מאמר שיטה

מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

25 בינואר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

יש לנו בהצלחה שנוצר שני מבחני המצע ספציפיים γ-secretase. שני מבחני מבוססת תא המובאת כאן נועדו לכמת פעילויות אנזימטיות γ-secretase דרך הפלט של גחלילית לוציפראז כתבים.

תקציר

פיתחנו זוג כתב מבוססת תא מבחני ג'ין למדוד באופן כמותי את המחשוף γ-secretase של סובסטרטים ברורים. כתב יד זה מתאר הליכים בהם ניתן לעקוב אחר γ secretase-בתיווך המחשוף של APP-C99 או חריץ, באמצעות Gal4 מונחה יזם גחלילית לוציפראז כתב מערכת. מבחני אלה הוקמו על ידי stably משותפת transfecting תאים HEK293 עם הגן כתב לוציפראז מונחה-Gal4, או הרסיס Gal4/VP16-מתויגים ' C-מסוף של האפליקציה (APP-C99; תאים CG), או את Gal4/VP16-מתויגים ' החריץ-ΔE (NΔE; NG תאים). באמצעות אלה מבחני כתב במקביל, הראו כי מעכב ErbB2, CL-387,785, מעדיפים יכול לדכא γ-secretase המחשוף של APP-C99 בתאים CG, אבל לא NΔE בתאים NG. התגובות דיפרנציאלית הוצגו על ידי התאים CG ו- NG, כאשר מטופלים עם CL-387,785, מייצגים מאפיין המועדפת עבור γ-secretase מאפננים, תגובות אלה הן בניגוד הפאן-עיכוב של γ-secretase המושרה על ידי DAPT. המחקרים שלנו מספקים עדות ישירה כי ניתן להבחין γ-secretase פעילויות לקראת סובסטרטים בהקשר הסלולר. מבחני חדשים אלה ולכן ייתכן כלים שימושיים, גילוי תרופות טיפולים לספירה משופרת.

מבוא

צורות oligomeric של עמילואיד-β (Aβ) מאמינים כי הגורם העיקרי הקשורים ניוון מוחיים במוחם של חולים הסובלים מחלת אלצהיימר (AD)1. Aβ פפטידים מופקים על ידי המחשוף stepwise של חלבון עמילואיד קודמן (APP), תחילה לפי β-secretase ולאחר מכן ב- γ-secretase2. בעשור האחרון, גישות טיפוליות כלפי הטיפול של המודעה התמקדו למניעת ייצור Aβ3. הרוב המכריע של המחקרים התמקדו גם הגדלת הפעילות α-secretase, אשר ניתן למנוע γ-secretase המחשוף של APP, ובכך להקטין את הייצור של Aβ, או עיכוב של פעילויות β-ו/או γ-secretase4. למרבה הצער, לא בררניים עיכוב של β - או γ-secretases תוצאות תופעות לוואי בלתי נמנע כי הם עקב הפרעה תפקוד אחרים סובסטרטים פיזיולוגיים של β - ו γ-secretase5,6. לגבי מעכבי γ-secretase, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על הגילוי של מספר מאפננים כימי, גנטיים המווסתים Aβ הייצור תוך הפעלת אפקטים זניח על עיבוד וγ secretase-בתיווך חיוני חריץ7 ,8,9,10,11,12, עם זאת, הרפוי מוצלחת עדיין לא פותחו. לפיכך, בהמשך מסכי שיטתית הן מוצדקת לגלות מכפילי גנטי וכימיים הרומן זה באופן סלקטיבי יכול לווסת את עיבוד APP וγ secretase-בתיווך.

Γ-Secretase ידוע קליב יותר מ-90 חלבונים שונים המעוגנת ממברנה. בין אלה סובסטרטים הוא חריץ, שפעילותם היא קריטית עבור תא בנחישות גורל ובידול במהלך פיתוח13. באופן סלקטיבי להתכוונן APP וγ-secretase-מזורז עיבוד בהיעדרו של להשפיע על הרמה עיבוד יהיה חיוני ומזעור הקשורות חריץ תופעות לוואי של מעכבי γ-secretase, סלקטיביות זו נחשבת גורם העיקרי יהיה להכתיב את היעילות הביולוגי של פוטנציאל מאפננים γ-secretase לטיפול כרוני של המודעה. היו מספר נגזרות arylsulfonamide, כגון GSI-953 (begacestat) ועב מ- 708163 (avagacestat), נמצאו שהפגינו עיכוב חזק, סלקטיבי של γ-secretase14,15. מחקר קודם הראה כי עיכוב דיפרנציאלית של פצילות γ-secretase של האפליקציה, חריץ יכול להיות שנצפו שימוש assay מבוסס-אליסה כמותית בשילוב עם ויוו אימות באמצעות דג זברה16. יתר על כן, פרדיגמות assay מבוססת תא הוקמו לפנות את מידת הבררנות המצע פוטנציאלי של γ-secretase לכיוון APP ודרגה17,18. באמצעות פרוטוקולים דומה מהמתואר בזאת, לאחרונה גילינו מחלקה הרומן של (D)-leucinamides זה מנע בעוצמה לווסת את המחשוף γ-secretase של האפליקציה עם סלקטיביות ממעט דרגה19. יחד, זה אוסף של מחקרים מספק הוכחה-של-קונספט תומך התפישה. המצע סלקטיביות/הזמינות של γ-secretase יכול להיות כפופים אפנון כימי ואימות ניסיוני. עם זאת, פלטפורמות assay אלה מסתמכים בדרך כלל על המפרט תפוקה נמוכה יחסית וגישות מהגידולים שלא יכול לעמוד תקני התעשייה לתוכניות גילוי סמים.

