו 400 יחידות של T4 DNA ליגאז לפי המלצה של היצרן15.
    3. בצע את ההליך טרנספורמציה חיידקית הרגיל הפניה בשלב 1.1.2 הערה.
  4. ודא שפלסמיד בונה על ידי אנזים הגבלה לעיכול, רצף15,18.
  5. לבצע פלסמיד minipreps או maxipreps באמצעות ערכות זמינים מסחרית כדי להשיג כמות מספקת של פלסמיד DNA עבור הניסויים ייצור AAV במורד הזרם.

2. הפקת AAV ב HEK 293 תאים על-ידי פלסמיד DNA תרביות תאים (Cross-קומפלמנטציה Assay)

  1. התרבות התאים HEK 293 של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM)-גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS), 1% פניצילין & מיקס סטרפטומיצין, ו- 1 מ מגלוטמין, חממה 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2).
    הערה: AAV titers להשתנות באופן משמעותי בהתאם לסוג מקור התאים HEK 293.
    התראה: למרות AAV יכולים להיות מטופלים ב אבטחה ברמה 1 (BSL1) בלימה, בלימה מומלץ לעבודה תא HEK 293 BSL2.
  2. יום-1 (24 שעןת לפני תרביות תאים), צלחת 6 – 7 x 105 HEK 293 תאים/טוב ב- 2 מ"ל של המדיום מלאה שמתואר בשלב 2.1 ב- plate(s) 6-ובכן. זה בדרך כלל משיג ~ 90% confluency למחרת.
  3. יום 0: תקנים
    1. לקראת ה-DNA תרביות תאים
      1. ודא כי התאים הגיעו ~ 90% confluency.
      2. לחמם DMEM בתוספת עם 1% פניצילין & סטרפטומיצין מיקס 1 מ"מ-גלוטמין אבל בלי 10% FBS (קרי, ללא סרום בינוני) בתוך אמבט מים 37 º C.
      3. לאפשר את הפתרון polyethylenimine (פיי) לטמפרטורת החדר.
    2. הכנת תערובת דנ א פלסמיד
      1. מערבבים את פלסמידים ב 96 µL של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ללא CaCl2 או MgCl2 צינורות microcentrifuge mL 1.5 סטרילי כמצוין בטבלה מס ' 2. הסכום הכולל של ה-DNA הוא µg 2/טוב.
        הערה: אמצעי האחסון לפתרון ה-DNA פלסמיד יכול להתעלם אם הן תקינות. כוונון עוצמת הקול מומלץ אם הנפח הכולל של פתרונות ה-DNA של פלסמיד ≥ 10 µL.
    3. פיי תרביות תאים
      1. להוסיף 4 µL של פיי פתרון (1 מ"ג/מ"ל) לתערובת דנ א פלסמיד-PBS (להכין לעיל). עוצמת הקול הסופי הוא כ 100 µL (5% נפח של המדיום תרבות). וורטקס הצינורות בקצרה דגירה התערובת DNA: פיי למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. בעת שחיכה הדגירה 15 דקות להשלים, החלף המדיום תרבות prewarmed בינונית ללא סרום שמתואר בשלב 2.3.1.2.
      3. פעם 15-מין הדגירה של ה-DNA: פיי תערובת השלמת בקצרה לסובב את הצינורות עם microcentrifuge כדי לאסוף את הנוזל לתחתית של הצינורות, להוסיף את התערובת DNA: פיי dropwise המדיום תרבות בבאר בכל צלחת תרבות HEK 293. בעדינות להתסיס את הצלחות ולהחזיר אותם חממה 37 ° C עם 5% CO2.
      4. לשמור על התאים במדיום הזה תרביות תאים עד הקציר-5 יום (ללא שינוי בינוני זה נדרש).
  4. על יום 1 ו- 2 ביום, להתבונן תאים transfected עם pCMV-GFP פלסמיד תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוך כדי להעריך את יעילות תרביות תאים.
    הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, כאן הוא 10 X / 0.25 מפתח נומרי המטרה בשילוב עם עינית 10 × היה בשימוש, ואת 450 – 490 nm עירור bandpass מסנן ומסנן 515-565 nm bandpass פליטה הועסקו. התנאי הנ ל בדרך כלל מניבה יותר תקנים 70% יעילות. תאים עשוי להפגין כמה שינויים מורפולוגיות (למשל התאים הפכו להיות רזה) בשל מצבו ללא סרום.
  5. ימים 3-5, להמשיך התרבות התאים transfected חממה 37 ° C עם 5% CO2.
  6. יום 5, לאסוף תאים והן בינוני המכיל וירוס לתוך צינורות חרוט פוליפרופילן 15 מ"ל pipetting למעלה ולמטה או על ידי גירוד עם המגרד התא.
  7. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

3. נקודה Assay כתם על כימות AAV

  1. שחזור של נגיפים
    1. במהירות להפשיר הצינורות קפוא בתוך אמבט מים 37 º C. וורטקס צינורות נמרצות במשך 1 דקה למקסם את ההתאוששות של AAV מתאי.
    2. גלולה ההריסות תא על-ידי צריך שתוציאו ב g x 3,700 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לקחת 200 µL של תגובת שיקוע מהצינור כל והעבר אותו לתוך צינור microcentrifuge שכותרתו עם כובע בורג עבור נקודה חשופה וזמינותו.
      הערה: Aliquot תגובת שיקוע הנותרים לתוך microcentrifuge צינורות ולאחסן אותם קפואים ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. . הנה, צינורות פוליפרופילן microcentrifuge מחוברת עם מזרקי, o-ring שימשו. איטום צר נדרשת כדי למנוע נשפך AAV, פנול-כלורופורם.
  2. הטיפול עם סרישיה marcescens endonuclease
    1. להכין תערובת A ו- B מיקס ריאגנטים (טבלה 3). להוסיף 10 µL של A מיקס 10 µL של מיקס B לתוך כל שפופרת. מערבולת הצינורות עבור 5 s, בקצרה ספין הצינורות לאיסוף הנוזל לתחתית של הצינורות של דגירה הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס לפחות לשעה.
      הערה: מיקס A מכיל NaOH וממטבת את ה-pH לטיפול עם ס' marcescens endonuclease. מיקס B תוספי מגנזיום. ריכוז של ס' marcescens endonuclease במלאי זמין מסחרית אנזים עשוי להשתנות. הנפח של ס' marcescens endonuclease צריכה תיקון בהתאם לעשות 200 U/mL לאחר הוספת מיקס A ו- B לערבב לתוך צינורות בשלב 3.2.1.
      הערה: זמן דגירה ארוך יותר, עד כדי 4h, יכול להפחית רקע אותות.
    2. בסוף הדגירה, בקצרה לסובב את הצינורות באמצעות צנטריפוגה benchtop לאסוף עיבוי והפתרון מן החלק העליון והחלק צדי הצינורות.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הדגימות ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C או-80 מעלות צלזיוס.
  3. טיפול proteinase K
    1. להכין תערובת C הכימית (טבלה 3). הוסף µL 180 של מיקס C לתוך כל שפופרת. וורטקס צינורות 5 s, בקצרה לסובב את הצינורות ואת דגירה הצינורות ב 55 ° C עבור 1 h.
      הערה: EDTA ב הכימית מיקס C chelates יוני מגנזיום חינם, חלבונית endonuclease ס marcescens .
    2. בסוף הדגירה, לאפשר דגימות לטמפרטורת החדר, בקצרה לסובב את הצינורות באמצעות צנטריפוגה benchtop לאסוף עיבוי והפתרון מן החלק העליון והחלק צדי הצינורות.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הדגימות ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C או-80 מעלות צלזיוס. כדי לחדש את הפרוטוקול, דגירה הצינורות ב 55 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות להמיס גבישים מרחביות הכלולים במאגר לחלוטין.
  4. משקעים החילוץ ואתנול פנול-כלורופורם
    1. להוסיף 200 µL של פנול-כלורופורם דגימות ו מערבולת אותם דק 1 לסובב את דוגמאות microcentrifuge-≥16, 100 גרם x ≥5 דקות בטמפרטורת החדר.
