יצירת מודל גיאומטרי מבנית מציאותי סופיים של Cardiomyocyte ללמוד את התפקיד של אדריכלות הסלולר Cardiomyocyte במערכות ביולוגיות

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת מודל מפורט במרחב סופיים של הארכיטקטורה תאיים של cardiomyocytes מיקרוסקופ אלקטרונים ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית. כוחו של המודל מפורט במרחב הזה הוכח באמצעות חקרי מקרה סידן איתות, ביואנרגיה.

Abstract

עם כניסתו של טכנולוגיות הדמיה תלת מימדי (3D) כגון טומוגרפיה של אלקטרון, סדרתי-בלוק-פרצוף סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, מיקרוסקופיה קונפוקלית, הקהילה המדעית יש גישה חסרת תקדים אלגוריתמית תת מיקרומטר רזולוציה המאפיינות את שיפוץ אדריכלי זה מלווה שינויים בתפקוד cardiomyocyte על בריאות ומחלה. עם זאת, אלה נתונים (datasets) היה תחת שימוש עבור חוקרים את התפקיד של אדריכלות הסלולר שיפוץ בפונקצית cardiomyocyte. המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר כיצד ליצור מודל מדויק סופיים של cardiomyocyte באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית. מודל מפורט ומדויק של אדריכלות הסלולר יש פוטנציאל משמעותי לספק תובנות חדשות cardiomyocyte ביולוגיה, יותר מאשר ניסויים לבד יכול גארנר. הכוח של שיטה זו טמון ביכולתה שהמפתחות מיזוג מידע מתוך שתי שיטות הדמיה ובתחזוקה של cardiomyocyte ultrastructure לפתח מודל אחד מאוחד ומפורט של cardiomyocyte. פרוטוקול זה מתאר את השלבים כדי לשלב את האלקטרונים טומוגרפיה ותמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של מבוגרים cardiomyocytes חולדה זכר Wistar (שם עבור סוג מסויים של לבקן עכברוש) לפתח מודל חצי-סרקומר סופיים של cardiomyocyte. ההליך יוצר דגם תלת-ממד סופיים המכיל של תיאור מדויק, ברזולוציה גבוהה (גודל ~ 35 ננומטר) של ההתפלגות של המיטוכונדריה, myofibrils אשכולות קולטן ryanodine לשחרר את הסידן הדרוש עבור cardiomyocyte התכווצות מהרשת רשתי sarcoplasmic (SR) לתוך myofibril תא cytosolic. המודל שנוצר כאן כפי המחשה שאינו כולל הפרטים של הארכיטקטורה צנורית-רוחבי או מהרשת רשתי sarcoplasmic, ולכן מודל מינימלי של cardiomyocyte. ובכל זאת, הדגם ניתן כבר ליישם מבוסס סימולציה חקירות את תפקיד של מבנה תאים בסידן איתות, מיטוכונדריאלי ביואנרגיה, אשר מומחש ודן באמצעות שני מחקרים בתיק המוצגים הבאים פרוטוקול מפורט.

Introduction

צימוד עירור-התכווצות (ECC) בלב מתייחס חשוב ומורכב צימוד בין עירור חשמלי של קרום cardiomyocyte התכווצות מכנית עוקבות של התא במהלך כל פעימת לב. מודלים מתמטיים יש תפקיד מפתח בפיתוח הבנה כמותית של תהליכים ביוכימיים היררכיות המסדירים את פוטנציאל הפעולה¹, סידן cytosolic איתות², ביואנרגיה³, ובעקבות יצירת כח כויץ. מודל שכזה גם בהצלחה לחזות שינויים פעימות הלב כאשר אחד או מספר תהליכים ביוכימיים אלה עוברים שינויים^4,5. Ultrastructure מאורגן של cardiomyocyte הוכרה יותר ויותר כדי לשחק תפקיד קריטי הפונקציה כויץ נורמלי של התא לבין בלב שלם. אכן, מתרחשים שינויים מורפולוגיה וארגון של רכיבי ultrastructure לב במקביל לשינויים ביוכימיים בתנאים מחלות כגון היפרטרופיה⁶, אי ספיקת לב⁷קרדיומיופתיה סוכרת⁸. בין אם שינויים מבניים אלה הן התגובות קלים, גמישים או פתולוגית שינוי תנאי הביוכימי הוא עדיין אינו מודע לקיומם⁹. המושבים מטבעו צר בין צורה ופונקציה בביולוגיה אומר כי מחקרים ניסיוניים לבד לא יכול לספק תובנות עמוקות יותר מאשר מתאמים בין שיפוץ מבנה ותפקוד cardiomyocyte. דור חדש של מודלים מתמטיים ניתן לשלב את מכלול מבנית של מרכיבי תת הסלולר, יחד עם תהליכים ביוכימיים, למד היטב נחוצים לפתח הבנה מקיפה, כמותית של מערכת היחסים בין מבנה, ביוכימיה כויץ בכוח cardiomyocytes. פרוטוקול זה מתאר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור מודלים סופיים מדויק מבחינה מבנית של cardiomyocytes יכול לשמש עבור חקירות.

