הקלטה Intracavernosal לחץ כדי להעריך את תפקוד זיקפה אצל מכרסמים

סיכום

Intracavernosal לחץ הקלטה (ICP) היא שיטה חשוב להעריך את הפונקציה זיקפה של חיות ניסוי. כאן, פרוטוקול מפורט מומחש על ההליך הקלטה של ICP catheterizing הפין crura, ואז חשמלית גירוי העצבים חלול בחולדות.

תקציר

אין-אונות (אד) מוגדר כחוסר היכולת להגיע או לשמור על זיקפה הפין, וזה הפך הפרעה שכיחה המיני הגברי. מכרסמים הם מועסקים על ידי מחקרים רבים לחקור הפיזיולוגיה/הפתולוגיה של תפקוד זיקפה. ניתן להעריך תפקוד זיקפה אצל מכרסמים על ידי מדידת הלחץ intracavernosal (ICP). בפועל, ICP ניתן לנטר בעקבות גירוי חשמלי של העצבים חלול (CNs). לחץ עורקי העורק הראשי (לחץ עורקי מרושע) משמש כהפניה ICP. באמצעות הקלטת פרוטוקולי ICP, ניתן למדוד פרמטרים מרכזיים רבים של תפקוד זיקפה של עקומת התגובה של ICP. המדידה של ICP מספק יותר מידע מאשר הבדיקה apomorphine-induced זיקפה הפין, הוא זול יותר מאשר ניטור telemetric corpus spongiosum הפין, הופך שיטה זו האחת הפופולרי ביותר להערכת תפקוד זיקפה. עם זאת, לעומת הבדיקה שבוצעה בקלות APO-induced בפונקציה זיקפה, הקלטות של ICP מוצלחת דורשים תשומת לב לכל פרט, תרגול, ההקפדה שיטת הפעולה. בעבודה זאת, מבוא ICP הקלטה בחולדות מסופק כדי להשלים את ההליך בצורה יעילה.

מבוא

אד מוגדר כחוסר יכולת להשיג או לשמור על זיקפה הפין, הפך להיות הפרעת מיניות גברית נפוצה¹. חיות ניסוי משמשים ומספקים מודלים לשחזור לחקור בפונקציה זיקפה². במשך זמן רב, מספר דגמים בעלי חיים גדולים יש כבר מועסקים על חקירת תפקוד זיקפה-^3,-^4,-⁵. למרות מכרסמים קטנים יחסית לעומת שאר בעלי החיים, הם משמשים גם לצורך המחקר של זכר זיקפה עקב מציג יתרונות מספר⁶. ראשית, המאפיינים המיניים פונקציונלי מורפולוגיים של בני האדם הם recapitulated בחולדות. שנית, לעומת חיות גדולות ששימשו מחקרים אד, מכרסמים אינם חסכוני יותר לרכוש, בית, ולשמור. שלישית, מהונדסים מודלים מכרסמים מספקים יתרונות במחקרים הבאים הדירים התנהגותיים, כמו גם neurophysiological. לכן, מכרסמים הפכו במהירות החיות הראשי המשמש במחקר של אונות גברית.

נהנה רקע גנטי טהור ותנאים תרבות עקבית, מודלים מכרסמים סיפקו נתונים באופן עקבי לשחזור^5,6,7,8. בין המחקרים זמינים רבים הקשורים בהיבטים רבים של פונקציות זיקפה, apomorphine (APO)-מבחן התגובה המזורזת זיקפה, במבחן התגובה של ICP חשמליים-לגירוי-induced הן השיטות הנפוצה ביותר המשקפים באופן אמין זיקפה הפונקציה^9,10,11,12. המבחן APO-induced בפונקציה זיקפה, שפותחה על ידי היטון. et al. ¹³, הוא ביו-assay אשר מנצל את התופעה כי מינהל apomorphine חולדות מעורר זקפה, שפתיים. כמו קלה, לא פולשנית, יציב ביו-assay להעריך תפקוד זיקפה, הבדיקה APO-induced בפונקציה זיקפה נעשה שימוש נרחב במחקרים רבים. עם זאת, assay הזה אינו משקף במידה מספקת איכות הזקפה או השינויים הדינמיים בזרימת הדם הקשורים של זיקפה בתגובה¹⁴. מדידות של ICP פותחו בתחילה על ידי קווינלן. et al. ¹⁵. בשיטה זו, קטטר ימוקם את העורק הראשי כדי למדוד לחץ דם סיסטמי, עוד קטטר מוכנס לתוך הקורפוס מנ להקליט את ICP. לפני או במהלך של ICP הקלטה, הסוכן vasoactive ו/או שדה חשמלי גירוי של גנגליון האגן הגדולות (MPG) או CN ניתנו לעתים קרובות חולדות¹⁴. Assay הזה היה כלי אמין עבור הערכת של טיפולים ותרופות עבור אד, צפוי לשמש כשיטת ההערכה חיוניים ב בעתיד⁶.

