הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

13.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56767

⸱

11 באפריל 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Osteoncology and Rare Tumors Center, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Pathology Unit, Morgagni-Pierantoni Hospital, 3Unit of Surgery and Advanced Oncologic Therapies, Morgagni-Pierantoni Hospital

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול הבאים מתמקד הקמת תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה (STS). מודל זה יכול לעזור לנו להבין טוב יותר את רקע מולקולרי ופרופיל תרופתי של ממאירות נדירים אלה, שעשוי לייצג נקודת התחלה עבור מחקרי המשך שמטרתם לשפר את ניהול STS.

תקציר

סרקומות של רקמות רכות (STS) מייצגים קשת של ממאירות הטרוגנית עם האבחנה קשה, סיווג, ניהול. עד כה, זוהו יותר מ-50 סוגי היסטולוגית של אלו גידולים נדירים מוצק. לכן, בשל מגוון עצום שלהם שכיחות נמוכה, ההבנה שלנו של הביולוגיה של גידולים אלה הוא עדיין מוגבל. החולה-derived תרבויות מייצגים הפלטפורמה האידיאלית ללמוד פתופסיולוגיה STS ו פרמקולוגיה. לכן פיתחנו מודל פרה האנושי של STS החל מדגימות הגידול שנקטפו חולים שעברו כריתה כירורגית. תרביות תאים STS נגזר המטופל המתקבל דגימות כירורגי על ידי collagenase עיכול, מבודדת על ידי סינון. תאים היו נספרים, נזרע, השאירו למשך 14 ימים בתרבויות טפט רגיל, ואז שעובדו על-ידי ניתוח במורד הזרם. לפני ביצוע ניתוחים מולקולריים או תרופות, אושרה הקמת תרבויות העיקרי STS דרך ההערכה של תכונות cytomorphologic, כאשר היא זמינה, סמנים immunohistochemical. שיטה זו מייצגת כלי שימושי 1) ללמוד את ההיסטוריה הטבעית של ממאירות לקוי בחנו אלה ו 2) כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות במאמץ כדי ללמוד עוד אודות מנגנוני הפעולה שלהם.

מבוא

סרקומות של רקמות רכות (STS) כוללים קשת של נגעים הטרוגנית של המקור mesenchymal חשבונאות 1% של גידולים מוצקים כל1,2, סיווג חדש ארגון הבריאות העולמי מזהה הנוכחות של יותר מ 50 תת שונים3. בקרב אלו, histotypes הנפוצות ביותר הן adipocyte סרקומה או liposarcoma leiomyosarcoma, והיוו 15% ו- 11% של כל הבוגרים STS, בהתאמה4,5. למרות STS יכולים לפתח בחלקים שונים של הגוף, הגפיים ואת מקבץ הם האתרים הנפוצים ביותר, המתרחשים 60% ו-20% מהמקרים, בהתאמה6.

אבן הפינה של הטיפול למחלה מקומית היא כריתה כירורגית רחבה, בעוד היתרונות של טיפול כימותרפי אדג'וונט ו neoadjuvant עדיין אינם ברורים והם נחשבים רק במקרים נבחרים7. בהגדרה גרורתי, טיפול כימותרפי סטנדרטי של טיפול אבל מראה תוצאות מוגבלות8. הבנה טובה יותר של הביולוגיה המולקולרית של STS יעזור לשפר את האבחנה המבדלת הנוכחי, למטב את הטיפולים, ולזהות יעדים חדשים לטיפול.

בהקשר זה, בוצע מחקר לתוך סרטן במשך שנים רבות באמצעות תא מונצחים קווים9. מודלים ניסיוניים אלה הם בדרך כלל תרבותי ב טפט סטנדרטי תומך או מושתל לתוך מכרסמים immunodeficient להקים ויוו xenograft מודלים10. שורות תאים מונצחים מייצגים חומר לניהול, קל-אל-חנות שבה ניתן לבצע מספר מספיק של מחקרים. הם, למעשה, לפחות יקר, בשימוש נרחב ביותר כלי לימודי פרה11.