בעשור האחרון ראה התקדמות משמעותית מיקרוסקופ אלקטרונים 3D¹⁰קונאפוקלית¹¹, מיקרוסקופיה סופר רזולוציה¹² המספקים תובנות הרכבה בקנה מידה ננו, מיקרו-מידה של חסר תקדים, ברזולוציה גבוהה רכיבי משנה הסלולר cardiomyocyte. לאחרונה, datasets אלה שימשו כדי ליצור מודלים של cardiomyocyte ultrastructure^13,14,15,16. מודלים אלה להשתמש ומבוססת הנדסה הדמיה שיטה, הנקראת שיטת סופיים¹⁷, כדי ליצור סופיים חישובית רשתות על אילו תהליכים ביוכימיים, cardiomyocyte ניתן לדמות התכווצויות. עם זאת, מודלים אלה מוגבלים על ידי הרזולוציה ואת פירוט שיטת מיקרוסקופ שיכול לספק ב- dataset התמונה. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להפיק ננומטר ברמת פירוט מבנה התא, אבל קשה לזהות חלבונים ספציפיים בתוך התמונה זה יהיה צורך ליצור מודל. מצד שני, מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה סופר יכול לספק תמונות חדות גבוהה ברזולוציות גודל 50 ננומטר מרכיבים בלבד בחר כמה מולקולרית של התא. רק באמצעות שילוב של שיטות הדמיה אלה משלימים מידע יכולים אחת מעשית לחקור את הרגישות של פונקציה לשינויים במבנה. אור correlative ואלקטרון עדיין לא הליך שגרתי, זה עדיין יסבול המגבלה כי רק מספר מוגבל של רכיבים יכול להיות מוכתם בתצוגה immunofluorescence, בקורלציה עם הנוף מיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול זה מציג הגישה הרומן¹⁸ העושה שימוש בשיטות סטטיסטיות¹⁹ כדי לנתח שהמפתחות נתיך מיקרוסקופ אור מידע על התפלגות מרחבית של תעלות יונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים מידע על הלב אחרים ultrastructure רכיבים, כגון myofibrils של המיטוכונדריה. זה מייצרת מודל סופיים יכול לשמש עם מודלים ביופיזיקלי של תהליכים ביוכימיים ללמוד את התפקיד של הארגון תת הסלולר cardiomyocyte תהליכים ביוכימיים המסדירים התכווצות cardiomyocyte. לדוגמה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ליצור מודלים של בריאה, streptozotocin-induced נייטרלים לב סוכרתית לחקור את ההשפעה של שיפוץ מבני על תפקוד הלב תא זה הוא ציין חיה סוכרתית מודלים⁸. יתרון נוסף של מהות השיטה הציג סטטיסטי מומחש גם בפרוטוקול: השיטה ניתן להפיק מופעים מרובים של גיאומטריות סופיים מקרוב לחקות את הווריאציות השפעול שנצפה במבנה התא.

כמו סקירה, השלבים פרוטוקול כוללים: (i) הכנה של רקמת הלב מיקרוסקופ ליצור תמונות 3D עם רזולוציה וניגודיות מספיק; (ii) שחזור ואת פילוח של אוספי תמונות 3D של מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים 3D שחזור וניתוח התמונה תוכנה בשם IMOD²⁰; (iii) שתשמש את iso2mesh²¹ ליצירת רשת סופיים באמצעות הנתונים מקוטע כקלט; (iv) באמצעות אלגוריתם הרומן קודים כדי למפות את ההפצה של תעלות יונים על גבי רשת השינוי סופיים.

הנחת היסוד של הגישה לקבר כל שלב המותווה בתוך הפרוטוקול, התוצאות נציג הינם מסופקים בכל הדמויות הנלוות. סקירה מחולקת לרמות המציין כיצד ניתן להשתמש הדגמים מפורט במרחב שנוצר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של סידן במהלך ECC, וכן מיטוכונדריאלי ביואנרגיה. חלק מהמגבלות הנוכחי של הפרוטוקול נידונות, כמו גם פיתוחים חדשים אשר נמצאות בעיצומן להתגבר עליהם, לקדם הבנה כמותית של התפקיד של מבנה תאים מערכות הלב לביולוגיה. מופנית גם כמה שיטות אלה יכול להכליל ליצור מודלים סופיים של סוגי תאים אחרים.

משתמשים של פרוטוקול זה יכול לדלג על שלב 1 ואת החלק שחזור של שלב 2 אם יש להם גישה לאוסף תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים הקיימת מראש. משתמשים אשר מתכוונים לרכוש את הנתונים שלהם בשיתוף עם microscopists אלקטרון מנוסים יותר ייתכן שתרצה לדון ולהשוות את הקיבעון ואת הנהלים מכתימים בשלב 1 עם המומחה כדי לקבוע פרוטוקול אופטימלית עבור רכישת.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת אוקלנד חיה ועדת האתיקה ואת אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו טיפול בבעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה, היכן פרוטוקול רקמות פותחה במקור.