      התראה: פנול-כלורופורם וצריך לטפל בשכונה fume כימי עם ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; כלומר, nitrile כפפות, משקפי מגן או מגן הפנים, חלוק המעבדה עם שרוולים ארוכים).
    2. העברת µL 320 של השכבה המימית (160 µL פעמיים עם פיפטה P200) צינור microcentrifuge רגיל (80% נפח נוזלים מימית).
      הערה: זה חשוב מאין כמותו לקחת באותו אמצעי אחסון של תמיסה מימית בין דגימות, אחרת וזמינותו מאבד דיוק כמותית.
    3. להכין תערובת D הכימית (טבלה 3). הוסף µL 833 של מיקס D לתוך כל שפופרת. וורטקס צינורות 5 s, דגירה הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך ≥ 20 דקות.
      הערה: מיקס D הוא תערובת של אתנול, סודיום אצטט גליקוגן עבור אתנול נוח משקעים של ה-DNA. דוגמאות שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס בשלב זה, הפרוטוקול יכולה להתחדש מאוחר יותר.
    4. צנטריפוגה דגימות של microcentrifuge-≥16, 100 גרם x ב 4 ° C עבור ≥15 מינימלית יוצקים את תגובת שיקוע, כתם פעם על מגבת נייר נקיה. מכניסים כ 500 µL של 70% אתנול כל שפופרת, מערבולת הצינורות 5 s ו צנטריפוגה הצינורות עם microcentrifuge benchtop-≥16, 100 גרם x ב 4 מעלות צלזיוס למשך דקות ≥5.
    5. יוצקים את תגובת שיקוע, כתם פעם על מגבת נייר נקיה. כדורי יבש-65 מעלות צלזיוס; כדורי יכולים להיות מיובש לחלוטין.
      הערה: אין להשתמש פיפטה כדי להסיר את עודף אתנול שנשאר אחרי סופג הצינורות. כדורי יכולים גם להיות מיובש בטמפרטורת החדר למשך הלילה. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, כדורי ה-DNA יבשים ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר ימים עם המכסה צינור סגור.
  5. Resuspension של ה-DNA הנגיפי במאגר טה
    1. להמיס את כדורי ה-DNA ב 120 µL כל מאגר טה ע י ניעור כל שפופרת למשך 30 דקות כדי 1 h בטמפרטורת החדר.
  6. נקודה חשופה
    1. הכנת תקנים דנ א פלסמיד
      1. לדלל AAV וקטור הגנום פלסמיד דנ א כדי 10 ng/µL במים או מאגר טריס-HCl (10 מ מ, pH 8.0). קח 25 µL של דילול זה תקציר עם אנזים ההגבלה המתאימה עבור h 1 כדי linearize את פלסמיד ה-DNA, באמצעי אחסון התגובה של 50 µL.
        הערה: נעשה ערכה משוכפלות של מערכת העיכול (ראה שלב 3.6.4.1). האנזים המתאים צריך להיות אחד שחותך את הדנ א פלסמיד מחוץ לאזור מחייב בדיקה חשופה נקודה. לנוחיותכם, ה-DNA פלסמיד מדולל יכול להיות aliquoted (25 µL/צינור) ומאוחסן קפוא ב-20 ° C לשימוש עתידי. לעכל את פלסמיד DNA בזמן הצינורות רועדות בשלב 3.5.1. לא יותר מדי לעכל את פלסמיד DNA סטנדרטי.
      2. להוסיף µL 450 מים או טה הצינור המכיל את פלסמיד מתעכל DNA סטנדרטי ומערבבים היטב. העברת µL 70 של תערובת זו 1.5 mL microcentrifuge צינור עם µL 1,330 מים או טה לעשות מדולל פלסמיד סטנדרטי (pg 25/µL).
      3. בצע בטבלה 4 כדי ליצור סדרת דילולים טורי כפולה (600 µL tube). לערבב את דילולים ביסודיות על ידי vortexing על 5 s.
