מאמר שיטה

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56855

⸱

22 באוגוסט 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Southwest Hospital, Third Military Medical University

במאמר זה

סיכום

מערבון רגיל סופג פרוטוקול היה אופטימיזציה עבור ניתוח גם 500 hematopoietic גזע או ובתאים בהיקף. אופטימיזציה כרוך זהיר טיפול המדגם תא, הגבלת העברות בין צינורות ו ישירות lysing התאים במאגר מדגם Laemmli.

תקציר

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים נדירה, עם מח העצם העכבר המכיל רק ~ 25,000 פנוטיפי ארוך המונח לאכלס מחדש HSCs. פרוטוקול blotting המערבי היה ממוטבת ומתאים הניתוח של מספר קטן של HSCs (500-15,000 תאים). HSCs פנוטיפי מטוהרים, לספור במדויק, ולא ישירות lysed במאגר מדגם Laemmli. Lysates המכיל מספר שווה של תאים נותחו על ידי נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), האבן החשופה היה מוכן ומעובד בעקבות מערבי רגיל סופג פרוטוקולים. באמצעות פרוטוקול זה, $2,000-5,000 HSCs ניתן לנתח באופן שגרתי, במקרים מסוימים נתונים ניתן להשיג גם 500 תאים, לעומת התאים 20,000 עד 40,000 דיווחו רוב הפרסומים בהיקף. פרוטוקול זה צריך להיות חלים באופן כללי לתאים אחרים hematopoietic, המאפשרת ניתוח שגרתי של מספר קטן של תאים באמצעות הליכים מעבדה סטנדרטיים.

מבוא

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאים עצמי המתחדש יכולים להצמיח כל דם שושלות. הם נדירים יחסית תאים במח העצם, עיבוד ביוכימי ניתוחים קשים. גישות מתאימים לניתוח תאים נדירים, כמו cytometry זרימה, היה מאוד שימושי עבור לכימות כמויות יחסיות של סמני פני שטח התא, חלבונים תאיים. עם זאת, הניתוח של חלבונים תאיים מחייבת את השימוש בטכניקות permeabilization תא כדי לאפשר גישה נוגדן, ולשרוד לא כל epitopes משטח תאים אלה הליכים1,2. בנוסף, נוגדנים מפלים בין מוצרי איזופורמים או ביקוע חלבונים שונים לעיתים קרובות אינם זמינים עבור cytometry זרימה, ולכן החוקרים עדיין מסתמכים על שהכלים המערבי בוודאות סוגים של ניתוחים.

תספיג חלבון ניתוח של תא lysates הוא הליך שגרתי במעבדות רוב. התאים יכולים להיטהר בתנאים מקומיים המשמרים את epitopes של מולקולות על פני התא, תא lysates לאחר מכן ניתן להכין, מנותח. עם זאת, הניתוח של חלבונים בתא יסודי נדיר אוכלוסיות על-ידי המערב כתם תוכל לדרוש המתות חסד מספרים גדולים של בעלי חיים כדי להשיג מספיק תאים. על ידי ביצוע שינויים קטנים במספר שלבים, פרוטוקול blotting המערבית המקובלת היה מסוגל לזהות חלבונים מספר קטן יחסית של HSCs (500-15,000, בהתאם החלבון עניין). ההתאמות כוללים במדויק ספירת תאי, בזהירות הטיפול בגדר תא, הפחתת העברות של תאים בין צינורות כדי למזער את אובדן התא, ו lysing מספר מוגדר של תאים עם טעינה מרוכז מאגר המכיל פרוטאוזום ו מעכבי פוספטאז. דיווחים שפורסמו רבים כוללים שהכלים המערבי שהושג עם 20,000 או יותר HSCs3,4,5,6,7; נוהל פשוט זה יקטין את מספר התאים ואת חיות ניסוי הדרושה להפקת נתונים שווה ערך לפי בין קיפול 4 ו- 40. הפרוטוקול נועד לנרמל את התוצאות על בסיס לכל תא, במקום של בקרה פנימית. פעולה זו מאפשרת זיהוי של הכללית הפחתות רמות חלבון אשר ניתן להתעלם אם הנתונים הם מנורמל לפקד פנימי. החשיבות של נרמול על בסיס לכל תא תוארה לניתוח של ג'ין ביטוי נתונים8, אותו העיקרון חל לכימות חלבונים על ידי תספיג חלבון. פרוטוקול ממוטבת זה צריך להיות שימושי עבור כל מי שזקוק לנתח מספר קטן של תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים חייב להתבצע על פי הנחיות טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים. ההליך פותחה עבור הניתוח של מאתר hematopoietic גזע תאים וקדמון (HSCs ו HPs), אך ניתן להתאים לניתוח של אוכלוסיות תאים אחרים.