1. הכנה ניסיוני

1. להכין מלאי פתרונות של נתרן 0.15 מ' ו- 0.3 M cacodylate מאגרי ב- pH 7.4 לפי טבלה 1.
2. להכין גלוטראלדהיד מקבע (2% paraformaldehyde (PFA) + 2.5% גלוטראלדהיד + 0.2% חומצה טאנית במאגר cacodylate נתרן 0.15 מ' ב- pH 7.4) באמצעות רכיבי המפורטים בטבלה 1.
   1. לפזר 2 גר' אבקה מחברים ב- 20 מ ל מים מזוקקים ב 60 מעלות צלזיוס על גזייה עם ערבוב מתמיד.
   2. מוסיפים 1 מ' NaOH פתרון עד הפתרון ברור.
   3. המתן עד הטמפרטורה של הפתרון הוא מתחת 40 ° צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 10 מ של גלוטראלדהיד, 20 מ של 0.3 M נתרן cacodylate.
   4. הוסף 0.2 גרם חומצה טאנית ' להמיס בפתרון.
   5. להוסיף 50 מ של 0.15 מ' נתרן cacodylate.
   6. חנות שלושה או ארבעה 20 מ"ל צלוחיות נצנוץ של מקבע במקרר 4 ° C, או על קרח אם נעשה שימוש באותו יום.
3. להכין הפתרון של Tyrode עם 20 מ מ 2, 3-butanedione monoxime (BDM), במתכון בטבלה1.
4. לבנות מנגנון Langendorff בתוך ארון fume.
   1. תהדק את שני צינורות מזרק פלסטיק 100 מ ל שני אביק שונות עומדת, כ 70 ס מ מבסיס לעמוד.
   2. לחבר את הצינורות מזרק פלסטיק, צינור המחבר באמצעות צינורות מ"מ-הפנימית-קוטר 3, צימוד-כיוונית כפי שמוצג באיור1.
   3. מתאים בצינורית הקוטר החיצוני של 3 מ מ לחלק התחתון של המחבר אבובים, איפה הלב יהיו כבולות עבור קיבעון זלוף.
5. למלא את הצינורות מזרק של Tyrode פתרון ופתרונות מקבע ב 37 º C.
   1. להסיר בועות אוויר בתוך הצנרת על ידי עובר את הפתרונות מזרק דרכם.