    2. Denaturing של תקנים, דגימות ה-DNA נגיפי
      1. להוסיף 600 µL של 2 x אלקליין פתרון כל דילול סטנדרטי. מערבבים היטב בעזרת vortexing עבור Incubate ס' 5-10 בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
      2. להוסיף 120 µL של 2 x אלקליין פתרון כל מדגם ה-DNA נגיפי. מערבבים היטב בעזרת vortexing עבור Incubate ס' 5-10 בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. הגדרת המנגנון חשופה נקודה
      1. בעזרת מספריים, חותכים קרום סופג (למשל, זטה-בדיקה) לגודל המתאים עבור מספר דוגמאות ותקנים. משרים את הקרום עם מים למשך 10 דקות לפני הצבתו על מנגנון חשופה נקודה. מכסים בארות שאינם בשימוש על המנגנון ממברנה.
        הערה: להתמודד עם הקרום עם פינצטה נקי. כדי לכסות את וולס ריק, הגיליון הגנה כחול בהיר שמגיע עם הקרום יכול לשמש. אל תאפשר את הקרום להתייבש לפני מחייב דוגמאות ותקנים. לקבלת פרטים נוספים על הרכבה ועל השימוש המנגנון, נא עיין ידנית המשתמש19.
      2. מוסיפים מים לבארות אשר יהיה טעון דגימות. החל מים ואקום ומשוך באמצעות הבארות כדי לבדוק שגיאות ובדוק שוב כאשר קבוע. שידת ההחתלה את הברגים תוך יישום ואקום כדי להבטיח אטימה חזק.
        הערה: איטום לא שלם עשוי לגרום דליפה לדוגמה בין הבארות.
      3. ברגע מים לגמרי שרד, לשחרר את הואקום לחלוטין (קרי, סעפת ואקום להיות פתוחים לחץ אוויר).
    4. העמסת סטנדרטים ודוגמאות למכשירים חשופה נקודה
      1. חלות µL 400 של כל פלסמיד מדולל DNA רגיל מכל קידוח, להפעיל ארבעה נתיבים של דילולים סטנדרטי. השתמש שני aliquots נפרדים של התקציר סטנדרטי, לטעון כל הכפילויות. החל µL 200/טוב של כל מדגם ה-DNA נגיפי.
        הערה: שימוש של µL ~ 40 הנותרות של דגימות שפגע בסימני, מדולל יכול להיות מוכן (למשל, 10-fold דגימות מדולל באמצעות µL 20 מדגם בתוספת 180 µL 1 x פתרון אלקליין) ודוגמאות מחק במידת הצורך.
      2. החל ואקום עדין יעבור את פתרונות ה-DNA את הבאר.
        הערה: ואקום לחץ צריך להיות מותאם על ידי חלקית פתיחת שסתום-כיוונית כך הלחץ ואקום מוחלת על הנקודה כתם מכשיר, כמו גם האווירה (קרי, עם הזרועות צימוד מוצב כ 45 ° זווית איפה זה עושה רעש יניקה חזק יותר).
      3. פעם השתמשתי כל הבארות, לשחרר את הואקום על-ידי התאמת את השסתום משולשת. להוסיף µL 400 1 x פתרון אלקליין מכל קידוח שהכיל סטנדרטים ודוגמאות. המתן 5 דקות לפני ההחלה מחדש ואקום כדי לרוקן את הבארות.
      4. החל מחדש את הואקום באותה דרך (ראה שלב 3.6.4.2).
      5. לפרק את המנגנון חשופה נקודה תחת ואקום להסיר את הקרום, לשטוף אותו עם 2 x SSC. במקום הקרום על מגבת נייר נקי עם הצד DNA-מחויב כלפי מעלה כדי להסיר עודפי 2 x SSC.
      6. UV-crosslink דנ א blotted הקרום עם crosslinker UV מתאים; הקרום מוכן כעת של הכלאה.
        הערה: ממברנות רטוב יכול לשמש עבור UV crosslinking. מיובש, UV-תפור ממברנות ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. מידע נוסף ניתן למצוא את הטבלה של חומרים.
  7. הכלאה של כביסה
    1. חממו המאגר הכלאה באמבט מים 65 ° C.
