מאמר שיטה

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

DOI:

10.3791/56836

⸱

30 בנובמבר 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoiesis הוא תהליך הסלולר חיוני שבו תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) להבדיל לתוך ריבוי של שושלות תאים שונים המרכיבים את דם בוגרים. בידוד וזיהוי של אלה HSPCs היא קשה כי הם מוגדרים לשעבר פוסט פקטו; הם רק יכולה להיות מוגדרת לאחר בידול שלהם לתוך שושלות תאים מסוים. במהלך העשורים האחרונים, הפך דג זברה (רזבורה rerio) אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. דג זברה עוברי להתפתח לשעבר עם רחם, וכי על ידי 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) יצרו סופית HSPCs. מבחני להעריך בידול HSPC, פותחו יכולות הפצה, ניצול השתלת ובעקבות שיחזור של מערכת hematopoietic בנוסף להמחיש קווים הטרנסגניים מיוחדים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, מבחני אלה הם העלות אוסרני טכנית וקשה, זמן רב עבור מעבדות רבות. פיתוח מודל במבחנה כדי להעריך HSPCs יהיה העלות האפקטיבית, מהיר, ותיאר נוכח קשיים פחות בהשוואה בעבר שיטות, ומאפשר מעבדות להעריך במהירות מסכי התרופות, מוטגנזה מכוונת להשפיע על ביולוגיה HSPC. זה רומן במבחנה הנועד להעריך HSPCs מתבצע על ידי ציפוי הפומבית דג זברה כל העוברים, הוספת גורמים אקסוגניים לקדם רק HSPC בידול והתפשטות. עוברי הפומבית לתוך תאים בודדים, מצופה HSPC-תומכת גורם ממריץ שגורמים להם לייצר המושבה ויוצרים יחידות (CFUs) הנובעות תאים ובתאים יחיד. מבחני האלה צריך לאפשר בחינה זהירה יותר של מסלולים מולקולריים האחראי על התפשטות HSPC, בידול, התקנה, אשר יאפשר לחוקרים להבין את. הפסיכולוגי של חוליות hematopoiesis ואת dysregulation שלה במהלך המחלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoiesis היא התהליך של ביצוע ריבוי של תאי דם בוגר נדרש להישרדות של אורגניזם. זה תהליך התפתחותי מפתח המערבת את הבידול של תאי גזע hematopoietic (HSCs) במגוון רחב של סוגי תאים מוגבלת מבחינת המרכיבים דם בוגרים. אלה HSCs עצמית לחדש, כך המערכת לעולם אינו הם חייבים להתמיד של התפתחות עוברית מוקדמת עד מותו. גולגולת, בידול קבוע והתפשטות של תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) יש צורך לחדש בצורה הולמת את רוב תאי דם הם שלאחר mitotic להיות ממוחזרים בכל יום. HSCs יצירת תאי דם בוגרים על-ידי המבדילים הראשון לערכות משנה של ובתאים מוגבלת; נפוץ אבות הלימפה (CLPs)1, אשר בסופו של דבר לייצר תאי T, B, ו- NK, ונפוץ מיאלואידית אבות (CMPs)2 היוצרים גרנולוציטים, אריתרוציטים, מקרופאגים, megakaryocytes. אבות אלה מחויבים יצירת שושלות תאים מסוים, להבדיל עוד יותר לתוך יותר ובתאים מוגבלת מבחינת כגון erythroid מיאלואידית אבות (פיגל) היוצרים אריתרוציטים, טסיות דם, או גרנולוציט אבות מקרופאג (Gmp) היוצרים בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים ומקרופגים2. זיהוי ובידוד אבות אלה מאפשר זיהוי מסלולים מולקולריים חשוב מעורב בידול hematopoietic, מחלות hematopoietic רבות כגון לוקמיה מתעוררות כאשר אלה ובתאים להיכשל כראוי להבדיל.