לעומת הבדיקה שבוצעה בקלות APO-induced בפונקציה זיקפה, הקלטות של ICP מוצלחת דורשים תשומת לב לכל פרט, תרגול, ההקפדה שיטת הפעולה. לכן, אנו מספקים תיאור מפורט של איך לבצע הקלטה של ICP.

פרוטוקול

בן שלושה חודשים ואני בת 18 בחודש ספראג-Dawley חולדות שימשו את המחקר הנוכחי. כל החיות שטופלו בהתאם להנחיות NIH על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על-ידי חיה מוסדיים מקומיים אכפת, ועדת האתיקה, במאמץ לצמצם את סבלם של בעלי החיים. הפרוטוקולים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת טק נאנג'ינג (Nanjing, סין).

העכברושים היו מחולקים לשתי קבוצות בהתאם לגיל שלהם ביצועים ראשוני במבחן APO-induced בפונקציה זיקפה לפני ההקלטה של ICP: קבוצת צעירים נורמלי (YN קבוצה) ואת זיקפה בגיל העמידה הקבוצה (קבוצת AE)¹⁰.

1. הכנה לפני הניתוח

1. באופן ידני לבצע זוג אלקטרודות דו קוטבית עבור ההקלטה של ICP (איור 1). קצת לכופף את הקצוות של אלקטרודות, להתאים את המרחק בין שתי אלקטרודות ל 1-2 מ מ רחב, כפי שמוצג באיור 1A.
2. להתחבר האלקטרודות ממריץ באמצעות שני תופסנים תנין (איור 1 א'ב').
3. להרכיב מערכת קטטר: ראשית, להתחבר מחט hypodermic 23 גרם צימוד 3-way עם אבובים, ולאחר מכן לחבר את צימוד מתמר לחץ. לאחר מכן, צרף מזרק 10-mL עד הסוף השלישי של צימוד לספק תמיסת הפרין.
4. בזהירות לבדוק נזילה לאחר מילוי כל המערכת עם תמיסת הפרין (200 U/mL). ופנו את צימוד 3-דרך לסגור את הערוץ מזרק או בערוץ מתמר לחץ (איור 1C).
5. הרם את המחט 20 ס מ הרמה של משטח עץ. ואז לכייל את הלחץ הקלטה למערכת 20 ס מ H₂O. לאחר מכן, העבר את הגובה של המחט כדי לאמת את הדיוק של מערכת הקלטה. חזור על הכיול עד לדיוק אושר.
6. להעביר את החולדות מהמתקן בעלי חיים לחדר הניתוח ולאחר לאפשר להם להיות מורגל לחדר הניתוח במשך לפחות 30 דקות.
7. כלי הנגינה בלוק ריססו עם 70% אתנול רק לפני הניתוח