2. לרכוש מיקרוסקופ אלקטרונים נתונים של Cardiomyocyte Ultrastructure

1. להכין את החיה כריתה, קיבוע כימי של הלב.
   הערה: פרוטוקול זה מפרט את השלבים כדי לעבד למבוגרים זכר Wistar (שם עבור סוג מסויים של לבקן עכברוש) עכברים ברקמת הלב. הפרוטוקול עשויים לדרוש שינויים כאשר רקמת הלב הטרייה מינים אחרים.
   1. עזים ומתנגד החיה על ידי טיפול העכברוש (200-250 גרם לפי משקל גוף) עם 0.5 מ של הפארין U/mL 250 באמצעות הזרקת בקרום הבטן. לחכות 10 דקות, ולאחר מכן להתייחס העכברוש עם בקרום הבטן הזרקת פנטוברביטל (210/kg של משקל גוף).
   2. לאשר מידה נאותה של הרדמה על ידי בוחן את רפלקס קמצוץ של הבוהן.
   3. להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם.
   4. קציר הלב באמצעות ניתוח הליכים דומים בעבר מאמרים יופיטר^22,23, ואז למקם אותו בתוך תמיסת מלח קרה כקרח.
   5. לבודד את העורקים, נקרר. ודא כי קצה הצינורית יושב מעל השסתום חצי הירח, שם פנו העורקים הכליליים. לקשור חוט בחוזקה סביב אבי העורקים.
   6. לחבר את הצינורית המנגנון Langendorff מונחה הכבידה המופעל ב ~ 70 ס מ מעל הבסיס של המערכת (איור 1).
   7. סובב את צימוד על מערכת Langendorff כדי perfuse את הלב עם הפתרון של Tyrode, כולל 20 מ מ BDM (מעכב צולבות הקישור חוטים שרירן) למשך 2-3 דקות.
   8. סובב את צימוד להתחיל זלוף עם מקבע של 2% paraformaldehyde, גלוטראלדהיד 2.5% ו- 0.2% חומצה טאנית ב- 0.15 מ' cacodylate נתרן ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אם מצליחים, הלב חיוור משחימים ולהיות נוקשים וכואבים כמו גומי.
   9. בעזרת סכין גילוח, לנתח רקמות רחובות-חדרית (לרוחב) חינם הקיר השמאלי ולקבל רקמות חוסמת כ 1 מ³ בגודל.
   10. חנות הדגימות ב mL 20 טרום מקורר צלוחיות נצנוץ של מקבע אותו על קרח על ה 2 לאחסן דוגמאות רבות ככל האפשר הבקבוקונים, ולוודא כי הדגימות טובע בפתרון.
       שים לב: חשוב לשמור דגימות קר עד לאחר התייבשות 100% השלבים הבאים.
2. עוד קיבעון, מכתים של דגימות של מיקרוסקופ אלקטרונים.
   1. לשפוך 100 מ של 0.15 מ' נתרן cacodylate מאגר ב גביע זכוכית, לצנן את זה על קרח.
   2. להכין נפחים שווים של 4% אוסמיום ארבע-חמצני ו- 0.3 M נתרן cacodylate, ואחריו התוספת של 0.08 גרם אשלגן ferrocyanide כדי להפוך פתרון הכתם מטאל המכיל 2% אשלגן ferrocyanide ב 2% אוסמיום ארבע-חמצני ו- 0.15 מ' נתרן cacodylate. מגניב הפתרון על קרח.
   3. Pipette מקבע את החוצה ולהחליף אותו עם מספיק 0.15 מ' נתרן cacodylate מאגר קר להטבעת דוגמאות הבקבוקונים. מניחים את הבקבוקונים על קרח למשך 5 דקות.
   4. חזור על שלב 2.2.3 ארבע פעמים נוספות עם 0.15 מ' cacodylate נתרן כדי להסיר עודפי מקבע.
      התראה: אל תשתמש פיפטות זכוכית כי רסיסים זעירים יכול להיכנס המדגם ואני יכול להרוס סכינים יהלום במהלך רקמות בלוק חלוקתה. חשוב מראש לצנן את כל הפתרונות על הקרח לפני הוספתן ל המדגם. חשוב גם כי המדגם נשאר מכוסה על-ידי פתרון כל הזמן (תקופה קצרה מאוד של כיסוי חלקי שנמשך לא יותר מכמה שניות יכול להיות בקצרה נסבל במהלך פתרון חילופי). בעת שטיפה או החלפה פתרונות, להוסיף הפתרון החדש במהירות לאחר הסרת הפתרון הקודם. שמור את הבקבוקונים נצנוץ בקרח בין שוטף. שים לב כי צעד זה לא הזמן רגיש, אבני רקמה יכולים להישטף מעט יותר, אם יש צורך.
   5. החלף מאגר cacodylate נתרן מתכות כבדות קרה כקרח הכתם פתרון ואחסן אותו על קרח בן לילה. להבטיח ferrocyanide הוא מעורב טוב ע י ניעור המבחנה בעבודת יד; הפתרון צריך לפנות שחור.
      התראה: לעבוד בשכונה fume בעת ביצוע שלב זה בגלל אוסמיום הוא רעיל.
   6. לדלל 4% uranyl מימית אצטט (UA) מניות פתרון (טבלה 1) ל-2% באמצעות נפחים שווים של מלאי UA פתרון כפול מים מזוקקים, תקרר אותו בקרח.
   7. להחליף את הכתם מטאל מקורר קרח 0.15 מ' נתרן cacodylate מאגר, והנח את הדגימה תקופת דגירה של 5 דקות על קרח.
   8. חזור על שלב 2.2.7 עוד ארבע פעמים על קרח כדי לשטוף כל פתרון הכתם עודף הבי מטאל.
   9. לשטוף את הדגימות ארבע פעמים, עם רגע-פרק 2-מין בין במים מטוהרים (מזוקק פעמיים מספיקה).
   10. להחליף מים מורתחים עם 2% קר כקרח UA ולתת הדגימה תקופת דגירה של 60-120 דקות על קרח.
   11. לקרר חמש צלוחיות נצנוץ 20 מ"ל של אתנול (מספיק להטבעת דגימות) על קרח שישמש בשלב התייבשות. 6 בקבוקים יש הגדלת אחוזי אתנול במים מזוקקים: 20%, 50%, 70%, 90% ו- 100%.
   12. שופכים אצטון טהור לתוך עוד 20 מ"ל בקבוקון נצנוץ וקריר על הקרח יחד עם הבקבוקונים אתנול.
   13. לשטוף דגימות מים מטוהרים ארבע פעמים עם תקופות ההמתנה 2 דקות על קרח כדי לשטוף את עודף UA.
3. מייבשים דגימות אתנול.
   1. מייבשים בסדרת אתנול קר על-ידי החלפת במרוכז פתרון בתוך המבחנה מדגם כדלקמן, על הקרח: 20% אתנול 10 דקות; 50% אתנול 10 דקות; 70% אתנול 10 דקות; 90% אתנול 10 דקות; . אז פעמיים בתוך 100% אתנול למשך 10 דקות...
   2. מעבר מדגם לטמפרטורת החדר על-ידי החלפת האתנול 100% הסופי עם אצטון טהור מקורר ולמקם את המבחנה מדגם על ספסל מעבדה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
   3. ביצוע אחד עוד 10 דקות לשטוף אצטון טהור בטמפרטורת החדר כדי להסיר עיבוי זה נצפות בתוך הבקבוקונים. בזמן המקננת, לפצות את הפתרונות אצטון/שרף.
   4. החלף אצטון טהור ב הבקבוקונים 50: 50 טהור אצטון, אפוקסי שרף (עם הפרופורציות עבור רכיבי שרף אפוקסי כאמור על ידי היצרן). השתמש כל הרכיבים מאותו סוג. להשאיר את הבקבוקונים מלא שרף מדגם בן לילה רוטור.
4. להטביע דגימות שרף.
   1. להחליף 50: 50 שרף שרף 75% (25% אצטון), תקופת דגירה של 3 שעות, ואחריו הדגירה/חדירה נוספת ב- 100% שרף במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. להחליף 100% שרף שרף 100% טרי, ולהשאיר את הבקבוקונים מדגם בן לילה לחדירה עמוקה יותר של השרף לתוך דגימות רקמה.
   3. לקחת דגימות מתוך הבקבוקונים, למקם אותם במיכלים שאינם ידידותיים תנור, יש בסיס שטוח; אלומיניום או רדיד כסף מנג'ט יכול לשמש למטרה זו, לדוגמה.
   4. שופכים בעדינות (כדי למנוע תזוזה של הדגימות) טריים שרף על הדגימות (ובכך הטבעה דגימות שרף), פולימריזציה של שרף ודוגמאות בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
5. מחדש אוריינט שרף בלוקים לתאים תמונת חתך הרוחב.
   1. להשיג 1 מיקרומטר מבחן עבה מקטעים של הבלוקים שרף באמצעות ultramicrotome עם סכין זכוכית כדי להעריך תא התמצאות²⁴.
   2. כתם הסעיפים מבחן עבה 20 s עם כחול טולואן 1%, 1% בורקס.
   3. לבחון כיוון תא השריר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
   4. לפי כיוון להסיק מן הדימויים של סעיפים מוכתמים מבחן, מחדש אוריינט longitudinally או בעקיפין מונחה (בדומה איור 2A) שרף בלוקים כדי להבטיח כי תאים נחשפים הסכין זכוכית כך הם יקוצצו ב (חתך רוחב בדומה איור 2B).
6. סעיפים רקמות התמונה באמצעות טומוגרפיה של אלקטרון.
   1. להשיג חלקים למחצה דק (~ 300 ננומטר) של הרקמה reoriented הבלוקים באמצעות יהלום סכין ולהעביר את הסעיפים על גבי רשתות נחושת²⁵.
   2. כתם הסעיפים עבה עם 2% UA ו- Sato הראשי²⁵.
   3. החל colloidal חלקיקי זהב משני צידיו של סעיפים²⁵.
   4. להשיג סטים של יחיד או כפול-ציר להטות את סדרת תמונות המוקרנת מ-70 ° +70 °²⁵.
7. השתמש IMOD²⁰ כדי לשחזר את המחסנית תמונה תלת-ממדית (סדרה של תמונות דו-ממד המספקים את נתוני תלת-ממד של מקטע טומוגרפיה אלקטרון יחיד) של התא. זה מחסנית המשוחזרת מקוטע בשלב הבא.