עם זאת, תא-קו המבוסס על סרטן הדגמים גם יש כמה מגבלות, למשל ממושך תרבות במערכת חד שכבתי עם מספר גדל והולך של מעברים מעניקה פנוטיפי, סחף גנטי, יצירת תאים פחות סביר כדי לסכם הגידול מפתח תכונות. יתר על כן, תרביות תאים קו להיכשל לשחזר את האינטראקציה לתא ואת crosstalk מולקולת איתות לחקות את התנהגות ביולוגית של גידולים, לאפיין את microenvironment הגידול. נושאים אלה מהווים את הבסיס של הפער הקיים בין תוצאות קליניות12.

לאור האמור לעיל, הריבית בתרבויות העיקרי נגזר החולה גדל13. אכן, הכריתה של רקמות ממאירות ונורמלי מפחיתה את הסיכון לאבד סרטן התא פנוטיפ והטרוגניות, ובכך מציע חומר המוצא זה נציג נוסף של microenvironment הגידול. יתר על כן, השימוש של דגימות הגידול טריים שנקטפו חולים שעברו כריתה כירורגית מאפשרת לנו לחקור גידולים יחיד וכדי להשוות נגעים שונים מאותו חלק של הגוף של המטופל14. מהסיבות הנ ל, תרביות תאים רקמות-derived לספק חומר יקר ללמוד הגידול פתופסיולוגיה ו פרמקולוגיה15,16,17, בפרט STS אילו שורות תאים סרקומה זמינים מסחרית זה מוגבל18 אנחנו ובכך אופטימיזציה שיטה להקים נגזר החולה STS התא הראשי תרבות החל בניתוח נכרת גידול רקמות13,19,20. השיטה שלנו מורכב disaggregating הדגימה הגידול לחלקים קטנים רקמות ואחריו דיסוציאציה רקמות אנזימטי לילה כדי לקבל השעיה תא בודד. למחרת, עיכול אנזימטי מופסקת על-ידי הוספת מדיה תרבות טריים, ההשעיה שהושג מסונן כדי להסיר שברי רקמת, תא-אגרגטים, ואת החומר מטריקס עודף או פסולת. לבסוף, שבריר של תאים סרטניים מבודד הוא cytospinned על גבי זכוכית שקופיות, קבוע ומאוחסן לניתוח במורד הזרם, שמטרתם לאשר הקמת תרבות ראשי STS מאת cytomorphological, immunohistochemical והערכה cytogenetic מולקולרית (למשל דגים ניתוח של הגברה MDM2 מייצג את האבחנה המבדלת סטנדרטית של liposarcoma היטב הבדיל, את liposarcoma dedifferentiated) 4. התאים הנותרים הם נזרע בתרבות טפט רגיל עבור ג'ין ביטוי מחקרים פרופיל תרופתי. כל הניסויים מתבצעים באמצעות נמוך המעבר תרבויות הראשי כדי למנוע את מבחר subclones סרטן ספציפיים, נותחו על ידי פתולוג מנוסה סרקומה. לכן יצרנו אנושית לחלוטין STS לשעבר-vivo דגם13,19,20. זה רב תכליתי, קל ידית דגם יכול לייצג כלי שימושי עבור סוגים שונים של מחקר פרה, למשל כדי לזהות סמנים מולקולריים חדשים עבור האבחנה והפרוגנוזה או כדי להרוויח הבנה עמוקה יותר של הפעילות ואת מנגנוני פעולה של סמים חדשים ואיכותיים המשמשים את הניהול של STS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

STS תאים מבודדים בגלל גידול המוני בניתוח טוחנות מחולים עם STS. הפרוטוקול אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית, מתבצע על פי ההנחיות הקלינית טוב את הצהרת הלסינקי. כל המטופלים נתן הסכמה בכתב כדי לקחת חלק במחקר. דגימות כירורגי נותחו על ידי פתולוג מנוסה סרקומה, מעובד בתוך 3 שעות של ניתוח.

