מאמר שיטה

חלקיקים מגנטיים-DNA מחייב ניתוח לפי פיזור אור דינאמי, Electrophoretic

DOI:

10.3791/56815

⸱

9 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, 2Central European Institute of Technology, Brno University of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של חלקיקים מגנטיים והערכה של תכונותיהם מחייב הדנ א באמצעות פיזור אור דינאמי ו electrophoretic. שיטה זו מתמקדת ניטור שינויים גודל החלקיקים, polydispersity שלהם, פוטנציאל זטה משטח החלקיקים אשר משחק מייג'ור תפקיד הכריכה של חומרים כגון ה-DNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד של דנ א באמצעות חלקיקים מגנטיים הוא תחום בעל חשיבות גבוהה במחקר ביוטכנולוגיה וביולוגיה מולקולרית. פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של חלקיקים מגנטיים דנ א איגוד באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS), פיזור אור electrophoretic (ELS). ניתוח לפי DLS מספק מידע חשוב על המאפיינים physicochemical של חלקיקים כולל גודל החלקיקים, polydispersity פוטנציאל זטה. השנייה מתארת את המטען משטח של החלקיק אשר ממלא תפקיד חשוב ב איגוד אלקטרוסטטית של חומרים כגון ה-DNA. . הנה, ניתוח השוואתי מנצלת שלושה שינויים כימיים של חלקיקים, microparticles והשפעתם על איגוד ה-DNA ו • תנאי. שינויים כימיים על ידי הקנים polyethylenimine, triethoxysilane orthosilicate ו- (3-aminopropyl) tetraethyl נחקרות. מאז ה-DNA תערוכות מטען שלילי, הוא צפוי כי פוטנציאל זטה משטח חלקיקים יקטן בעת איגוד ה-DNA. הקמת אשכולות צריך להשפיע גם על גודל החלקיקים. על מנת לחקור את היעילות של החלקיקים בבידוד, • תנאי ה-DNA, החלקיקים מעורבבים עם ה-DNA ב pH נמוך (~ 6), חוזק יוניים גבוהה וסביבה התייבשות. חלקיקים נשטפים על מגנט, אז ה-DNA הוא eluted על-ידי מאגר טריס-HCl (ה-pH = 8). ה-DNA עותק מספר מוערך באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (PCR). פוטנציאל זטה, גודל החלקיקים, polydispersity ונתונים PCR כמותי מוערכים, בהשוואה. DLS הוא שיטת ניתוח זה מוסיף פרספקטיבה חדשה תהליך ההקרנה של חלקיקים עבור בידוד של דנ א של תובנה ותמיכה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד ה-DNA הוא אחד הצעדים החיוניים ביותר בביולוגיה מולקולרית. בפיתוח שיטות החילוץ חומצת גרעין יש השפעה רבה על השדות המתעוררים גנומיקה, metagenomics, אפיגנטיקה ו transcriptomics. יש מגוון רחב של הביו-טכנולוגיה אפליקציות לבידוד DNA כולל רפואי (משפטית/אבחון וכלים prognostic סמנים ביולוגיים) ויישומים סביבתיים (metagenomic המגוון הביולוגי השכיחות של הפתוגן, מעקב). יש כבר הגדלת הביקוש כדי לטהר ולבודד את הדנ א מחומרים שונים, בצורות שונות כגון דם, שתן, אדמה, עץ, סוגים אחרים של דגימות. 1 , 2 , 3 , 4

