Method Article

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

DOI:

10.3791/56799

⸱

January 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים הוא היבט חובה עבור ריפוי הפצע. יצירה מלאכותית פצעים בדגמים בעלי חיים למחקר לעיתים קרובות תוצאות בפרוצדורות ניסיוני יקר ומסובך, בעוד פוטנציאלי חסר דיוק. In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק הפלטפורמה המתאימה עבור חוקר ההתנהגות נודדות תא ריפוי הפצע, את ההשפעה של טיפולים על תאים אלה. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת בתנאים שאינם-confluent; עם זאת, גישה זו אולי לא מזכירים ריפוי בתנאים טבעיים הפצע. לשבש את תקינות אפיתל באמצעים מכניים יוצר מודל מציאותי, אך עשוי לעכב את היישום של טכניקות מולקולריות. כתוצאה מכך, טכניקות במיקרוסקופ מבוסס הם אופטימליים ללימוד נדידת תאים אפיתל במבחנה. כאן אנחנו מפרטים שתי שיטות ספציפיות, וזמינותו גירוד פצע מלאכותי, וזמינותו קבלה העברה מלאכותית, תועמד נתונים כמותיים ואיכותניים, בהתאמה, על הביצועים הנדידה של תאים אפיתל.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים דרוש לריפוי הפצע, כפי שהוא אחראי על הסגר הסופי של הפער אפיתל ושיקום של פני השטח שיבשו1. ביצוע פצעים מלאכותי בבעלי חיים מאפשר להקים את ההעתק של תהליך מורכב זה ליד בתנאים פיזיולוגיים2. עם זאת, גישה זו לעתים קרובות התוצאות נהלים ניסיוני יקר ומסובך, שעשוי להיות חסרי דיוק לחקר תהליכים ברורים, בשל אופיו המורכב של תהליך ריפוי פצע.

In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק אלטרנטיבה מועיל חייתיים לחקור את התפקיד כי תאים אלה לשחק ב ריפוי הפצע ואת ההשפעות של טיפול להתנהגות הנדידה התא. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת על ידי טכניקות מולקולריות באמצעות התרבויות הלא-con....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מלאכותי הפצע Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים

  1. הכנת טפט תא
    1. עובד תחת תנאים סטריליים, זרע ולגדול Mv1Lu או HaCaT תאים אפיתל מבחנות תרבות באמצעות בתוספת-סרום בינוני. רענן בינוני פעם כל 24-48 שעות. לאחר תאים להגיע למפגש 80%, ניתוק תאים באמצעות של השיטה המתאימה, כלומר, trypsinization9.
      הערה: Mv1Lu HaCaT שורות תאים אפיתל מתורבתים באמצעות EMEM ו- DEMEM תרבות בינוני, בהתאמה, בתוספת 2 מ מגלוטמין ו מודגרות ב 37 ° C עם אווירה מבוקרת של 5% CO2. כל קו תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-4 x 104

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפצע מלאכותי Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים: הערכת גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) קידום של ההעברה:

EGF היא משרן ידועים של התפשטות תאים אפיתל, הגירה, ובכך פקד חיובי לכימות תנועת הגירה קידום. Monolayers תא Mv1Lu, HaCaT שימשו מבחני מאפס הפצע, טיפול קדם תמונות התקבלו. לאחר חיסון עם 10 ננוגרם למ"ל EGF, התאים היו מודגרות עבור 19 h לפני קיבוע ותמונות שלאחר הטיפול. התפשטות נשמר עד למינימום על ידי שמירה על תנאי רעב סרום. ערכות והאיות שלאחר הטי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על העור או קרום רירי השיבושים, הפונקציה מכשול משוחזר על ידי הפעולות של סוגי תאים רבים, לרבות fibroblasts תאים אפיתל ואת המערכת החיסונית. בצמדים, תאים אלו עוברים מתחם פרוצס מעורבים אפופטוזיס, התפשטות, בידול, חשוב, פיברובלסט ואפיתל תא ההעברה, אשר הוא מנגנון האולטימטיבי האחראי על שיקום של הרקמה שיבשו את סגירת הפער אפיתל שטחי1,12 וכך, לומד נדידת תאים עוזר בדיוק לתאר את התנהגות פיזיולוגית של תאי אפיתל, תוך קביעת גם את הפוטנציאל modulatory של טיפולים הפצע ריפוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו רוצים לתת תודות לחברים ישנים יותר של המעבדה המסייעים לשפר, לשכלל את הטכניקות האלו למצבו בפועל: ד ר סיליה מרטינז-Mora; ד ר אנה Mrowiec, ד ר קטלינה רואיז-Cañada, ד"ר אנטוניה אלקאראז-גארסיה.... . אנחנו חבים החולים Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca לתמיכה בחריפות את הפיתוח של טכניקות אלה. גם אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III, Fondo דה Investigaciones Sanitarias. תוכנית Estatal אני + D + אני ואת אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי-Subdirección גנרל דה Evaluación y מטאליסט de la Investigación (מענק מס: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos פדר "Una בדרך זו דה ש אירופה". אנו מודים גם למד דה מורסיה, IMIB-Arrixaca ו- FFIS עבור מנהלי תמיכה וסיוע. לבסוף, אנחנו רוצים לתת ת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, צרפתL0102-500אופציונלי 10% תוסף FBS
Eagles' s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662Fאופציונלי 10% תוסף FBS
L-גלוטמיןLonzaBE17-605Eלשימוש ב-2 מ"מ
סרום בקר עוברי (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ארה"בDE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049לדלל לפי הצורך
פולי-L-ליזיןסיגמא-אולדריץ', St לואיס, מיזורי, ארה"בP9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Sambs (DPBS) (10x)Gibco by Life Technologies14200-067לדלל ל-1x
צלחות תרבית של 24 בארותBD FALCON//SARSTED734-0020
צלחות תרבית 6 בארותSARSTEDT83-3920
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בE9644משומש 10 ng/mL
כיסוי עגול זכוכיתMENZEL-GLÄ SERMENZCB00120RA020עומק שדה קצר
סכין גילוח מחוזק מס' 743Martor (דרך VWR)MARO743.50
200 ומיקרו; l קצות פיפט תרסיס סטריליVWR732-0541
20 ומיקרו; l טיפים פיפט תרסיס סטריליVWR732-0528
מצלמה דיגיטלית משולבת מיקרוסקופ ניגודיות פאזהמוטיק ספרדמצלמת Moticam 2300 3.0 M פיקסל USB 2.0; מוטיק אופטי AE31
מיקרוסקופ קונפוקליZEISS Microimaging, גרמניהLSM 510 META
10 ס"מ צלחת תרביתBD FALCON353003
ארנב פוליקלונלי אנטי ג'ון נוגדןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-1694משומש 1:100
אנטי ארנב IgG (עז פוליקלונלית) AF 488InvitrogenA11008משומש 1:400
Hoechst-33258סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב14530משומש 1:1000
Alexa Fluor 594 פלואידין (במתנול) (אדום)InvitrogenA12381משומש 1:100
סרום בקר אלבומיןסנטה קרוז ביוטכנולוגיהSC-2323
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בT9284
חלב רזהBD DIFCO232100
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות, ארה"במהדורה 1.50i
Zen LSM 510 תוכנת עיבוד תמונהZEISS Microimaging, גרמניהמהדורה 5.0 SP 1.1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290, Suppl . S1-S11 (1998).
  3. Alcaraz, A., et al. Amnio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Cell MigrationWound Healing AssayArtificial Wound ScratchMigration Front AssayPhase Contrast MicroscopyFluorescence MicroscopyImage Processing SoftwareVariance FilteringThreshold AdjustmentFill Holes

Related Articles