1. הגידול הדגימה איסוף ועיבוד:

  1. איסוף דגימות הגידול בעזרת פתולוג סרקומה במיכל 100-מ ל שתן סטרילי עם 50 מ של DMEM גלוקוז נמוך בינוני אטום עם סרט פרפין.
  2. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שעות לאחר כריתה הגידול.
  3. בצע את כל השלבים הבאים תחת כיסוי סטרילי תרביות רקמה.
    1. לעקר את מכסה המנוע עם 70% אתנול, ללבוש כפפות סטריליות.
    2. לעקר את הפינצטה inox פלדה עם 70% אתנול (שימוש גזה סטרילי).
    3. להסיר את הסרט פרפין מהגורם שתן וזורקים.
    4. רחץ החיצוני של המיכל שתן עם 70% אתנול.
    5. פתח את צלחת פטרי מרובע.
    6. פתח את מיכל שתן, העברת דגימות הגידול לתוך הפטרי ריבוע באמצעות את הפינצטה סטיריליים inox פלדה.
  4. לשטוף את דגימות הגידול עם PBS פעמיים.
  5. פתח את אזמל כירורגי סטרילי.
    1. דק לגרוס את דגימות הגידול לחתיכות3 1-2 מ מ.
    2. לאסוף מטבע אחד של המדגם הכולל צינור 2-mL.
    3. להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט trizol (רכש) אל הצינור ומקפיאים מיד ב-80 מעלות צלזיוס (לדוגמה ישמש בניתוח במורד הזרם עבור הערכת ביטוי גנים STS).
  6. לאסוף את שארית החומר הגידול מגורר דק בשפופרת 15-mL.
    1. להוסיף 4 מ של collagenase מסוג I פתרון (סוג collagenase הוא מומס הציבורית, על ריכוז של µg 4/mL).
    2. לדלל את collagenase מסוג I פתרון עם 4 מ"ל של מדיה תרבות גבוהה DMEM (הריכוז הסופי של סוג collagenase הוא 2 µg/mL).
    3. סגור את הצינור 15-mL, חותם עם הסרט פרפין.
    4. שמכניסים את נקז 15-mL ב שייקר מתגלגל באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים מלהיב למשך 15 דקות להפעיל את מערכת העיכול.
    5. לאחר 15 דקות לאחסן את הצינור ניעור מתגלגל תחת זע תנאים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  7. למחרת היום שמכניסים את נקז 15-mL מתחת למכסה המנוע סטרילי.
  8. בעדינות לסנן התליה תא דרך מסנן סטרילי 100 מיקרומטר מחוברת לחלק העליון של צינור 50-mL.
  9. לשטוף את המסנן עם DMEM מדיה תרבות גבוהה עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
  10. למחוק את המסנן סטרילי 100 מיקרומטר, לסגור את שפופרת 50-mL ואת צנטריפוגה ב 225 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. למחוק את תגובת שיקוע על-ידי היפוך ברכבת התחתית.
  12. מחדש להשעות את התאים עם 1-2 מ ל DMEM גבוהה תרבות המדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: אמצעי האחסון תלוי כמות הדגימה הגידול מעובד.
  13. לספור את התאים עם תא Neubauer.
    1. לדלל את דוגמה 1:2 ב- trypan blue ולהשתמש µL 10 של הדילול לספור תאים.
    2. לספור לפחות פעמיים, לחשב את הממוצע של משכפל לדעת המספר הממוצע הכולל של התאים שנאספו.
  14. צלחת תאים בתרבות טפט רגיל-צפיפות של תאים/cm 80,0002.
    הערה: תמיד לכלול פקדים בניסויים. לבצע לפחות 3 משכפל טכני עבור כל תנאי. לבצע לפחות 2 משכפל ביולוגי. פרמקולוגיה פרה, ביטוי גנים, חלבונים ביטוי ניתוחים, ניסויים צריכה להתבצע עם מספר נמוך של תרבות קטעים בתוך 30-45 ימים של התא seeding כדי להימנע מאובדן סרטן התא פנוטיפים.
  15. הכנת הדוגמא cytological.
    1. לאסוף 100,000 בתאים µL 200 של מדיה תרבות גבוהה DMEM עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. פיפטה הפתרון (פיפטה µL 200) לתוך משפך חד פעמיות מאובזרים עם מסנן, רכוב עם זכוכית.
    3. פתח את cytocentrifuge והכנס את הדגימות.
    4. הפעל את cytocentrifuge ב g x 18.6 כעשרים דקות.
    5. למחוק את המשפך מצויד במסנן.
    6. לתקן את השקופיות אצטון 10 דקות ולאחריו כלורופורם במשך 5 דקות.
    7. לאחסן את השקופיות ב-20 ° C.
      הערה: להפשיר, מימה הדגימות לפני צביעת ולבצע ההכתמה ההוראות של היצרן. להכין משכפל טכנית לפחות 3.