ננו, מיקרו-חלקיקים בגודל מתאימים בידוד ה-DNA בשל השטח שלהם גבוהה, במיוחד כאשר הם יכולים להיות משותק על ידי שדה מגנטי. המאפיינים physicochemical של חלקיקים, כמו למשל גודל או תשלום, יכול להשפיע באופן משמעותי את היכולת שלהם לאגד היעד מולקולות. 5 כדי לשפר עוד יותר את הכריכה של מולקולות וכדי לייצב חלקיקים, שינויים כימיים שונים (משטח ציפוי) יכול להיות מנוצל. האסטרטגיות השונות רבים עבור איגוד מסווגים לפי אינטראקציות קוולנטיות, הלא-כך. 6 גודל החלקיקים משפיע ישירות על תכונותיהם מגנוט, ואילו החלקיקים קומפוזיציה התפורות על ידי שילוב של מתכת, סגסוגת וחומרים אחרים יכולים להשפיע על צפיפות, נקבוביות ואת השטח שלה. 7 אין שום דרך אמינה כדי למדוד את משטח הטעינה של חלקיקים קטנים. במקום זאת, ניתן למדוד פוטנציאל חשמלי על המטוס הגולשות (מרחק מן השטח ננו-חלקיק). 8 ערך זה נקרא זטה פוטנציאליים, זהו כלי חזק שבדרך כלל משמשת להערכת יציבות ננו - ו microparticle ויה DLS. 9 מאז שהערך שלו אינו מאוד, תלויים לא רק ה-pH יוניים חוזק ואנליזת הסביבה, אלא גם את מאפייני השטח של החלקיקים, היא יכולה גם להוכיח את השינויים במשטח זה נגרמת על ידי האינטראקציה בין חלקיקים, מולקולה של ריבית. 10

מצד שני, מבנה ה-DNA בתנאים יבשים (טופס א'-DNA) המוצגים הדחוס הייצורים החיים המאפשרים שלה משקעים (צבירת) בהשוואה ל בדרך כלל מתרחשת טופס B-DNA. אלקטרוסטטית (יוניים ו- H-בונד) הם הכוחות העיקריים שליטה הכריכה של ה-DNA לחומרים אחרים בשל שלהם פוספט sterically נגיש ובסיסים חנקן (במיוחד גואנין). 7 , 10

בעבודה זאת, מנותחים שלושה שינויים כימיים נציג של חלקיקים מגנטיים, microparticles (איור 1 א'). השיטה של סינתזה, שינוי כימי של חלקיקים, microparticles מתואר. פתרון מחייב, כי הסכמי לעקרונות תיאורטיים למשקעים דנ א (pH כוח יונית, התייבשות), משמשת להערכת איגוד ה-DNA ו • תנאי. ה-PCR כמותי משמש כדי להעריך את היעילות • תנאי ה-DNA חלקיקים נציג ו microparticles (איור 1B). גודל החלקיקים, polydispersity אינדקס, פוטנציאל זטה הם פרמטרים חשובים המשמשים כדי להמחיש את השינויים physicochemical המתרחשות על פני השטח של חלקיקים (איור 1C). חשוב להדגיש על אפיון כימי משטח חלקיקים מגנטיים. שלב זה היה מעבר להיקף של פרוטוקול זה, ניתן להחיל מספר טכניקות מודרניות כדי לחקור את היעילות של שינויים כימיים. 11 , 12 , 13 , 14 ספקטרוסקופיית מעבר פורייה (FTIR) ניתן להשתמש כדי להעריך את ספקטרום אינפרא-אדום של חלקיקים משטח להשוות אותה. הספקטרום של מכפילי כימי חינם. Photoelectron הספקטרומטריה (XPS) היא טכניקה נוספת שיכול לשמש כדי לזהות הרכב היסודות של השטח גשמי. ניתן להשתמש בשיטות אחרות אלקטרוכימי, מיקרוסקופיים, ספקטרוסקופיות לשפוך האור על האיכות של סינתזה של חלקיקים. עבודה זו מדגיש מבט חדשה לניתוח אינטראקציות DNA-מגנטית חלקיקים באמצעות DLS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה חלקיקים מגנטיים