    2. Enzymatically תווית בדיקה DNA עם רדיואקטיבי α -32P dCTP, לטהרו באמצעות ערכות זמינים מסחרית על פי ההמלצה של היצרן.
      הערה: אנו משתמשים של 0.5 – 2.0 מכשיר בדיקה של אורך של אזור enhancer-יזם או חלבון-קידוד רצף הגנום הנגיפי kb. למרות פרוטוקול זה מנצל 32התווית על-ידי P רדיואקטיבי זונדי אות זיהוי, שאינו רדיואקטיבי chemiluminescent או פלורסנט רגשים יכול לשמש גם (עיין במקטע דיון ).
    3. את המקום הקרום בבקבוק הכלאה עם הצד מאוגד ל- DNA, יש לשטוף הקרום עם 5 מ"ל prewarmed מאגר הכלאה, ולמחוק את המאגר. להוסיף 10 מ ל מאגר הכלאה prewarmed ואז למקם את הבקבוק בתנור הכלאה מסתובב שוכן בגובה 65 ° C. סובב ≥5 דקות.
    4. חום-denature 20 µL של 10 מ"ג/מ"ל לכסנתם הרינג או זרע סלמון DNA פתרון והבדיקה 32התווית על-ידי P (≥ 107 cpm) למשך 5 דקות על ידי הנחת הצינורות על ערכה גוש חום ב- 100 מעלות צלזיוס. לאחר מכן snap-צ'יל אותם על קרח ≥2 דקות, בקצרה, ספין, לשמור על הקרח עד השימוש.
      התראה: עבור בדיקות DNA רדיואקטיבי, 1.5 mL צינורות עם פקקי בורג, o-ring יש להשתמש.
    5. להוסיף במהירות ה-DNA של הזרע שפגע בסימני ו בדיקה רדיואקטיבי למאגר הכלאה של הכלאה בקבוק, לנער את הבקבוק 10 s לערבב. להחזיר את הבקבוק לתנור 65 ° C, דגירה הבקבוק עם סיבוב ב 65 ° C עבור ≥4 h.
    6. לאחר סיום הכלאה, לעצור את הסיבוב, להסיר את הבקבוק הכלאה, ואז לשפוך את הפתרון בדיקה רדיואקטיבי לתוך צינור חרוטי 50 מ עם כובע ים עמיד בפני נזילה בחיבור. לאחסן את המכשיר במיכל המתאים מניחים במקרר המיועד בחומרים רדיואקטיביים.
      הערה: מאגר בשימוש הכלאה עם מכשיר בדיקה אשר מאוחסן ב 4 ° C מחדש ניתן לפחות 5 פעמים על ידי הנחת הצינור חרוט 50 מ עם כובע ים עמיד בפני נזילה בחיבור המכיל מאגר הכלאה באמבט מים 100 ° C למשך 5 דקות.
    7. לשטוף את הקרום עם מאגר לשטוף מחומם ל 65 ° C. להוסיף 20-30 מ של מאגר שטיפת הבקבוק הכלאה וסובב עבור 5 דק. חזור על זה לשטוף עוד 2 פעמים.
      הערה: למדוד רדיואקטיביות של שטיפת פתרונות ולתעד אותה במידת הצורך על ידי המכון המקומי.
    8. בעת שטיפת הקרום, המקום של זרחן הדמיה המסך על מחק תמונה במשך 5 דקות.
    9. לאחר לשטוף את השלישי, להסיר את הקרום מהבקבוק הכלאה, להסיר את מאגר עודף על הקרום עם מגבות נייר, ולמקם את הקרום מחזיק נייר פלסטיק שקוף. בדוק רדיואקטיבי אותות על קרום בעזרת מונה גייגר. חושפים את המסך פוספור נמחק הדמיה למוח 10 דקות ללון בהתאם עוצמת האות.
    10. סריקת המסך בעזרת תמונה פוספור סריקת המערכת ולקבל את הנתונים על עוצמת האות של כל נקודה.
  8. ניתוח נתונים
    1. צייר עיקול רגיל באמצעות גיליון אלקטרוני ונתונים ניתוח תוכנה (למשל, Excel).
      הערה: רגרסיה ליניארית יומן-יומן שימש כדי לצייר עיקול רגיל.