במהלך העשורים האחרונים, מערכת מודל דג זברה (רזבורה rerio) הפך כלי מחקר מפתח עבור מחקרים hematopoietic עובריים למבוגרים. דג זברה נתונות ניתוח גנטי והם מינים דגם חוליות phylogenetically הנמוך ביותר שיש להערכת דומים ומערכת hematopoietic לבני אדם. דג זברה עוברי לפתח לשעבר עם רחם, וצור בתוך 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. דג זברה גם הם הפוריה ביותר, עם הנקבות שוכב מעל 100 ביצים מצמד בודד, מתן אפשרות עבור מדגמים גדולים ושכפול ניסיוני. דג זברה העוברים הם שטיחות שקוף, המאפשר ויזואליזציה מיקרוסקופיים של מערכת hematopoietic. מספר שורות הטרנסגניים פלורסנט דג זברה סימון HSCs כגון runx1: EGFP דגים9, cd41: EGFP דגים10, ו- kdrl:mCherry; cmyb: בעלי חיים GFP3 כפול-חיובית, לאפשר להמחשת בשידור חי, בזמן אמת של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה והתרחבות ויוו3,4,7,8, 9. של דג זברה דור מהיר זמן ופיתוח לשעבר עם רחם הוביל השימוש בו מוטגנזה מכוונת מחקרים11,12,13,14,15 וסמים הקרנת16,17,18,19,20 שאמורות להחזיק ההבטחה טיפולית בהפרעות דם אנושי. בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, הנוכחות ואת פיתוח קלה של קווים מהונדס, וזמן התחדשות מהירה הפך דג זברה מודל זול, מהיר, גמיש, אידיאלי עבור מחקרים hematopoietic.

פותחו שיטות רבות של בידוד ובדיקה HSCs בתרבית של מערכות hematopoietic. חוקרים יכולים לנצל שילוב של קולטני התא השטח כדי לסמן HSCs21,22,23,24, כמו גם לנצל את היכולת של HSCs בזרימת לצבוע25,26. אחרי, הם מסומנים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) מאפשר הפרדה פיזית שלהם. להוכיח כי תא HSC מחייב בין חיה המארח כדי להרוס את HSPCs אנדוגני, משתילים בשם HSCs, והתבוננות ארוכת טווח, שושלת היוחסין מרובה שיחזור של כל בוגר סוגי תאים בדם. מבחני אלה פועלות היטב עכברים, שכן ישנם רבים תא-פני נוגדנים נגד תאים hematopoietic וללחצים העכבר המפגרים המאפשרים התאמת המערכת החיסונית עבור השתלת. עם זאת, כמה דג זברה hematopoietic תא-פני נוגדנים כבר שנוצר27, הפרעה של זיהוי ובידוד של HSCs. הדרך הנפוצה ביותר כדי לסמן ולבודד דג זברה HSCs היא עם בעלי חיים מהונדס, לפיה רצף ספציפי תא יזם נוהג הביטוי של החלבון הניאון. מחקרים דמיינו, לספור HSCs בקיר הגחון של אבי העורקים הגבי עם מיקרוסקופ ניצול זו טכניקת3,4,8,9. מעבדות אחרות יצרו זנים המשובטים של דג זברה28,29 , אמורה לבצע השתלה מוצלחת ב- MHC-מתאימים לבעלי חיים30. עם זאת, שיטות אלה העלות אוסרני מעבדות רבות, מבחינה טכנית קשה, הם לארוך זמן רב. כדי לטפל בבעיות אלה, מעבדות יצרו מספר במבחנה מבחני לבדיקת הנוכחות, שיעור התפשטות, והיכולת בידול של HSPCs31,32,33, 35, 34,36. מבחני אלה להראות התפשטות ובידול של HSPCs במבחנה31,32,33,34,35,36, חילוץ פגמים hematopoietic36, שיטה יעילה לגילוי ולבדיקה ציטוקינים33,34,35. הם כבר נעזרו גם לזהות את הגנים אחראית HSPC-ביולוגיה-31,-32. במחקר זה, ניקח את אלה מבחני צעד נוסף, המאפשר כימות של HSPCs של העובר מתפתח דג זברה. מבחני אלה גם יכול להיות מנוצל כדי quantitate את המספר של HSPCs חיות, בעלי חיים שמטופלים בתרופות hematopoietic משובש. בעיקרו של דבר, אלה מבחני מהר, נוכח האתגרים הטכניים אחדים הינם דרכים זולות quantitate מספרי HSPC, לבדוק את ההפצה שלהם, ולחקור בלוקים בידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) חבר הוועדה המייעצת באוניברסיטת קליפורניה, צ'יקו, אישר כל השיטות המתוארות להלן.