  1. סינתזה של חלקיקים מגנטיים התייצב עם ציטראט (MNPs)
    1. להוסיף 20 mmol של FeCl 3 ∙ 6-אייץ '-2 O (5.406 גרם) ו mmol 10 של FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 גרם) ב- 20 מ ל מים מזוקקים זוגי דם לא מחומצן (ddd מים). מערבבים מתקבל פתרון נמרצות בתוך תחת האווירה 2 N באמצעות קדירות מכני עד מתקבל פתרון שקוף.
    2. תחת ערבוב מכנית מהירה, להוסיף 150 מ ל 1 מ' NH 4 הו, טיפה על ידי ירידה באמצעות משפך יורד (קח 1 h או יותר אם יש צורך). להעביר את הפתרון לתוך כלי מעון לאחר כל NH 4 או מתווסף. לדפוק את הפתרון כלי השיט, חום ב 75 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות
      התראה: NH 4 או מסווג כמו מאכל ומסוכנים לסביבה.
      הערה: להכין NH פתרון 4 או כיתה גבוהה 28% NH 4 או במים באמצעות מים רווית.
    3. לאסוף את התמיסה שחור באמצעות מגנט ושטוף אותה באמצעות 100 מ של מים ddd. חזור על 3 פעמים. להוסיף 50 מ של 0.5 M tri-סודיום ציטרט וגופרית והרכבו, כדי לזרז. לדפוק את כלי הקיבול.
      הערה: השתמש רווית תמיסת tri-סודיום ציטרט וגופרית והרכבו.
    4. לפזר מחדש את התמיסה דרך sonication (35 קילו-הרץ, משרעת של 100%) וקיבול החום ב 80 ° C עבור ה 1
      הערה: יש צורך sonicator של מתח מספיק.
    5. ומצננים את הפתרון לטמפרטורת החדר. לאסוף את התמיסה באמצעות מגנט ולהסיר תגובת שיקוע. מחדש לפזר בוץ ב 50 מ של מים ddd באמצעות sonicator (35 kHz, משרעת של 100%).
    6. העברת aliquots (~ 25 מ ל) לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ולהוסיף 20 מ של אצטון. צנטריפוגה ב g 2400 x 10 דקות ולהסיר supernatants.
    7. לפזר מחדש את התמיסה, dialyze פתרון נגד מים באמצעות משקל מולקולרי נמוך ניתוק דיאליזה המכשיר (500-1, 000 Da) של אמצעי אחסון מתאימים עבור ה 24
      הערה: הכן את התקן דיאליזה על פי יצרן ' דרישות s.
  2. סינתזה של חלקיקים מגנטיים שופרת מסועף polyethylenimine (MNPs_PEI)
    1. להוסיף 2 מ של MNPs שהושג פתרון (~0.1 g/mL) לתוך גביע זכוכית. להוסיף 38 מ ל מים ddd, sonicate (35 kHz, משרעת של 100%) ההשעיה (10 דקות).
    2. תחת ערבוב מכנית מהירה, להוסיף 10 מ של 10% בענף polyethylenimine (kDa 25 בממוצע). מוסיפים את פתרון ה 3 הבאים
    3. לאסוף לזרז באמצעות מגנט ולהסיר את תגובת שיקוע. לפזר מחדש את התמיסה במים ddd 20 מ. חזור 5 פעמים ואז sonicate את המתלים הסופי (35 kHz, משרעת של 100%).
  3. סינתזה של חלקיקים מגנטיים חלקיקים שופרת סיליקה (MNPs_TEOS)
    1. להוסיף 10 מ של MNPs שהושג פתרון (~0.1 g/mL) לתוך גביע זכוכית. להוסיף 60 מ של מים ו- 130 מ של אתנול. Sonicate פתרון ולהוסיף 6 מ של 28% NH 4 או.
    2. תחת ערבוב מכנית מהירה, להוסיף 1 מ"ל של tetraethyl orthosilicate. מוסיפים את פתרון ה 12 הבאים
    3. לאסוף את התמיסה שחור באמצעות מגנט, לשטוף אותה באמצעות 50 מ של אתנול (3 פעמים), 50 מ ל מים (3 פעמים). מחדש לפזר חלקיקי ב 10 מ"ל של ddd מים, ההשעיה (35 kHz, משרעת של 100%) sonicate.
  4. סינתזה של חלקיקים מגנטיים ששינה עם קבוצות אמינו (MNPs_APTES)
    1. הוסף 5 מ של MNPs_TEOS שהושג פתרון (~0.1 g/mL) לתוך גביע זכוכית. להוסיף 45 מ"ל מים, 50 מ של אתנול. Sonicate פתרון (35 kHz, משרעת של 100%).
    2. תחת ערבוב מכנית מהירה, להוסיף 0.5 מ ל (3-aminopropyl) triethoxysilane. מוסיפים את פתרון ה 3 הבאים
    3. לאסוף את התמיסה שחור באמצעות מגנט, לשטוף אותה באמצעות 50 מ של אתנול (3 פעמים), 50 מ ל מים (3 פעמים). מחדש לפזר חלקיקי ב 5 מ של ddd מים, ההשעיה (35 kHz, משרעת של 100%) sonicate.