יש לנו לאחרונה שנוצר לוציפראז מבוססת תא כתב ג'ין מבחני שיכול לקבוע באופן כמותי את פעילות קטליטית γ-secretase כלפי שני מצעים שונים, הרסיס C-מסוף חומצה אמינו 99 של האפליקציה (APP-C99) חוץ-תאית תחום שנמחקו חריץ פפטיד (NΔE). APP-C99 וגם NΔE היה בשימוש נרחב בשם דיאלקטריים ישירה של γ-secretase במבחני שונות. כדי ליצור הומוגניות ועקבית לוציפראז כתב ג'ין מבחני למחשוף γ-secretase של APP-C99 או NΔE, יצרנו נגזר HEK תא יציב שורה אחת (CG) המבטאת צורונים (כתב Gal4 לוציפראז מונחה יזם גחלילית Gal4-Luc), חלבון כימרי Gal4/VP16-מתויג APP-C99 (C99-GV). בנוסף, יצרנו עוד קו נגזר HEK תא יציב (NG) המבטאת צורונים Gal4-לוק ו מתויג-Gal4/VP16 NΔE (NΔE-GV). אנחנו עכשיו באמצעות מבחני הרומן המצע ספציפיים γ-secretase אלה, מספקות שיטה לכמת, להבחין בין פעילות קטליטית γ-secretase לכיוון סובסטרטים שונים (APP-C99 בתאים CG), או NΔE בתאים NG. יתר על כן, מבחני המצע ספציפיים γ-secretase נועדו תוליחתמ פלטפורמות הקרנה גבוהה-תוכן. מבחני החדש שנוצר γ-secretase אלה יכול לסלול את הדרך עבור גילוי מאפננים γ הרומן-secretase יכול לשפר את התפקוד הקוגניטיבי על-ידי דיכוי ייצור Aβ ללא העלאת עיכוב דרגה בלתי רצויים לטיפול הדור הבא של AD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מדידה של אותות כתב לוציפראז, אשר תואמות את המחשוף γ-Secretase של APP-C99 או NΔE

הערה: נא עיין על פרסומים קודמים על תיאורים מפורטים של הדור של CG ו NG תאים20,21.

  1. זרע תאים NG או CG (20, 000 תאים/טוב) על גבי microplates 96-ובכן-נפח סופי של 200 μL היטב במדיום הגידול המורכבת בינוני נשר שונה (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום של Dulbecco (FBS), blasticidin 5 μg/mL, אנטיביוטיקה μg/mL 250 (למשל zeocin), ואת μg/mL 200 hygromycin B.
    1. ספירת תאים hemocytometer.
    2. להעביר את microplates חממה2 CO humidified, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. הסר μL 100 של מדיום הגידול מכל קידוח.
  3. להוסיף 100 μL/טוב של הצמיחה בינונית המכילה טטרציקלין μg/mL 2 עם או 0.2% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) או אחרים הקשורים מעכבי ErbB1/ErbB2.
  4. דגירה תאים CG או NG שטופלו ב- microplates ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  5. הסר 150 מדיום הגידול μL/טוב microplates.
  6. הוספת ריאגנט assay לוציפראז μL/טוב 50 (ראה טבלה של חומרים).
  7. להעביר את microplates קורא microplate הפריה חוץ גופית.
    1. לשמור את microplates בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם עצבנות עדין.
  8. לקבוע את גחלילית לוציפראז (פל)-הנפלטים הפריה חוץ גופית באמצעות תוכנית מוגדרת מראש מאוחסנים לקורא microplate הפריה חוץ גופית.
    1. פתח את תוכנת בקרת מכשיר (ראה טבלה של חומרים לפרטים כלי).
    2. מתפריט 'כלי', בחר 'Luminometry'.
      1. תחת ההגדרות 'פרמטרים', בחר מסנן' מסנן פליטה ' טיק 'רגיל' ' צמצם פליטה, נכנסים '1' עבור ספירת הזמן, לחץ על 'אישור' כדי להגדיר את קריאת הארה.
    3. תחת הכרטיסיה 'כלי בקרה', גלול לאורך הרשימה של פרוטוקולים פעילים ובחר פרוטוקול מראש מאוחסנות עבור קריאת הפריה חוץ גופית.
    4. תחת לשונית 'חיים תצוגה', להגדיר את קנה המידה מתוך הרשימה הנפתח ובחר 'לוגריתם' או 'לינארית' עבור הסוג.
    5. תחת לשונית 'חום', בחרו 'Off' ' צלחת חימום.
    6. לחץ על לחצן 'התחל' כדי לבצע הפריה חוץ גופית את הקריאה.
    7. לפי הצורך, ייצוא תוצאות לתוך תבנית גיליון אלקטרוני באמצעות 'סייר' מוטבע בתוך תוכנת שליטה.