1. מלבין 48 hpf דג זברה עוברי

  1. עם 15 ס מ x 15 (w) ס"מ (l) x 7 ס מ (h) מיכלי פלסטיק ליצור תחנות שטיפת 3: 1) עם 1 מ"ל של 5% אקונומיקה במדיום העובר 1000 מ"ל (E3; ראה טבלה 1), 2) עם E3 סטרילי, ועם 3) E3 סטרילי. להבטיח לכל מכולה מכילה 500 מ של פתרון ומטביעים את העוברים ב.
    הערה: עבור כל תנאי נבדק, לפחות 10 עוברי יהיה צורך. הליך זה כביסה יכול להכיל עד 200 עוברי.
  2. עם פיפטה העברה, להכניס העוברים בתוך מסננת תה ויציפו ביצים בתחנת רחיצת #1 עבור 5 דק. להסיר את מסננת תה (עם העוברים בתוך) ומניחים לתוך תחנת רחיצת #2 עבור 5 דקות; חזור על תחנת רחיצת #3 עבור דקה 5 הסופי.
  3. לאחר השטיפה האחרונה העוברים שטיפה של תה מסננת על ידי מסובבים אותו הפוך נקי 10 ס"מ פטרי ושטיפה בעדינות עוברי הנחה את מסננת תה עם E3 סטרילי, פיפטה של העברה.

2. Dechorionate עוברי

  1. עם פיפטה העברה, להסיר, למחוק כמה שיותר E3 ככל האפשר מתוך הפטרי ולהוסיף 500 μL של dechorionation פרוטאז (10 mg/mL) העוברים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק טפח בעדינות את הצד של הפטרי כדי להסיר לחלוטין את chorions.
  2. פיפטה סרולוגית, להוסיף 20 מ של E3 סטרילי כדי לדלל פרוטאז. לאפשר עוברי להתיישב, ולהסיר E3 עם פיפטה העברה. חזור על שלב זה שטיפת 3 פעמים כדי להסיר כל עקבות הפרוטאז dechorionation.

3. הכנת דוגמאות העובר

  1. באמצעות פיפטה P1000, מניחים 10 עוברי לתוך צינור microcentrifuge יחיד mL 1.5 סטרילי.
  2. הסרת E3 עם פיפטה וזורקים.
    התראה: פיפטה בזהירות ככל עוברי יכול בקלות להיות שנעקרו מבתיהם במהלך שטיפת בשלבים הבאים.

4. הכנת העוברים דיסוציאציה

  1. העברת דגימות למינארי, ולשטוף העוברים על-ידי הוספת 1 מ"ל E3 סטרילי. לאפשר עוברי ליישב לחלק התחתון של צינור ולהסיר תגובת שיקוע עם פיפטה P1000. חזור על סך של 3 מנקי.
  2. לאחר השטיפה האחרונה להסיר E3 וזורקים. להוסיף 1 מ"ל של 10 מ מ dithiothreitol (DTT) ב- E3 להסיר את הציפוי ריר (וכל נבגים, שמרים, או חיידקים, כי אמנם כלואה בתוכו) המקיפים את דג זברה עובריים. פרופיל microcentrifuge צינור אופקי, דגירה בטמפרטורת החדר למינארי במשך 25 דקות.