1. לזרום Cytometry בידוד HSCs מאתר ו HPs

  1. קציר תאים במח העצם מאתר כמתואר ב-6ספרות.
    הערה: בנתונים המוצגים באיור 1 ו- 2 איור, מח העצם היה נקצרו מ C57BL/6J עכברים.
  2. לבצע דלדול שושלת היוחסין של תאים במח העצם באמצעות ערכת דלדול של שושלת היוחסין העכבר ההוראות של היצרן.
  3. דגירה התאים עם נוגדנים נגד סמני פני השטח של התא עניין כמו שמתואר7. בניסויים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, הנוגדנים Sca-1, קיט, Flt3 של שושלת (לין) סמנים Mac1 Gr1, CD3e, B220, Ter119 משמשים.
  4. למיין 2,000-20,000 לין– Sca1+ערכת+ Flt3 תאים– (HSCs) או לין–Sca1–ערכת+ תאים (HPs) לתוך צינורות גלאים 1.5 mL המכיל 0.1 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) עם 2% שור עוברית סרום (FBS).
    הערה: עבור הנתונים שמוצג באיור 1 ו- 2 איור, התאים היו מיון באמצעות Cytometer לזרום עם זרבובית 70 מיקרומטר. אמצעי האחסון המרבי אוסף נמצא 1.4 מ.

2. הכנת הדוגמא

הערה: השלב זה קריטי. תהליך הדגימה בזהירות רבה. בעת הסרת את תגובת שיקוע, להיזהר מאוד שלא להפריע בגדר התא.

  1. צנטריפוגה 1.5 mL צינורות המכיל תאים ממוינים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, g x 500, עבור 5 דק הסר הכל אלא כ- 100 µL של תגובת שיקוע מהתא הצניפה בעדינות באמצעות פיפטה וטיפ pipet 20 µL. נא לא להפריע בגדר.
    1. אם המדגם מכיל תאים פחות מ-5,000 הנפח הכולל של המדגם ממוינים הוא פחות מ 0.2 מ"ל, להעביר את התאים קודם מחייב נמוכים 0.2 מ"ל המבחנות לפני צנטריפוגה.
    2. אם לדוגמה מכיל תאים פחות מ-5,000 אחסון הוא יותר מ- 0.2 מ"ל, לסובב התאים למטה באמצעות צנטריפוגה ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות, ולהסיר הכל חוץ µL 200 של תגובת שיקוע. מחדש להשעות את התאים pelleted µL 200 הנותרים של תגובת שיקוע, ולאחר מכן להעביר את התאים המבחנות 0.2 מ"ל, ספין למטה שוב. להסיר µL כל 20-30 אבל בגדר אחרי שהימרת בסיבוב השני והשהה מחדש את התאים.
  2. Resuspend לתאים משמאל supernatant בצינור. אם יש צורך, להוסיף PBS נוספים ב- 2% FBS/PBS (ניתן להשתמש גם 2% אלבומין שור (BSA) / PBS, או PBS לבד) בריכוז 5 x104 5 x 105 תאים/מ ל....
    הערה: שימוש התא נחשב שנאספו על ידי cytometry כדי להעריך את עוצמת הקול משמש להשעות את התאים.
  3. להשתמש 2-5 µL של התאים מחדש על תנאי לקביעת ריכוז של התא מדויק באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (בעקבות הוראות היצרן) או hemocytometer9.
  4. העברת נפח של מתיחה מחדש תאים המכילים מספר תאים צינורות 1.5 mL החדש הרצוי. לניסוי באיור1, הועברו 2,000, 1,000 או 500 HSCs או HPs. מספר התאים הרצוי תלוי עוצמת האות מתקבל על ידי תספיג, והוא נקבע מדעית. ביצוע ההעברה באמצעות µL 20 או 100 µL גלאים פיפטה עצה.
  5. Centrifuge התאים רוטור דלי מתנדנדים ב 4 ° C, 500 x g, למשך 5 דקות.
  6. כדי להפיק 100 x פתרונות מניות, להמיס מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז ב דימתיל סולפוקסיד בהתאם להוראות היצרן.
  7. להכין מאגר מדגם ' x Laemmli 2 ' על-ידי דילול המאגר מדגם x Laemmli 4 המסופקים על ידי היצרן עם כמות שווה של מים מזוקקים. להוסיף את הכמות המתאימה של המניה 100 x של מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז בריכוז הסופי של מעכבי 2 x 2 מאגר מדגם x Laemmli.
    הערה: המאגר 2 מדגם x Laemmli יכול להתבצע מראש, אך מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז אמור להתווסף מיד לפני הוספת את 2 x Laemmli דוגמת המאגר (בתוספת מעכבי) כדי בגדר תא כדי lyse התאים, כמתואר בשלב הבא.
  8. בזהירות להסיר חלק תגובת שיקוע בגדר תא, וכדי את תגובת שיקוע שנותרו בצינור עם בגדר תא, להוסיף אמצעי שווה 2 מאגר מדגם x Laemmli בתוספת מעכבי פרוטאוזום ו פוספטאז להשגת ריכוז סופי של 500 תאים/µL במאגר מדגם x Laemmli 1.
    הערה: לדוגמה, אם אתה מעביר 2,000 תאים הנפח הכולל של 20 µL את µL 2 של תגובת שיקוע שנותר צינור 2.5 שלב, לאחר צריך שתוציאו את התאים (שלב 2.6) אתה צריך להסיר µL 18 של תגובת שיקוע של בגדר, וכדי להוסיף אמצעי שווה (2 µL) של 2x Laemmli מאגר מדגם להשגת ריכוז סופי של 500 תאים µL במאגר מדגם x Laemmli 1.
  9. Resuspend בגדר כדי ליצור את lysate בהקדם האפשרי. בשלב זה, הדגימות ניתן electrophoresed מיד דרך עמוד מרחביות ג'לים או יכולה להיות snap קפוא נוזלי N2 המאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש עתידי.