3. קטע Myofibrils ואזורים המיטוכונדריה מן הנתונים (dataset) תמונה תלת-ממדית EM

1. לבצע את התוכנית IMOD "3dmod".
2. בממשק משתמש גרפי 3dmod, הזן את הכתובת של ".rec" או ".mrc" קובץ המכיל 3D שיחזר תמונה dataset של התא (נוצר בשלב 2.7) לתוך התיבה ערך שכותרתו "תמונת קבצים:", והקש "אישור".
3. תחת תפריט "קובץ", בחר דגם חדש ולאחר מכן שמור את הקובץ עם שם מתאים באמצעות "להציל את המודל". פריט התפריט תחת "קובץ".
   הערה: אובייקט IMOD יכולים להכיל אוסף של רכיבים מקוטע, שמרכיבים את "אובייקט". כברירת מחדל, מודל חדש מכיל אובייקט חדש עם מזהה "#1".
4. תחת תפריט 'מיוחד', בחר 'כלי ציור'. פעולה זו תפתח בר כלי חדש הדומה לזה המוצג באיור 3 א.
   הערה: ישנם מספר כלים יכול לשמש כדי ליצור קווי מתאר סביב הגבולות אברון שונים. עזרה נוספת אודות דרכים להשתמש בכלים אלה ניתן למצוא בתיעוד²⁰ IMOD.
5. בחר באפשרות "Sculpt" בתפריט "כלים ציור", להזיז את העכבר מעל לחלון התמונה; יופיעו מתאר מעגלי שבמרכזה מצביע העכבר.
6. על-ידי החזקת לחצן העכבר האמצעי מעל מיטוכונדריון (אזורים כהים קבצי תמונה, כפי שהודגמה בעזרת מטוס עם קווים ירוקים מתאר דמות 3A), גרור את ההיקף מתאר מעגל לצורה של הגבול שלה.
7. לאחר יצירת מיתאר של הגבול מיטוכונדריון תושלם, שחרר את לחצן האמצעי וחזור על שלבים 3.6 עבור כל מיטוכונדריון בנתונים. כל אחד מתאר באופן אוטומטי תוכר על ידי IMOD מתאר חדש בתוך אותו אובייקט.
8. תחת "עריכה | אובייקט "תפריט, בחר"חדש"כדי ליצור אובייקט חדש. זה באופן אוטומטי להגדיל את המספר הכולל של אובייקטים באחד ולהקצות את המספר הזה האובייקט החדש.
9. חזור על שלבים 3.6 ו- 3.7 קטע ולהציל את קווי המתאר myofibril.
10. חזור על שלב 3.8, ואחריו שלב 3.6, כדי לחלק גם בגבולות התא.
11. שמור את הקובץ דגם תחת תפריט "קובץ".
12. להריץ את הפקודות הבאות בחלון שורת הפקודה כדי להמיר כל אובייקט קיבוץ לתוך מסכה בינארי, כמודגם באיור 4A-C.
    1. תמצית אובייקט מסוים מן מודל "imodextract אובייקט modelfile outputmodelfile" "אובייקט" איפה המספר של האובייקט כדי לחלץ.
    2. ליצירת מסיכה עבור אובייקט זה: imodmop-מסכת 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. להמיר את הקובץ לתוך ערימה tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. ליצור את רשת סופיים של הרכיבים מקוטע