2. תרביות תאים STS:

  1. לשנות מדיה פעם בשבוע (DMEM גבוהה תרבות מדיה בתוספת 10% סרום שור עוברית, גלוטמין 1%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין).
    1. למחוק את המדיום תרבות באמצעות פיפטה µL 200-1, 000.
    2. הוסף חדש בינוני טריים באמצעות פיפטה µL 200-1, 000.
    3. תא המעבר:
      1. ניתוק התאים בעת המפגש נמצא במרחק של-90%:
        הערה: STS תא תרבות הגברה צריכה להתבצע אחת לשבוע על בסיס התנאים תרבות.
      2. למחוק בינוני, לשטוף עם PBS ולהוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין 1 x ב- PBS
        הערה: הנפח של טריפסין בשימוש תלוי כמות תאים בתרבית שהושג.
      3. דגירה תאים למשך 3-5 דקות ב 37 º C.
      4. איסוף תאים מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה µL 200-1, 000.
      5. Pipette התאים מנותקת לתוך צינור 15-mL ולהוסיף 4 מ"ל של מדיה תרבות גבוהה DMEM עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין לעצור את התגובה אנזימטיות.
      6. צנטריפוגה-g x 225 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. למחוק את תגובת שיקוע.
      8. מחדש להשעות בגדר תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיה תרבות גבוהה DMEM עם סרום שור עוברית 10%, 1% גלוטמין ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
      9. זרע התאים צלחת תרבות חדשה או בקבוקון עם נפח סופי על פי הוראות היצרן.
        הערה: לא לפצל תאים יותר מ- 1:3.

3. במורד הזרם ניתוחים:

הערה: מגוון ניסויים שונים יכול להתבצע בעזרת המודל (ראו להלן). לכן, חשוב להחליט במהלך שלב העיצוב של המחקר ניתוחים אשר יבוצעו כך ניתן להכין מספר דוגמאות ומשוכפלת.

  1. התפשטות מבחני כגון MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד
  2. מבחני אפופטוטיים להיפגע כגון מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז (TdT) ניק סוף תיוג assay (TUNEL)
  3. ניתוח Immunohistochemical
  4. ניתוח ביטוי גנטי
  5. ניתוח תספיג חלבון
  6. אליסה assay
  7. תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח
  8. In vivo דגם xenograft

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תיכננו שיטה פשוטה כדי להשיג את הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה ולדווח כאן דוגמה של התוצאות המתקבלות על אחד ספציפי STS histotype13. הפרוטוקול שימש להקמת העיקרי תרבויות שונות histotypes STS כולל היטב הבדיל liposarcoma, dedifferentiated liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, מובחן fibromatosis סרקומה, העיקר desmoid pleomorphic.

שיעור ההצלחה של הק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במודלים פרה מוגדרת היטב יש צורך להבהיר את הרקע מולקולרית של גידולים, לנבא פרוגנוזה ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לחולי סרטן. זה חשוב במיוחד עבור גידולים נדירים כגון STS של מי הטרוגניות גבוה במונחים של מורפולוגיה, התנהגות תוקפנית פוטנציאליים, ומחקרים קליניים אתגרים ההבנה שלנו של STS ביולוגיה וניהול החולה21. יתר על כן, סרקומה מסחרי תא מהשורות זמין מגביל פרה חקירות קבוצת גידולים mesenchymal18. Ex-vivo דגמים מייצגים ובכך משאב יקר ערך מחקר על STS. פיתחנו מודל אנושית לח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות Gráinne טירני לסיוע העריכה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM גלוקוז גבוהEuroCloneECB7501L
סרום בקר עובריEuroCloneECS0180D
גלוטמיןגיבקו25030-024
פרפורמלדהיד 4% תמיסה מימית,מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית157-4-100
סטרפטומיצין פניציליןג'יבקו15140122
ריאגנט טריאזולAmbion Life-Technologies15596018
טריפסיןEuroCloneECB3052D
בדרגה EM

מקורות

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294(2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662(2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313(2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309(2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313(2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FISHMDM2
הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.