2. מגנטי סינתזה Microparticles

  1. סינתזה של microparticles מגנטי התייצב עם ציטראט (MMPs)
    1. להוסיף 25 מ של 2 מ' יודע 3 מ"ל של 1 מ' KOH, מ 205.875 ל ddd מים לתוך כלי מעון. להוסיף 6.675 מ של 1 מ' מכל 4 במהלך בחישה מגנטית. מיד העברת כלי אמבט מים טרופה (90 ° C) במשך 2 ח'
      הערה: להכין יודע 3 ו KOH פתרונות ddd מים.
    2. ומצננים את הפתרון לטמפרטורת החדר. לאסוף את התמיסה שחור באמצעות מגנט ושטוף אותה באמצעות 50 מ של מים ddd (5 פעמים). להוסיף 50 מ של 0.5 M tri-סודיום ציטרט וגופרית והרכבו, כדי לזרז. לדפוק את כלי הקיבול.
    3. Redisperse את התמיסה דרך sonication (35 קילו-הרץ, משרעת של 100%) וקיבול החום ב 80 ° C עבור ח' 1 התמיסה שחור בגוביינא באמצעות מגנט ושטוף אותה באמצעות 50 מ של מים ddd (פי 10).
    4. לשנות MMPs עם קנים polyethylenimine (MMPs_PEI), סיליקה (MMPs_TEOS) וקבוצות אמינו (MMPs_APTES) דומה MNPs לפרוטוקול. עיין בסעיפים 2.2, 2.3 ו- 2.4, בהתאמה לפרטים נוספים-
  2. סינתזה של microparticles מגנטי שונה עם קנים polyethylenimine (MMPs_PEI)
    1. הוסף 5 מ של MMPs פתרון (~0.1 g/mL) לתוך גביע זכוכית. הוסף 38 מ ל מים ddd, sonicate את הפתרון (35 kHz, משרעת של 100%, 10 דקות). תחת ערבוב מכנית מהירה להוסיף 10 מ של 10% בענף polyethylenimine (kDa 25 בממוצע). מוסיפים את פתרון ה 3 הבאים
    2. לאסוף את התמיסה באמצעות מגנט ולהסיר את תגובת שיקוע. Redisperse התמיסה ב- 20 מ ל מים מזוקקים כפול. חזור 5 פעמים ואז הפתרון הסופי (35 kHz, משרעת של 100%) sonicate.
  3. סינתזה של microparticles מגנטי שונה עם סיליקה (MMPs_TEOS)
    1. הוסף 5 מ של MMPs פתרון (~0.1 g/mL) לתוך גביע זכוכית. להוסיף 60 מ של מים ו- 130 מ של אתנול. Sonicate ההשעיה (35 kHz, משרעת של 100%) ולהוסיף 6 מ של 28% NH 4 או.
    2. תחת ערבוב מכנית מהירה, להוסיף 1 מ"ל של tetraethyl orthosilicate. מוסיפים את פתרון ה 12 הבאים
    3. לאסוף את התמיסה שחור באמצעות מגנט, לשטוף אותה באמצעות 50 מ של אתנול (3 פעמים), 50 מ ל מים (3 פעמים). Redisperse חלקיקים ב 5 מ ל מים ddd, ההשעיה (35 kHz, משרעת של 100%) sonicate.
  4. סינתזה של microparticles מגנטי שונה עם קבוצות אמינו (MMPs_APTES)
    1. להוסיף 3 מ"ל של פתרון MMPs_TEOS (~0.1 g/mL) לתוך גביע זכוכית. להוסיף 45 מ"ל מים, 50 מ של אתנול. ההשעיה (35 kHz, משרעת של 100%) sonicate.
    2. תחת ערבוב מכנית מהירה, להוסיף 0.5 מ ל (3-Aminopropyl) triethoxysilane. מוסיפים את פתרון ה 3 הבאים
    3. לאסוף את התמיסה שחור באמצעות מגנט ולשטוף אותו באמצעות 50 מ של אתנול (3 פעמים), 50 מ ל מים (3 זמן). Redisperse חלקיקים ב- 3 מ ל מים ddd, ההשעיה (35 kHz, משרעת של 100%) sonicate.