2. ניתוח נוהל

1. עזים ומתנגד העכברוש עם זריקה בקרום הבטן של סודיום פנטוברביטל במינון של 45 מ"ג/ק"ג משקל גוף, לחכות 5-10 דקות לצבוט את האצבעות כדי לאשר של ההרדמה המתאים.
2. לגלח את הפרווה של הבטן והצוואר עם מכונת גילוח חשמלית, ולמקם את החולדה על גבו על כרית החימום.
3. נגב את אזור הניתוח עם כדורי צמר גפן ספוג פתרון 10% povidone-יוד ואחריו כדורי צמר גפן ספוג אתנול 70%. בנוסף, להחיל משחה אופטלמולוגיות כדי למנוע את העיניים מתייבשת.
4. Catheterize העורק השמאלי הראשי.
   1. לתפוס את עור הצוואר עם מלקחיים, עושים חתך אופקי באמצע בצוואר. תחתכי את השרירים בקפידה לחשוף את העורק השמאלי הראשי, לבודד מקטע 5 מ מ של כלי השיט.
   2. בזהירות להפריד את העורק הראשי העצב התועה באמצעות מלקחיים, לצייר בתפר משי תחת העורק הראשי, לשים עניבה משוחררת בקצה סימטרית של כלי השיט ולאחר מכן ליצור קשר הדוק אחר בקצה הגולגולת של כלי השיט.
   3. . הקליפה תהדק את הכלי עם מלחציים בולדוג מעל התפר כדי לעצור את זרימת הדם.
   4. בזהירות אעשה חתך על הספינה עם מספריים המיקרוכירורגית והוסף את צנתר עורקי לכיוון הלב בסיועם של לנתח מיקרו הוק, מלקחיים.
   5. הדקו את הקשירה סימטרית חופשי סביב הקטטר לאבטח אותו. הסר את המלחציים בולדוג לשחזר את זרימת הדם.
5. לבודד את CN ומניחים האלקטרודה
   1. הרם את העור והשרירים של הבטן עם זוג מלקחיים. עם המספריים ויבתר, לחתוך הבטן התחתונה אל הפין עושים חתך קו האמצע.
   2. לדחוף בעדינות את המעי עם ספוגית לתוך החלק העליון של חלל הבטן.
   3. שלפוחית השתן עם זוג מלקחיים ומשוך את שלפוחית השתן של חלל הבטן. חושפים את האונות הגחון של הערמונית, אשר ממוקם בחלק הבטני של השופכה.
   4. משוך החוצה האונות הגחון של ערמונית, שלפוחית הזרע, צינור הזרע כדי לחשוף את האונה הגבי של הערמונית. למצוא את הנקודה של הידבקות של צינור הזרע, הערמונית.
   5. הפרד את החלל שבין הערמונית צינור הזרע. בזהירות חושפים את הקפסולה הסיבית, אשר ממוקם האחורי אל נקודת צומת של הערמונית, צינור הזרע. אז למצוא גנגליון האגן הגדולות (איור 2).
      הערה: גנגליון האגן הגדולות ועצבים חלול ניתן לראות על פני השטח של הערמונית.
   6. אזור CN יבש בזהירות עם מקלון סטרילי. בזהירות לבודד לעשוק את החוצפה ממש חלול עם הפרעה דו קוטבית האלקטרודות.
6. Catheterize Crura השמאלי
   1. לחתוך חתך קטן בעור של הפין עם מספריים ויבתר ולאחר מכן בקפידה מערטל את העור של הפיר הפין.
   2. לנתח את מערכת השרירים הפין תילומית. למצוא את הענף העליון של עצם לעצם האגן.
   3. חושפים את השריר bulbospongiosus, אשר מכסה את הנורה spongious.
   4. לחלק השריר bulbospongiosus של השריר ischiocavernosus באמצעות מלקחיים מעוקל.
   5. בזהירות לבודד את השריר ischiocavernosus עם מלקחיים המעוקל, ולאחר מכן לחתוך את השריר ischiocavernosus לחשוף את מעטה לבן albuginea של הקורפוס מנ.
   6. בעקבות הכיוון האנטומי של מנ הקורפוס, בזהירות את המחט לתוך הקורפוס בכל דרך albuginea tunica לבן.
      הערה: זהו שלב חיוני עבור צנתור מוצלחת. כמות קטנה של מלוחים heparinized יכול להיות מוזרק, הפין נפוח להתייחס, אם המחט הוכנס כראוי.
   7. בזהירות לשחרר את המחט ולהימנע כל הזזה של מחט או שיבוש של הצינור המחבר. לפקח על דליפה כלשהי.

3. לעורר את CN

1. פתח את התוכנית תוכנה להקלטה אות לחץ, להתחיל את ההקלטה אות לחץ.
2. קבע את הפרמטרים של הגירוי: הרץ 15, רוחב של 5 אלפיות השנייה, 5 וולט, ומשך s 60. לעורר CN בתדר של הרץ 15 עם רוחב הדופק של 5 אלפיות השנייה.
   הערה: עלייה חדה של ICP יכול להיות שנצפו תוך יישום של גירוי חשמלי.
3. לאפשר מרווח זמן של 30 דקות מנוחה בין stimulations. המספר המרבי של גירוי ברציפות בכל בעל חיים הוא שלוש פעמים.

4. סיום ההליך

1. לאחר ההקלטה, לנהל המתת חסד על-ידי הזרקת מנת יתר של סודיום פנטוברביטל במינון של 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף. לאשר את מותו של חולדות באמצעות בדיקת לחץ עורקי שלהם. הסר את החולדות, ולנקות את כלי הניתוח.