1. Iso2mesh היא תוכנית MATLAB זמינה בחופשיות להמרת אוספי תמונות TIFF רשתות שינוי נפח tetrahedral סופיים. להוריד ולהוסיף iso2mesh לנתיב MATLAB של iso2mesh.sourceforge.net.
2. הורד את קודי המקור ואת הנתונים כדי לדמות RyR אשכולות על רשת השינוי של https://github.com/CellSMB/RyR-simulator באתר github.
3. הפעל את היישום CardiacCellMeshGenerator MATLAB (איור 5).
4. לטעון את המסכות רכיב אברון שונים לתוך MATLAB באמצעות הלחצנים לדחוף שלוש בצד השמאלי העליון של GUI.
5. ליצור עוד מחסנית תמונה בינארי demarcates פערים בין myofibrils המיטוכונדריה כפי שמוצג באיור 6A.
   1. פתח ImageJ.
   2. באמצעות הקובץ | פתח את הדו-שיח, לטעון את הערימות tiff myofibrils של המיטוכונדריה לתוכנית.
   3. ליזום את תוסף תוספת של התמונה על-ידי בחירה "תהליך | מחשבון פלוס ".
   4. בחר של אוסף התמונות myofibril i1, המיטוכונדריה תמונה מחסנית כמו i2, בחר באופרטור 'הוסף'. לחץ על "אישור".
   5. לאחר ערימה תמונה חדשה המייצג את התוצאה של 4.5.4 מופיע, בחר ' עריכת | היפוך"כדי לייצר אוסף תמונות הדומה 6A איור.
6. לטעון את הקובץ המכיל את ערימת תמונה בינארי הפערים בין myofibrils המיטוכונדריה על-ידי לחיצה על כפתור "RyRGapsFile" תוכנית CardiacCellMeshGenerator.
7. לדחוף "ליצור רשת" ב- GUI. זה יפעיל את v2m הפקודה iso2mesh עם האפשרות 'cgalmesh' כדי ליצור רשת tetrahedral הדומה איור 4E. שלושה קבצים יהיה הפלט בסוף שלב זה: קובץ .ele קובץ להתייצב, קובץ .node שיכיל את הרישום של צמתי המרכיבות את היסודות, הצמתים המרכיבות את הפנים, את הקואורדינטות של הצמתים , בהתאמה.

5. מתמטית מפת צפיפות במרחב בדרגות שונות של יון-ערוצי עניין על גבי רשת השינוי סופיים.