3. מגנטי חלקיקים בגודל ניתוח באמצעות DLS

כלי
  1. גודל החלקיקים במים
    1. שימוש DLS שחל זווית גלאי פיזור אחורי (173 °), אורך גל קרן של 633 ננומטר.
      הערה: הגב פיזור DLS הוא מתאים דגימות מרוכז בו ניתן להימנע פיזור מרובות. לצד פיזור (גלאי זווית 90 מעלות), פיזור קדמי (גלאי זווית 15°) DLS מתאימים עבור חלקיקים קטנים יותר, מעורב חלקיקים, בהתאמה.
    2. מוקדמת למדידה במים, sonicate חלקיקים עבור מינימלית 3
      הערה: השתמש הפתרון מדולל של החלקיקים. למטרה זו, מערבבים µL 9.6 של חלקיקים עם 96 µL של מים-
    3. בקפידה פיפטה µL 50 של חלקיקים פתרון לתוך latex פוליסטירן חיטוי רפואי ולמנוע היווצרות בועות.
      הערה: עבור כל דגימה, להשתמש cuvette חד פעמיות (ראו טבלה של חומרים).
    4. הערה הבהירות של cuvette הכיוון של קרני האור. הכנס את התא בעל מדגם ולסגור את התא.
    5. השתמש בפרמטרים הבאים למדידה: טמפרטורה: 25 ° C; מקדם שבירה של שלב ואנליזת (ברזל): 2.344; מקדם שבירה של הסביבה ואנליזת (מים): 1.333
      הערה: לבצע מדידה של מדד השבירה באמצעות משאבות-מעבדות לקבלת תוצאות מדויקות יותר, במיוחד בעת פיתוח חומרים רומן או היברידית.