5. עובר דיסוציאציה

  1. רחץ מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של DPBS סטרילי (עם Ca2 + ו Mg2 +). לאחר השטיפה האחרונה להוסיף 500 μL של DPBS (עם Ca2 + ו Mg2 +) ולהוסיף 5 μL של 5 מ"ג/מ"ל (26 U/mL) דיסוציאציה פרוטאז.
    התראה: אנזים זה זקוק Ca2 + ו- Mg2 +, אז ודא כי DPBS מכיל יונים אלה.
  2. דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על אופקי מטרף מסלולית-180 סל ד עבור 60 דקות דגימות מקום בשכונה זרימה שכבתית, triturate עוברי עם P1000 עד מלא חלופה מועדפת דגימות.
    התראה: בדוק עוברי מעת לעת כדי לקבוע מתי הם הופכים חלופה מועדפת. הפתרון העובר צריך כמות מסוימת של רקמת הנוכחי; זה לא צריך להיות הומוגני לגמרי. זה אפשרי תקציר יתר, אשר תהרוס את HSPCs (ראה איור 1 משלימה).

6. הכנת העוברים חלופה מועדפת

  1. פיפטה 10 הפומבית העוברים אל המאגר העליון פוליסטירן מ ל סיבוב התחתית התחתונה עם כובע מסננת תא 35 μm.
  2. עם פיפטה, יש לשטוף הצינור פטרי עם PBS סטרילי (עם Ca2 + או Mg2 +), פתרון העברת מ ל פוליסטירן שפופרת המכילה מסונן תאים מהשלב 6.1. חזור עד 4 מ של נוזל נמצא בצינור פוליסטירן מ.
    הערה: PBS, DPBS או פתרונות אחרים במאגר מול עשוי לשמש בשלב זה, כל עוד הם אינם מכילים Ca2 + או מ ג2 +
  3. צנטריפוגה צינורות-4 ° C ו- g x 300 במשך 5 דקות כדי הצניפה המדגם תא הומוגני. עם פיפטה, להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ברכבת התחתית התחתונה עגול. לטפל כדי לא לשבש את התאים מגורען בתחתית הצינורית. Resuspend תאי μL 100 ל- PBS.

7. הכנת Methylcellulose

  1. צור 1 x פתרון מלאי מלאה methylcellulose (טבלה 1) ולהוסיף 2.5 מ ל צינורות סטרילי סיבוב המדרגה 14 מ עם 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם. להשתמש שפופרת אחת עבור כל תנאי נבדק.
  2. הוסף ציטוקינים, מולקולות קטנות או סוכנים אחרים כדי לחקור כדי כל דגימה.
    1. התמיינות תאים מיאלואידים, הוסיפו 1% קרפיון סרום ו- 0.3 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי גרנולוציט המושבה מגרה פקטור (Gcsf)34 methylcellulose לבינוני. ראה Svoboda. et al. 37 עבור תיאור מלא על איך ליצור ציטוקינים סרום ו רקומביננטי קרפיון.
    2. עבור בידול erythroid, להוסיף 1% קרפיון סרום ו- 0.1 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי אריתרופויאטין (Epo)38 methylcellulose בינונית.
    3. לבחון אבות multilineage, מוסיפים Epo Gcsf.
      התראה: ציטוקינים ותוספים צריך לא סה כ יותר מ-10% מהנפח הכולל, כפי המדיום לא יהיה מספיק צמיגה להבחין מושבות בודדות.

8. תוספת של חלופה מועדפת העוברים אל Methylcellulose

  1. בעזרת פיפטה של, להוסיף 100 μL של העוברים 10 dissociated אל פני השטח של methylcellulose מוכן עם סרום ציטוקינים, קרפיון רקומביננטי. כובע המכסה, מערבולת בעדינות כדי homogenize באופן מלא דוגמאות. כל שפופרת עכשיו להכיל הרקמה dissociated של 10 עוברי.
  2. באמצעות 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם, aliquot 1 מ"ל מדגם פטרי נפרד 35 מ מ 2. ודא כי המדגם באופן מלא מפוזרים על צלחת פטרי. חזור על כל דגימה.
  3. מקום 35 מ מ צלחות פטרי עם תאים methylcellulose לתוך 15 ס מ פטרי. על כל מנה 15 ס מ, להוסיף אחד צלחת פטרי 35 מ מ עם 5 מ ל מים סטריליים כדי ללחלוח הדגימות. תקופת דגירה-32 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 של 7-10 ימים.