2. כימות של פעילות וγ-Secretase

  1. הגדר אות הפריה חוץ גופית הנפלטת CG או תאים NG שטופלו דימתיל סולפוקסיד 0.1% במדיום גידול המכילה טטרציקלין μg/mL 1 לבד כפעילות γ יחסית-secretase 100%.
    1. מעריכים רקע לומינסנציה מתאי CG או NG על ידי טיפול תאים עם מדיום הגידול שאינו כולל טטרציקלין.
  2. לנרמל לוציפראז אותות התאים CG או NG מתורבתים עם מדיום הגידול המכילה טטרציקלין μg/mL 1 ו μM CL-387,785 או 1 או 1 μM של DAPT עם האות לוציפראז הנפלטת דימתיל סולפוקסיד שטופלו CG או NG תאים (100% וγ יחסית-secretase פעילות, כמו מוגדרות ב- 2.1.)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עיכוב של ErbB2 מאת CL-387,785 באופן שונה יכול לקדם את העיבוד של APP-C99 על ידי Γ -secretase מבלי להשפיע על הרמה המחשוף
להקים assay מבוססת תא שיכול למדוד באופן כמותי את המחשוף הפרוטאוליטי של מצע מסוים γ-secretase, יצרנו את שורת התאים CG נגזר HEK293 על ידי תרביות תאים שותף יציב של טטרציקלין-inducible C-סופני Gal4/VP16-מתויג APP-C99, Gal4 מונחה יזם גחלילית לוציפראז כתב הגן. קו מקביל תא NG הוקמה גם כדי assay למחשוף γ-secretase של NΔE. בתאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מבטיח תוצאות ממשפט בשלב 1b של חיסוני aducanumab עבור לספירה הקימו בחוזקה את תפקיד קריטי Aβ בפתוגנזה של המודעה22 ולהציע כי גישות אנטי-Aβ הם עדיין אסטרטגיה קיימא עבור הפיתוח של תרופות אנטי-לספירה. כאן, אנו מתארים מבוססת תא מבחני לכימות תנועת proteolysis γ-secretase-מזורז של APP-C99 ו- NΔE שימוש גחלילית לוציפראז כתב במערכות. APP-C99 ו- NΔE סובסטרטים γ-secretase ביותר למד היטב שני, ביחד מייצגים שתי הפעילויות פתוגניים, פיזיולוגיים של γ-secretase13. הממצאים שלנו כי downregulation...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים המתקן הליבה של המכון של הסלולר, ביולוגיה אורגניזם, אקדמיה Sinica, על תמיכה טכנית. מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן (ביותר 103-2320-B-001-016-MY3 עד י'-F. ל'), התוכנית לחדשנות Translational ההתפתחות ביולוגיות – טכנולוגיית התומכת פלטפורמה ציר ערכת (NP7 ל י'-F.L.), ו Sinica אקדמיה (לי'-F.L.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קורא צלחות זוהר VictorLightPerkinElmer2030-0010
Class II, סוג 2 ארון בטיחות ביולוגיThermo Scientific1300 סדרה A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher12100046המרכיב העיקרי של מדיום גידול
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidinThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Hygromycin BGibco10687010
HemocytomerSigma-AldrichBR717805 אולדריץ'
96 בארות מיקרופלייטNunc156545
טטרציקליןסיגמאT7660
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SigmaD2650
מגיב בדיקת לוציפראז Steady-GloPromegaE2510
חממת CO2 לחRevcoUltima II
T-REx293 קו תאיםInvitrogenR71007
Wallac 1420 תוכנה גרסה 3.0תוכנת בקרת מכשירים PerkinElmerשל קורא המיקרו-פלטות הזוהר

מקורות

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

APPNotchHEK293CL 387 785DAPT

מאמרים קשורים