4. הכנת מלאי ה-DNA, חלקיקים מגנטיים, מאגר איגוד

  1. מניות ה-DNA
    1. שימוש 10 מ מ טריס-HCL מאגר (pH = 8) דילול ואחסון של ה-DNA. השתמש דגימת דנ א רגיל, זה יכול להיות מוגבר במיוחד עם פרוטוקול ה-PCR ישירה במעבדה (עיין בסעיף 5.2 עבור התגובה הגדרות ותנאים). כדי להגביר את זוג בסיסים 498 (bp) של הגן xis מקונטרול λ bacteriophage, השתמש תחל את הבאים. קדימה פריימר: 5 ' - CCTGCTCTGCCGCTTCACGC - 3Ɔ הפוך פריימר: 5 ' - TCCGGATAAAAACGTCGATGACATTTGC - 3 '
    2. PCR לטהר המוצר באמצעות ערכת טיהור DNA מסחרי.
      הערה: תשואות קיטים מסחריים באמצעות הליך מבוססי עמודה סיליקה > 100 ng/µL לטהר את הדנ א.
    3. למדוד ריכוז ה-DNA בשיטת spectrophotometric (ספיגת-260 ננומטר). לדלל מלאי ה-DNA של עותקים 11 10/µL שהומלץ מעל לפתרונות עבודה של 10 10 10 9, 10 8 ו 10 7 עותקים/µL.
      הערה: מספר העותקים של המוצר PCR ניתן לחשב לפי המשוואה הבאה, בהנחה הממוצע משקל מולקולרי הוא 650 Da עבור כל bp:
      DNA עותקים/µL = (הכמות ב- ng/µL * 6.022x10 23 עותקים/mol) / (498 bp * 650 גר'/מול של bp * עונה 1 פרק 10 9 ng/g)
  2. חלקיקים מגנטיים
    1. לאפשר חלקיקי המשקעים ללא המגנט ולהסיר את תגובת שיקוע. לערבב 1:20 יחס v/v של חלקיקים מגנטיים עם מים ddd (חלקיקים: מים).
      הערה: גישה המבוססות על אמצעי האחסון משמש לתיאור כמויות של חלקיקים מגנטיים מאז שווה המוני MNPs ו- MMPs היו ברצון קשה להשוות.
  3. מחייב מאגר
    1. להכנה מהירה של 0.75 מ' סודיום אצטט-HCL פתרון (ה-pH = 6), מערבבים 1 מ"ל של 3 מ' סודיום אצטט עם 3 מ של 1 מ מ HCL.
      הערה: כל הפתרונות בשימוש האיגוד ניתן לאחסן 4 ° ג הערה טמפרטורה נמוכה מגביר באופן משמעותי מחייב במיוחד במקרה של אתנול פתרון. בזהירות לשלוט הטמפרטורה של פתרונות טובים יותר הפארמצבטית והדיוק של ההקרנה.

5. בדיקת יעילות של ה-DNA בידוד באמצעות כמותיים PCR

  1. בידוד ה-DNA על ידי ששונה MMPs או MNPs
    1. להשתמש צלחת 96-ובכן, מגנט אישית לצלחת 96-ובכן לניסויים נפח קטן.
    2. השתמש התערובת פתרון מחייב הבאים: 8 µL שינויים MMPs או MNPs, 10 µL סודיום אצטט-HCl (0.75 מטר, pH = 6), 60 µL של 85% אתנול, 10 µL DNA (10 10 עותקים פתרון).
    3. מיקס טוב מאת pipetting ומניחים את הצלחת על המגנט למשך 3 דקות. בעוד הצלחת על המגנט, להסיר את הפתרון ולהוסיף µL 100 של 85% אתנול לרחצה.
    4. הסר אתנול.
      הערה: לאפשר האתנול להתייבש במשך כמה שניות, אך אל תתנו החלקיקים יתר יבש או להראות סדקים. אם החלקיקים יתר יבשה יהיה קשה להמיס עם פתרון • תנאי.
    5. הסר את הלוחית של המגנט ולהוסיף µL 40 של פתרון • תנאי. מערבבים היטב בעזרת pipetting. מניחים את הצלחת בחזרה על המגנט ולאסוף eluted DNA (~ 37 µL). לאחסן eluent ב-20 ° C עד ניתוח נוסף.
  2. ה-PCR כמותי
    1. להשתמש תחל ששימשו להכין מלאי DNA בשלב 4.1.1 לכמת עותקים של הגן xis, לפי הפרוטוקול מאת חדאד ואח. 10
    2. להכין מיקס מאסטר פתרון לפי כמות דגימות להיבדק, ולאחר מכן להפיץ את התערובת לתוך המבחנות או צלחת 96-ובכן רקע לבן-
    3. השתמש הכמויות הבאות עבור אמצעי אחסון מלאה של תערובת PCR µL 20: פולימראז µL 10 / intercalating צבע התערובת (ראה טבלה של חומרים), דגימת דנ µL 2, 2 µL קדימה פריימר (10 מיקרומטר), µL 2 הפוכה פריימר (10 מיקרומטר)
    4. להגדיר את thermocycler לפי התוכנית הבאה: 95 ° C עבור 120 s, 40 מחזורי (95 ° C 15 s, 64 ° C 15 s, 68 מעלות צלזיוס במשך 45 s), 68 מעלות צלזיוס במשך 5 דק
    5. שימוש triplicates עבור תקנים ודוגמאות, לחשב את הסף מחזור ולבנות עיקול רגיל כדי להעריך את מספר העותקים של DNA לאחזר בכל מדגם. הכלי המשמש כאן מבצע זאת באופן אוטומטי.
    6. כאן, מספר העותקים של ה-DNA מוערך עבור אמצעי האחסון • תנאי מוחלט (µL ~ 40). אחוז הדנ א לאחזר המתאים לסכום המקורי הוסיף מחייבת פתרון (לגמרי עותקים 11 10) יכול להשתנות מעבר למרווח 0 ל- 100.