    2. לקבוע nanogram-שוות-ערך (ng-eq) עבור כל אחד דגימות ה-DNA נגיפי על ידי אינטרפולציה. Ng-eq הוא הכמות של פלסמיד הדנ א נהגה לצייר עיקול רגיל אשר מקבילה למספר של מולקולות DNA נגיפי. כאשר אורך פלסמיד ה-DNA הוא 8,000 bp, 1 ng-eq של חד-גדילי ה-DNA הנגיפי AAV מקביל 2.275 x 108 חלקיקים.
      הערה: ng-eq ניתן להמיר מספר נגיפים באמצעות המשוואות הבאות:
      משוואה לחישוב חלקיקי AAV חד-גדיליים; כימות DNA; נוסחה לגנטיקה מולקולרית.
      משוואה לחישוב חלקיקי AAV דו-גדיליים באמצעות אורך פלסמיד; נוסחה מדעית.
      מספר החלקיקים AAV מבוטא כמקובל "vg" (וקטור הגנום) או "DRP" (חלקיקי אני עמיד DNase).
    3. לחשב את AAV ריכוזי החומרים ההתחלתי. כי ה-DNA נגיפי blotted מייצג 66.7% נוסחת חישוב אחוזים: (320/400 × 200/240 × 100%) לניתוח נתונים. של ה-DNA נגיפי בחומרי המוצא, 1 ng-eq מקביל 1.7 x 109 חלקיקים/mL נוסחת חישוב משוואות מתמטיות, חלוקת יחס, כפל, סימון מדעי .
      הערה: תיקון זה לא נחוצה אם כל ה-DNA הנגיפי הכלול חומר המוצא הוא מחק על קרום ללא הפסד (ראה איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאה נציג של נקודה כמותיים שהכלים עבור כימות של מניות וקטור AAV מטוהרים, המיוצר בקנה מידה גדול מוצג באיור1. עם assay חשופה נקודה זו, נקבע את כייל של מלאי וקטור AAV2G9-CMV-GFP גדילי כפול. וקטור היה טהור על ידי שני סיבובים של צסיום כלוריד (CsCl) ultracentrifugation צפיפות-הדרגה ואחריו דיאליזה כפי שתואר לעיל20. באופן כללי, עבור מניות מטוהרים AAV וקטור, שלושה כרכים שונים של כל מניה וקטור AAV (למשל0.3 µL, 0.1 µL, µL 0.03 נקודות) נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדו ח זה, מתואר השירות של נקודה כמותיים מבחני חשופה ללמוד AAV AAPs ותפקידם capsid הרכבה. הידע שנרכש ממחקרים אלה יכולים לספק תובנות מפורט ההבדלים מולדת בתהליך AAV capsid הרכבה ותפקידה פונקציונלי של AAPs בין שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם. במובן זה, הנקודה קרוס-קומפלמנטציה AAV VP3-AAP כתם assay חשף כי הנחש AAV VP3 המוצג תלות קפדנית על התבטאות שלה AAP cognate להרכבה capsid שותף ולקדם כי הנחש AAP לא capsid הרכבה של heterologous אשר נגרמו מהזנים אליהם . התבוננות זו הוא מסקרן, כי AAV תלויי-AAP serotypes זה נחקרו בעבר (AAV1, 2, 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים שיאו שיאו-מאוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל סיפק לנו פלסמיד pEMBL-CMV-GFP. אנו מודים כריסטופר נג ווונג ג שמואל על קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי שירותי הבריאות הציבוריים מעניק (NIH R01 NS088399 ו- T32 EY232113).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BenzonaseMilliporeSigma1016970001מכונה Serratia marcescen endonuclease בטקסט הראשי.
DNase IRoche4716728001מכונה DNase I Enzyme A בטקסט הראשי.
DNase IInvitrogen18047019מכונה DNase I Enzyme B בטקסט הראשי.
DNase INew England BiolabsM0303Lהמכונה DNase I אנזים C בטקסט הראשי.