5. ניתוח נתונים

1. לשמור, לייצא את הנתונים מתוך התוכנה. התגובה בדרך כלל מבוטא כיחס של ICP ללחץ מערכתי כלומר עורקי (מפה). היחס של שיא ICP/מפה מחושב כדי להעריך את תפקוד זיקפה.
2. מאגר נתונים של חולדות לפחות חמישה, ולנתח בתוכנות סטטיסטיות. ההבדלים נחשבים משמעותיים מבחינה סטטיסטית כאשר p < 0.05, באמצעות מבחן t של סטודנט.

תוצאות

מחקרים רבים הראו כי אין-אונות, יישון זכרים הופך להיות בעיה נפוצה. עם זאת, טיפול רפואי מוגבל בניהול של זיקנה אד¹⁶. דגמים מכרסם של אד זיקנה, טיפולים רבים נבחנים על פונקציה זיקפה של חולדות בגיל העמידה. כפי הצגנו לעיל, ניתן להשתמש במבחן הקלטה של ICP לבידול החיות אד מכלל האוכלוסייה של חיות ניסוי, שהוא גם יקר כדי לכמת את ההשפעה של טיפול פוטנציאלי או סמים על תפקוד זיקפה.

כמופיע ב איור 3A

דיון

כאמצעי ישיר של תפקוד זיקפה, ICP היא שיטה אמינה¹⁴. זה מאפשר הרכישה של נתונים ב- ICP הבזליים, שיא ICP, הרמה של ICP, וכמובן, detumescence הזמן, משך התגובה, וכו '. מלבד אלה ישיר נמדדו פרמטרים, ישנם מספר פרמטרים אינדקס אחרים: (1) "T80", הפעם כדי להגיע 80% לשיא של ICP; (2) "D20", הפעם כדי להקטין עד 20% של שיא ICP; (3) "ΔT80", קצב הגידול בלחץ (לשניה) ב T80; (4) "ΔD20", הקצב של ירידה בלחץ (לשניה) ב D20. פרמטרים אלה מאפשרים כימות של כל שלב ואת איכות התגובה של ICP, אשר ניתן לשקף את ההשפעה של המחלה,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>חיה
חולדות			: Sprague-Dawley גיל: 2-3 חודשים
חולדות			: Sprague-Dawley גיל: 15-18 חודשים
שם	Company	>Catalog	Comments
<חזק>ריאגנטים
מי מלח	Sigma-Aldrich, S7653		ממיסים 8.5 גרם נתרן כלורי במים מזוקקים
תמיסת נתרן פנטוברביטל	Sigma-Aldrich, P3761		ממיסים 1 גרם ב-100 מ"ל מי מלח
Povidone-iodine	BTP Pharmaceutical Co. Limited		10% (V/V)
אתנול	China National Pharmaceutical Group Corporation (SINOPHARM)		70% (V/V)
Heparin	Sigma-Aldrich, H3149		ממיסים 20000U heparin ב-100 מ"ל מי מלח
<חזק>שם	<חזק>חברה	><חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>חומרים
מחט היפודרמית	שאנדונג Weigao קבוצה פולימר רפואי ושות', בע"מ	מזרק 23G
	שאנדונג Weigao קבוצה פולימר רפואי ושות', בע"	מ 10 מ"ל
תלת כיווני פקק	צ'נגדו מכשיר	מפעל TSK 01
אלקטרודה	צ'נגדו מכשיר מפעל	JST-1
צינור קטטר	צ'נגדו מכשיר במפעל	PE-10, PE-50
מספריים הפעלה	שנחאי ציוד הפעלה מפעל	J22010, J22020
מספריים להפעלה עיניים	מפעל ציוד הפעלה בשנחאי	Y00010, Y00020
מלקחיים עיניים	מפעל ציוד הפעלה בשנחאי	JD1010, JD1020
MicroScissors	מכשירי דיוק עולמיים	WAA260
תפר משי	שאנדונג Weigao קבוצה פולימר רפואי ושות', בע"מ	5-0
<חזק>שם	<חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>ציוד
ממריץ	נאנג'ינג מדיז מדע וטכנולוגיה בע"מ (דגם 4C501H)		15 הרץ, דופק של 5 אלפיות השנייה, 5 וולט, משך של 60 שניות ומרווח של 5 דקות
מערכת עיבוד איסוף אותות רב ערוצית	Nanjing medease מדע וטכנולוגיה ושות', בע"מ (דגם 4C501H)		מודל לחץ דם
מתמר לחץ	בייג'ינג Xin Hang Xing Ye טכנולוגיה מסחר חברה בע"מ (דגם YP100)		40KPa