6. דנ א-מגנטית חלקיקים מחייב ניתוח באמצעות DLS

  1. איגוד של DNA
    1. עבור נפח גדול ניסויים (בצינור 1.5 מ ל), להשתמש התערובת פתרון מחייב הבאים: 96 µL ששינה MMPs או MNPs, 120 µL סודיום אצטט-HCl (0.75 מטר, pH = 6), 720 µL של 85% אתנול, 120 µL DNA (10 10 עותקים פתרון) או 120 µL טריס-HCL המאגר (10 מ מ, pH = 8) עבור פקד.
  2. ניתוח פוטנציאל זטה
    1. הכן שני מחייב פתרונות, אחת עם ה-DNA ואחרת עם טריס-HCL מאגר עבור פקד שהומלץ בשלב 6.1.1. כדי למנוע היווצרות בועות, בזהירות פיפטה µL 800 של תערובת איגוד לתוך נייד חד פעמי.
      הערה: השתמש cuvette חד פעמית למדידה של פוטנציאל זטה משטח (ראו טבלה של חומרים).
  3. השתמש בפרמטרים הבאים למדידה על מכשיר DLS: מודל Smoluchowski F(ka) של 1.5, טמפרטורה: 25 ° C, שבירה של שלב ואנליזת (ברזל): 2.344, מקדם שבירה של הסביבה ואנליזת (מים): 1.333.
    הערה: הקצב של אינטראקציה של חלקיקים DNA-מגנטית משפיע ישירות את המדידה של משכפל. מידה יחיד על ידי המכשיר לוקח s 60-70. כאן, המכשיר היה הורה לקחת 10 מדידות עם 1 דקות במרווחי זמן השהיה. פשטות, התוצאות יוצגו בזמן = 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ו 18 דקות מתוך הקריאה הראשונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול המתוארים כאן סינתזה, שינוי של חלקיקים מגנטיים, חלקיקים מגנטיים שש היו מסונתז וניתח עבור איגוד ה-DNA. סיכום של הניתוח מוצג בטבלה 1. על ידי השוואת גודל החלקיקים במים, מחייב פתרון, ברור כי כל החלקיקים נצברת מחייב פתרון על ידי 2-22 קיפולים. כמה חלקיקים נוספים מצטברים כדי קיפולים יותר בנוכחות DNA; אולם זה היה לא ישירות בקורלציה עם אחזור ה-DNA מזוהה על-ידי ה-PCR כמותי (טבלה 1). השוואה של פוטנציאל זטה (10 מדידות במרווחים ~ 2 דקות) של חלקיקים בפק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה, היו העקרונות התיאורטיים להסביר מחייב DNA חלקיקים מגנטיים באמצעות פוטנציאל זטה תחת שאלה. הפרוטוקול מתאר את סינתזה של שינוי של חלקיקים מגנטיים ו- microparticles. שיטת ההכנה של פתרון ה-DNA ואיגוד פקד, מתוארים גם. שתי אסטרטגיות מוצגות כאן להקרנה של ה-DNA-החלקיקים אינטראקציות: ה-PCR כמותי של DLS מתקרב. DLS מספק ושלושה האינדיקטורים של שינויים physicochemical חלקיקים: גודל החלקיקים, ואינדקס polydispersity פוטנציאל זטה. שינויים בגודל החלקיקים להצביע ישירות צבירה או התפוררות. ערך האינדקס Polydispersity מתאר את התפלגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמיכה הכלכלית על ידי קרן המדע הצ'כית (פרוייקט GA CR 17-12816S) 2020 CEITEC (LQ1601) הוא הודה באופן משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ברזל (III) כלוריד הקסהידראטסיגמא-אולדריץ'207926סינתזת חלקיקים מגנטיים