9. ויזואליזציה של המושבה, נגזר HSPC ויוצרים יחידות (CFUs)

  1. לאחר המקננת 7 ימים, במקום דוגמאות על גבי מיקרוסקופ הפוכה בגיל 40-100 X עבור ויזואליזציה וספירה. בשלב זה, מושבות בודדות יכול להיות מבודדת עם פיפטה ונחשפו ניתוח מכתים ו/או הגן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך את המספרים HSPC דג זברה עובריים, 48 hpf העוברים היו מתעכל, מצופה ב- methylcellulose עם גורמי גדילה hematopoietic תומכת אקסוגני, מודגרות במשך 7 ימים (איור 1א'). לאחר 7 ימים, יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) היו ספורים (איור 1B), תמונה (איור 1C). על ידי שליטה של ציטוקינים שונים הוסיף, אחד יכול לשלוט בסוגים של מושבות המיוצר: Epo הוא הכרחי עבור ביד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת דגם דג זברה הפך מודל יעיל, יעילה וזולה עבור הלומדים hematopoiesis חוליות פרימיטיביים ומוחלטת. דור של מבחני מהיר, זול, והוא מציג כמה בעיות טכניות יכול להיות מנוצל עבור בדיקות מולקולות קטנות, ניתוח מוטציה עוברי שחקרתי חשוב HSPC ביולוגיה מולקולרית מסלולים. במבחנה ציפוי של HSPCs של דג זברה בוגרת היא שיטה יעילה כדי ללמוד מוטגנזה מכוונת, ציטוקינים ו פגמים hematopoietic. פרוטוקול זה מתבססת על מחקרים אלה, אבל מנצל דג זברה עובריים. החלת מבחני אלה מתחלקים דג זברה מאפשר איסוף נתונים מהיר יותר, השימוש של המרחב הפיזי פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIH: K01-DK087814-01A1 כדי D.L.S.), התוכנית אוניברסיטת מדינת קליפורניה עבור חינוך ומחקר בתחום הביוטכנולוגיה (CSUPERB: בקרה מולקולרית של הגומחה Hematopoietic חוליות כדי D.L.S.) מ במשרד לתארים צ'יקו באוניברסיטה של מדינת קליפורניה (ל A.C.B.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% אלבומין בסרום בקר בטכנולוגיות MDM StemCell של Iscove 9300
DPBS (פי 10) עם סידן2+ ומגנזיום2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 מ"לתא קורנינג Grow10-017-CV
  Ham's F12 500 מ"לCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 מ"לGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 מ"ל (1 מ')Gibco life technologies15-630-080
פניצילין/סטרפטומיצין (5000 יח'/מ"ל
ו-5000 מ"ג/מ"ל) עם L-גלוטמין (200 מ"ל)		קורנינג מדיאטק30-009-CI
ג'נטמיצין סולפט 10 מ"ל (50 מ"ג/מ"ל)קורנינג Mediatech30-005-CR
1.5 מ"ל MCF צינורFisherBrand05-408-129
3 מ"ל 23gx1 מחט הזרקה עם Luer lockBD Safety Glide305905
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאיםCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגולקורנינג פלקון352057
10 מ"מ פוליסטירן איזיגריפ צלחת פטריקורנינג פלקון351008
ליבריז TMרוש סיגמא-אולדריץ'5401119001דיסוציאציה פרוטאז
פרונאזרוש סיגמא-אולדריץ'11459643001דכוריון פרוטאז
15 ס"מ צלחת פטריקורנינג פלקון351058
ABמרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה (ZIRC)ZL1זן דג הזברה השתמש
בדיתיולתרייטול (DTT)סיגמא-אולדריץ'646563

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644(2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HSPCHSPC

מאמרים קשורים