1. צור את הקלט הנדרשים עבור RyR-הסימולטור על-ידי לחיצה על לחצן מתויג תשומות ליצור RyR-סימולטור ב- GUI.
   הערה: הלחצן יגרום לקריסה של פונקציה generateRyRsimulatorInputs.m, העושה את המידע הבא משלב 4 כדי להפיק את הקלט:
   (1) outDir: מיקום קבצי פלט הנחוצים RyR אשכול סימולציה.
   (2) imres: פיקסלים ברזולוציה ב משלושה כיוונים של אוספי תמונות.
   (3) myofibril_file: הקובץ המכיל את המחסנית תמונה בינארי כזה באיור איור 4B.
   (4) sarcolemma_file: הקובץ המכיל את המחסנית תמונה בינארי כזה באיור איור 4A.
   (5) ryrgaps_file: הקובץ המכיל את המחסנית תמונה בינארי כזה באיור איור 5A.
   1. לאחר מפעילה פונקציה זו, בדוק הקבצים הבאים נוצרו בתוך הספריה שצוינה כנתיב outDir:
   • . d_axial_micron.txt, אשר מייצג את המרחק בין המיקום של z-הדיסק השארית של הפיקסלים באוסף תמונות.
   • . d_radial_micron.txt, אשר מייצג את מרחק אוקלידי (למעט הרכיב צירית) של כל פיקסל בקבוצת מיקומים אפשריים של אשכול RyR הפיקסלים במישור z-דיסק.
   • . W_micron.txt, אשר מייצג את רשימת קואורדינטות המרחבי של כל המיקומים הזמינים עבור RyR אשכולות להיות נוכח.
   • 3 הקבצים הנותרים בתיקיה להכיל את הסיומת "_pixel" ולא "_micron" לציון כי הערכים בתוך קבצים אלה נכתבו בצורת קואורדינטות פיקסלים.
2. לדמות RyR הפצות אשכול על ערימת myofibrils תמונה בינארי.
   1. לחצו על הכפתור מתויג "פתוח RyR-סימולטור ב- R" כדי להפעיל את התוכנית R.
   2. R-gui, בחר ' קובץ | פתוח"ולמצוא הקובץ"הגדרות. R"בתוך החבילה RyR-סימולטור (RyR-סימולטור מקור הגדרות. R).
   3. גם לפתוח את הקובץ ryr-סימולטור-במקביל. R (ממוקם RyR-סימולטור/מקור/ryr-סימולטור-במקביל. R)-סביבות כמו Rstudio (https://www.rstudio.com) או ממשק שורת פקודה פשוטה ניתן להשתמש, למשל באמצעות הפקודה R64 בחלון קש או הפקודה.
   4. לשנות את הפרמטרים בהגדרות. R הקובץ כמפורט להלן:
      1. הגדר Path2 הכתובת תיקיה המכילה את הקבצים שמופיעים 5.1.2 עבור אוסף תמונות קונאפוקלית רכשה השפעול של אשכולות RyR myofibrils.
         הערה: github מאגר התיקייה הקלט-הקבצים/המאסטר-התא / כבר מכיל קבצים אשר נוצרו עבור אוסף תמונות שנאספו בעבר.
      2. הגדר Path4 כתובת תיקיה שבה מאוחסנים הקבצים נוצרו בשלב 5.1.2.
      3. לקבוע נקודת Path3 לתיקייה שבה המשתמש רוצה המיקומים מדומה של אשכול RyR להינצל.
      4. סט N על מספר אשכולות RyR ניתן לדמות במודל (בדרך כלל בטווח של 200-300).
      5. הגדר etol, סובלנות הגדרת, על ההבדל בין ההתפלגות המרחבי נמדד השפעול של אשכולות RyR את התפוצה המרחבית של מודל הדמיה של RyR אשכולות.
      6. הגדר numIter כדי להגביל את מספר הניסיונות RyR-הסימולטור צריך לנקוט כדי למצוא תבנית אשכול RyR המדומה המקיים את הערך etol.
         הערה: ערכים עבור etol ו- numIter הוגדרו ערכים אופייניים בתוך ההגדרות. R הקובץ.
      7. מוגדר numPatterns מספר דפוסים אשכולות שונים RyR המשתמש שרוצה לדמות (בדרך כלל, זה תרגול שימושי להדמיית 99 דפוסי על האמון סטטיסטית).
      8. הגדר numCores כדי לאפשר את השימוש ב- CPU מספר חוטי (ליבות) מקבילי מהיר עיבוד עם R כדי לדמות את דפוסי נקודת.
   5. בדוק החבילות הבאות מותקנים באמצעות ' מתקין החבילות ' gui ב r: שלג, doSNOW, doparallel, foreach, iterators ו- rgl.
   6. לבצע את הסימולטור על-ידי הזנת את הפקודה הבאה בחלון הפקודה R: מקור (' נתיב ryr-סימולטור-במקביל. R', הפקודה chdir = TRUE)
      הערה: הפלט של התוכנית RyR-סימולטור הוא רשימה של קבצי. txt (קובץ numPatterns ייווצר) המכילים רשימות קואורדינטות N שורות, עמודות 3, אשר מייצגים את x, y ו- z הקואורדינטות של N מדומה RyR אשכולות.
3. מפת נקודות כמו המרחבי הצפיפויות על גבי מודל חישובי באמצעות CardiacCellMeshGenerator.
   1. על-ידי בחירת לחצן מתויג "בחר קובץ נקודות RyR", לבחור אלו שהיו פלט על-ידי RyR-הסימולטור מדומה RyR אשכול חלוקת קובץ טקסט.
   2. לבצע "RyR צפיפות ממפה" ב- GUI ב- MATLAB. זה ימפה את המיקומים המרחבי של האשכולות RyR מדומה, הקובץ. txt בשלב 5.3.1 על גבי רשת השינוי סופיים שנוצר בשלב 4.8 באמצעות שיטה הנקראת שיטת²⁶משערך העוצמה הקרנל כדורית.
      הערה: הפלט של שלב זה הוא קובץ עם סיומת. txt המכיל רשימה של ערכים עבור צפיפות המספרי של יון-הערוץ לכל יחידת נפח כדורית בכל אחד מהצמתים רשת חישובית.

Results

איור 2 - איור 7 לספק תוצאות נציג מספר שלבים מרכזיים ב פרוטוקול זה: (i) להמחיש, לצידוד גושי רקמה לתצוגות מיקרוסקופ אלקטרונים חתך הרוחב; (ii) יצירת ערימה תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים תלת-ממד; (iii) הממיין ultrastructure תת הסלולר עבור organelles עניין; (iv) דור של רשת סופיים באמצעות iso2mesh; (v) הדמיה מציאותית הפצת RyR אשכולות על רשת השינוי; (vi) ואחריו מיפוי זה התפוצה המרחבית כמו צפיפות המרחבי על רשת השינוי חישובית.

Discussion

הפרוטוקול הנ ל מתאר את השלבים החשובים ליצירת מודל גיאומטרי סופיים הרומן של cardiomyocyte ultrastructure. השיטה מאפשרת פיוז'ן חישובית מיקרוסקופיה שונים (או, באופן עקרוני, נתונים אחרים) שיטות לפיתוח מודל חישובי מקיף יותר של הדינמיקה cardiomyocyte הכולל פרטים של ארכיטקטורה התא מרחבית. אין כרגע שום פרוטוקול אחר זמין ליצור מודל כזה cardiomyocyte.