ברזל (II) כלוריד טטרהידראטסיגמא-אולדריץ'380024סינתזת חלקיקים מגנטית
ברזל (II) סולפט הפטהידראטסיגמא-אולדריץ'F8263סינתזת חלקיקים מגנטיים
אצטוןפנטה10060-11000סינתזת חלקיקים מגנטית
נתרן ציטראט דיהידראטסיגמא-אולדריץ'W302600סינתזת חלקיקים מגנטית
טטראתיל אורתוסיליקטסיגמא-אולדריץ'131903סינתזת חלקיקים מגנטית
(3-אמינופרופיל) טריאתוקסיסילןסיגמא-אולדריץ'440140סינתזת חלקיקים מגנטית
פוליאתילנימין, מסועף, ממוצע Mw ~ 25,000סיגמא-אולדריץ'408727סינתזת חלקיקים מגנטית
תמיסת אמוניום הידרוקסידSigma-Aldrich221228-M סינתזת חלקיקים מגנטיים
אתנולפנטה71250-11000סינתזת חלקיקים מגנטית
אשלגן חנקתיסיגמא-אולדריץ'P6083סינתזת חלקיקים מגנטית
אשלגן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'1.05012סינתזת חלקיקים מגנטית
קרום חיתוך במשקל מולקולרי (Mw=1 kDa)מעבדות ספקטרוםG235063סינתזת
חלקיקים מגנטייםOverhead Stirrerwiteg Labortechnik GmbHDH. WOS01035סינתזת חלקיקים מגנטיים
WaterbathMemmert GmbH + Co.84198998סינתזת חלקיקים מגנטיים
SonicatorBandelin795סינתזת חלקיקים מגנטיים
BRAND UV cuvette מיקרוSigma-AldrichBR759200-100EACuvette למדידת גודל
כובע מותג ל-UV-cuvette מיקרוSigma-AldrichBR759240-100EAכובעי קובט למדידת גודל
נימי Zeta CellMalvernמקופליםDTS1070Cuvette למדידת פוטנציאל זטה
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600מכשיר למדידת גודל ופוטנציאל זטה
אינסופי 200 PRO
מכשיר NanoQuant		Tecan396 227 V1.0, 04-2010מכשיר למדידת ריכוז DNA
SYBR ירוק כמותי RT-PCR ערכתSigma-AldrichQR0100PCR ערכת
Mastercycler pro S מכשירEppendorf6325 000.013Thermocycler
MinElute ערכתQiagen28004ערכת טיהור DNA
נתרן אצטטSigma-AldrichS7670כריכת DNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
  2. Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
  3. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
  4. Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
  5. Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
  6. Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
  7. Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299(2014).
  8. Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
  9. Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
  10. Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
  11. Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
  12. Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
  13. Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
  14. Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
  15. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAPCR

מאמרים קשורים