1.5 מ"ל מחוברים O-טבעת בורג כובע מיקרוצנטריפוגה צינורותקורנינג430909
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק05-408-129
15 מ"ל פוליפרופילן צינור חרוטיקורנינג352097
3 מ 'נתרן אצטטTeknovaS0298
50 מ"ל פוליפרופילן צינור חרוטיקורנינג430291
AAV-293 CellsAgilent240073קו תאים HEK-293 מותאם לאריזה של ויריונים AAV.
AccuGENE 0.5 M תמיסת EDTALonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Bio-Dot ApparatusBio-Rad1706545
בקר סרום אלבומיןMilliporeSigmaA3294
מרים תאיםקורנינג3008
כלורופורםMilliporeSigmaערכת
Wako Pure Chemical Industries295-50201זה משמש לכתמי נקודות כמותיים על וירוס מטוהר. אנו משתמשים רק בחצי נפח מכל הריאגנטים בכל שלב המומלץ לתוכנית פרוטוקול 2 במדריך שסופק על ידי היצרן.
דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM) - גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B CellsThermo Fisher Scientific18290015
אתנול 200 ProofDecon Labs2716
סרום בקר עובריVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095המכונה פוליסוכרוז 400.
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeissAxiovert 40 CFL
גליקוגןרוש10901393001
הרינג זרעDNA Invitrogen15634-017
צינורות הכלאהתרמו פישר סיינטיפיק13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare מדעי החייםImageQuant TL
L-גלוטמין 200 מ"מLonza17-605E
מגנזיום כלוריד הקסהידראטMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElectroporatorBio-Rad1652100
מיני עמודות DNA ספין מהירMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 תאוקטור Biolabs IncVPK-422
פניצילין/סטרפטומיצין 10K/10Kלונזה17-602E
פוספט חוצץ מי מלחלונזה17-516F
חשיפה להדמיית זרחןGE בריאות מדעי
שונים זרחן הדמיה מסךGE בריאות מדעי החייםשונים
פלסמיד מקסי קיטQIAGEN12162
פלטינה Pfx DNA פולימראזInvitrogen
11708013 PolyethyleniminePolysciences Inc23966-2
PolyvinylpyrrolidoneMilliporeSigmaP5288
Prime-It II ערכת תיוג פריימר אקראיתAgilent Technologies300385
פריימר AAP Forward (N25 נוקלאוטידים מהנוקלאוטיד הרביעי ב-AAP ORF, RE1 הוא אתר אנזים הגבלה לשיבוט): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer Primer
AAP Reverse (N25 הוא 25 הנוקלאוטידים האחרונים של AAP ORF, RE2 הוא אתר אנזים הגבלה לשיבוט): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
פריימר VP3 קדימה (N25 25 הנוקלאוטידים הראשונים של VP3 ORF, RE1 הוא אתר אנזים הגבלה לשיבוט): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer Primer
VP3 Reverse (N25 הוא 25 הנוקלאוטידים האחרונים של AAP ORF, RE2 הוא אתר אנזימי הגבלה לשיבוט): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
אנזימי הגבלה ניואינגלנד מעבדות
זרע סלמון DNAInvitrogen15632011
פיפטות סרולוגיותתרמו פישר סיינטיפיק13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
נתרן כלוריתרמו פישר מדעיS271-10
נתרן ציטראט Tribasic דיהידראטMilliporeSigmaC8532
T4 DNA פולימראזניו אינגלנד BiolabsM0203L
Thermal CyclerEppendorf6321000515
תרבית רקמות מטופלת 6 בארות
TrisBase Thermo Fisher ScientificBP152-5
טייפון FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-רווי פנולInvitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000נעשה שימוש במצב Crosslink אופטימלי, המספק מינון אנרגיית UV של 120 mJ/cm2.
ממברנה Zeta-ProbeBio-Rad162-0165
חילוץ DNA 372978 קלטת החייםשונות353046

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
  2. Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
  3. Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
  4. Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
  5. Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
  6. Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
  7. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  8. Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
  9. Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
  10. Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
  11. Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
  12. Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
  13. Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
  14. Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
  15. NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
  16. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  17. Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
  18. Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
  19. Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
  20. Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
  21. Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
  22. Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
  23. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  24. Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
  25. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  26. Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
  27. Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
  28. Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
  29. Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

AAVDNA

מאמרים קשורים