Method Article

פרוטוקול ניסיוני לזיהוי תפקוד מיטוכונדריאלי בהפטוציטים שנחשפו לחומרי הדברה אורגנוכלורין

DOI:

10.3791/56800

⸱

September 16th, 2020

 ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine, Institute of Toxicology, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Modern Toxicology of Ministry of Education, School of Public Health, Nanjing Medical University, 3Center of Gallbladder Disease, Shanghai East Hospital, Institute of Gallstone Disease, Tongji University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) על תפקוד המיטוכונדריאלי בהפטוציטים חשוב לחקור את המנגנון של OCPs גורם להפרעות מטבוליות. נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי פונקציית המיטוכונדריה הכבד.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי תפקוד המיטוכונדריאלי הכבד להבנה טובה יותר של הגורם להפרעות מטבוליות הנגרמות על ידי חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) בהפטוציטים. תאי HepG2 נחשפו β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) במשך 24 שעות במינון שווה ערך של חשיפה פנימית באוכלוסייה הכללית. Ultrastructure בהפטוציטים נבדק על ידי מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM) כדי להראות את הנזק של המיטוכונדריה. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5'-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP) בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. עוצמת המיטוכונדריה פלואורסצנטית לאחר מוכתם על ידי בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי נצפתה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תגובת לוציפרין-לוציפראז שימשה לקביעת רמות ATP. MMP זוהה על ידי צבע cationic JC-1 וניתח תחת ציתימת זרימה. OCR נמדד עם מנתח שטף extracellular. לסיכום, פרוטוקולים אלה שימשו לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים עם לחקור נזקי המיטוכונדריה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשפעות של חומרי הדברה אורגנוכלורין (OCPs) על בריאות, למשל התערבות הרבייה, רעילות חיסונית, שינויים מטבולייםנחקרו בעבר 1,,2,3. השיטות לזיהוי חילוף חומרים תאי ולגלות תפקוד מיטוכונדריאלי אפשרו למדענים להבין את התפקיד של תפקוד המיטוכונדריה (כלומר.רמות STAT3 מיטוכונדריאלי, לקטאט, pyruvate, יחס לקטר-pyruvate, קואנזים Q10, דליפת פרוטון מיטוכונדריאלי, bioenergetics, biogenesis, ודינמיקה) בתחומים כגון הזדקנות, השמנת יתר, סוכרת, תפקוד לב וכלי דם,סרטן, רעילותבטיחות 4,5,6,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים ופרוטוקולי הניסוי בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות ואושרו על ידי הוועדה האתית המקומית של האוניברסיטה הרפואית של נאנג'ינג.

1. מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי על ידי TEM

  1. איסוף תאי HepG2
    1. זרע HepG2 תאים ב 100 מ"מ כלים. לאחסן ב- 37 °C ו- 5% CO2.
    2. תאי עיכול עם 0.25% EDTA בצינור 1.5 mLEP.
    3. צנטריפוגה ב 1000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT). זרוק את הסופרנטנט.
    4. לאסוף 4-6 x 105 תאי HepG2.
  2. להוסיף 1 מ"ל של 5% גלוטרלדהייד (ממס: מים מזוקקים כפולים) עם פיפטות דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
  3. הוסף ושטוף ב-4 שינויים של מאגר פוספט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיטוכונדריה cristae של תאי HepG2 שנחשפו β-HCH נפגעו במידה ניכרת. המיטוכונדריה המפוזרת התרחבה במתינות, בצורה לא סדירה, ורכס המיטוכונדריה נעלם עם ארכיטקטורה מיטוכונדריאלית חריגה יחסית (איור 1).

עוצמת הפלואורסצנס הירוקה הממוצעת, המייצגת את המיטוכונדריה, ירדה בתאי HepG2 החשופים ל-β-HCH(איור 2), כמו גםברמות ATP(איור 3). עוצמת הפלואורסץ ורימת ה-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קריטי להצלחת פרוטוקול הזיהוי הוא השימוש במגוון שיטות ניסיוניות כיסו את המחקר מפנוטיפ למנגנון. במחקר זה, תאי HepG2 היו תרבותיים DMEM עם פניצילין וסטרפטומיצין ו 10% סרום של פר העובר. כאשר תאים הגיעו 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) נוספו ותווספו במשך 24 שעות. השתמשנו לראשונה TEM אשר הראה את השינויים ultrastructural hepatocyte הנגרמת על ידי OCPs נציג, β-HCH, מראה את הפגיעה של מבנה המיטוכונדריה (איור 1). יתר על כן,הסתערות פלורסנט .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס' 81573174, 81570574); קרן הנוער המצטיינים של מחוז ג'יאנגסו (SBK2014010296); פרויקט המחקר של משרד החינוך הסיני (213015A); פיתוח התוכנית האקדמית עדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו (PAPD), פיתוח מרכזי הדגל של מוסדות להשכלה גבוהה ג'יאנגסו; ותכנית הפרויקט הפתוח של המעבדה לכימיה סביבתית ואקוטוקסיקולוגיה (KF2015-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה FEITecnai G2 Spirit Bio TWINהדמיה ברזולוציה גבוהה, ניגודיות גבוהה, תצפית והדמיה במינון נמוך, תצפית בטמפרטורה נמוכה, ביצועים אנליטיים יוצאי דופן, אוטומציה לנוחות וביצועים
Mito-Tracker GreenBeyotimeC1048Mito-Tracker Green הוא בדיקה פלואורסצנטית ירוקה מיטוכונדריאלית שניתן להשתמש בה לצביעה פלואורסצנטית ספציפית לתאים חיים.
מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזרZeiss700Bהעיצוב קומפקטי, יציב, נתיב האור הוא הקצר ביותר, דיוק אור גבוה, טכנולוגיה יצירתית וטכנולוגיית סריקה מתוחכמת יחד כדי לייצר תמונת דגימה תלת מימדית מושלמת.
ערכת בדיקת ATP משופרתשל BeyotimeS0027כדי לזהות רמות ATP (אדנוזין 5'-טריפוספט) בתמיסות, תאים או רקמות נפוצות. ניתן לפצל תאים ודגימות רקמה להשלמת הכנת הדגימה, רגישות לזיהוי עד 0.1 ננומול / ליטר, ניתן לשמור על כימילומינסנציה למשך 30 דקות.
לומינומטרBertholdCentro LB 960Luminometer הוא גלאי כימילומינסנציה, דגימת הבדיקה עצמה יכולה להיות קלה, אין צורך לעורר. לומינומטר הוא המכשיר שמזהה כימילומינסנציה.
ערכת בדיקת חלבון BCABeyotimeP0012ערכת בדיקת חלבון BCA היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לאיתור ריכוזי חלבון.
קורא רב-מצביTECANInfiniteM200קורא Multimode משמש לזיהוי הסכמה לחלבון.
ניתן להשתמש בערכת בדיקת ATP משופרת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79(2015).
  2. Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial FunctionHepatocytesOrganochlorine PesticidesHepG2 CellsTransmission Electron MicroscopyFluorescence MicroscopyFlow CytometryExtracellular Flux AnalyzerATP LevelsOxygen Consumption Rate

Related Articles