שלב 1 מתאר פרוטוקול עבור קיבעון זלוף. לחלופין, הלב יכול להיות טוחנות, גזור לחתיכות קטנות יותר, שקוע מקבע. עם זאת, תהליך זה צריך להיעשות במהירות, יכולים לה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>חומרים
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ	746398
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	C8106
מגנזיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	M2393
נתרן ביקרבונט	סיגמא-אולדריץ'	S5761
אשלגן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	P5405
דקסטרוז	סיגמא-אולדריץ'	D9434
נתרן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ	S8045
פרובנציד	סיגמא-אולדריץ'	P8761
2,3-בוטנדיון מונוקסימה	סיגמא-אולדריץ'	B0753
25% גלוטראלדהיד דרגת EM (בקבוק 500 מ"ל)	Merck	354400-500 מ"ל
פרפורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	P6148
חומצה טאנית	סיגמא-אולדריץ'	403040-500 גרם	100 גרם
נתרן קקודילאט	סיגמא-אולדריץ'	C0250
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'	P4593
אוסמיום טטרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	75632-10 מ"ל	4% במים, בקבוק 5 מ"ל (או בקבוק 10 מ"ל זמין גם)
אורניל אצטט	EM Sciences	22400	בקבוק 25 גרם
אשלגן פרוציאניד	Merck Millipore	104973
טולואן כחול	סיגמא-אולדריץ'	T3260
בורקס	סיגמא-אולדריץ'	S9640	נקרא גם נתרן בוראט
אתנול	סיגמא-אולדריץ'	792780	מדולל לאחוזים שונים עם מים טהורים
אצטון	EM Sciences	RT10017
ערכת שרף	EM Sciences	14040	ACM Durcupan עובד היטב
חומצה הידרוכלורית	Sigma-Aldrich	H9892	1תמיסה
רגילה<חזק>ציוד
Ultramicrotome	Leica	EM UC7
אלקטרון שידור מיקרוסקופ	ThermoFisher Scientific	Tecnai F30	http://www.leica-microsystems.com/
מעמד רטרט	Proscitech	T752
צינורות	BioStrategy	75831-346	למכשירי זלוף לנגנדורף, קוטר 3 מ"מ מומלץ אך לא חיוני
Stopcocks	SDR	QP13813	לצינורות לנגנדורף; המוצר הוא רק דוגמה, המשתמש יכול לבחור כל
מהדקי מעמד רטרט	Proscitech	T715
מזרקי פלסטיק	SDR	QPC1108	לפתרונות על מכשירי לנגנדורף
תפר משי קנולציה, 7-0	TeleFlex	15B051000	לקשירת לב על מכשיר langedorff
צינורית			עשויה ממחט פלדה בקוטר חיצוני 3 מ"מ
מחצלת צלחת פטרי גומי	Proscitech	H068	לשימוש כקרש חיתוך במהלך דיסקציה של לב קבוע
סכיני גילוח	Proscitech	L056	לחיתוך לב קבוע לבלוקים קטנים לעיבוד EM
בקבוקי זכוכית	BioStrategy	89000-236	לאחסון תמיסות במהלך קיבוע ועיבוד רקמות
לכוסות	BioStrategy	213-0477	לאחסון תמיסות באופן זמני ובמהלך זלוף
בקבוקוני נצנוץ	BioStrategy	548-2170	לדגימות רקמות במהלך עיבוד EM
ערכת דיסקציה	Proscitech	T161	לדיסקציה של בעלי חיים
מסנני מזרק	Proscitech	WS3-02225S	לטיהור אורניל אצטט
אלומיניום/רדיד כסף כוסות			מכל חנות מוצרי אפייה
דופונט יהלום סכין	גרסת זווית 35 מעלות של BioStrategy	102680-780	מייצרת את החלקים הטובים ביותר.
	קולואיד זהב BBI Solutions	EM. GC15	15 ננומטר רשתות רשת EM זהב קולואידיות
	Proscitech	GCU150	ניתן לבדוק מגוון גדלים: GCU150h, GCU200h למשל
פיפטות לסילוק פלסטיק	Proscitech	LCH20	הטוב ביותר להשתמש בכלים חד פעמיים מפלסטיק במיוחד כאשר עובדים עם תוכנת
SerialEM	רכישת טומוגרפיה	של אוניברסיטת בולדר
MATLAB	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMOD	יישור		ופילוח תמונה
iso2mesh			זמין ב-http://iso2mesh.sourceforge.net
פיג'י או תוכנת עיבוד תמונה דומה	ImageJ	Fiji is Just Image J	זמין ב-https://fiji.sc למניפולציה של תמונה בינארית ערימות
קודים/נתונים של RyR-Simulator		CellSMB	זמינה בכתובת https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGenerator	קבוצת		מגיעה עם RyR-Simulator תחת התיקייה "gui-version"
R-statistics software	R-project		הורד מ-https://www.r-project.org
spatstat	R-project		התקנה באמצעות תוכנית
R rgl	R-project		התקנה באמצעות R תוכנית
doparallel	R-project		התקנה באמצעות תוכנית R
עבור כל	R-project		התקנה באמצעות תוכנית R
doSNOW	R-project
איטרטורים	R התקנת R-project		באמצעות תוכנית R