3. אלקטרופורזה

  1. מחממים את lysates בתוך גוש חום ב 95 ° C או במים רותחים במשך 5 דקות.
  2. Electrophorese 1-40 µL של lysates (מכיל בין 500 עד 20,000 ושווי תא) דרך ג'לים מרחביות-דף-100V באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים10.
    הערה: הנפח של lysate הטעונות בג'ל נקבע לפי מספר התאים הדרושים כדי ליצור את האות רצוי, יהיה תלוי השפע של החלבון של עניין, האיכות של הנוגדן. הנתונים באיור 1 התקבלו עם 2,000, 1,000 500 תאים המקבילים lysate. הרוחב של הבאר צריך להיות בטווח של 3 מ מ עד 1.5 מ מ. 1.5 מ מ שיניים יכול להיות חתוך מ מסרק זמינים מסחרית עם השיניים רחב יותר באמצעות מספריים.

4. העברת וחסום

הערה: בצע את תספיג בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים11. השלבים מתוארים בקצרה כאן:

  1. Pretreat polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור s 10 ולאחר מכן לשטוף הקרום בקצרה עם מים מזוקקים.
  2. להעביר את החלבון הג'ל מרחביות-דף קרום ועקוב אחר ההוראות במדריך המסופקים על ידי היצרן של מנגנון העברה.
  3. בעקבות העברה, לחסום את הקרום עם 2 מיליליטר 5% שור אלבומין (BSA) ב PBST (PBS עם 0.1% Tween) לילה ב 4 ° C בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים11.

5. נוגדן תיוג

  1. דגירה הקרום עם נוגדנים על מטרף בן לילה ב 4 ° C באמצעות נוגדן דילולים המומלץ על ידי הספק.
    הערה: את הטבלה של החומרים, נוגדנים, הבדיקה והאימות עבור HSCs ו HPs ו של דילולים נוגדנים המתאימים, מוצגות. לבצע תיוג נוגדן באמצעות הליכים סטנדרטיים8.

6. זיהוי

  1. לשטוף את הקרום 3 פעמים, 5 דקות עבור כל כביסה ב PBST בטמפרטורת החדר.
  2. דגירה הקרום עם 2 מ של מאגר chemiluminescence משופרת עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. לזהות את הסימנים באמצעות מערכת הדמיה בעקבות הוראות, של היצרן או autoradiography הסרט ומעבד הסרט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות נציג מ 500-2000 מטוהרים HSCs ו HPs מוצגים באיור 1 ו- 2 איור. האות β-אקטין באיור 1 ניתן להבחין בין מעטים כמו 500 HSCs וטיהרו HPs ממח העצם של עכבר אחד. שימו לב כי להעמיס את lysates לתוך בארות 1.5 מ מ המיוצר אות חזק הרבה יותר מ- 500 HPs מאשר טעינה אל בארות 3.0 מ מ. איור 2 היא אבן חשופה המערבי של EIF4G זירחון של Rps6 (p-Rps6), אשר שניהם מעורבים בוויסות של חלבון תרגום...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סופג המערבי הוא שיטה מקובלת לגילוי חלבונים ספציפיים והפעלה של איתות המסלולים רקמות או תאים. על ידי הצגת שינויים קטנים הליך נפוץ, היינו מסוגלים לזהות באופן שגרתי חלבונים שונים 15 (טבלה של חומרים) ב- 15,000 HSCs, ובחלק מן המקרים תוך 500 HSCs. The most השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם: ספירת התאים במדויק 1), 2) צמצום מספר העברות בין צינורות ו 3) lysing את התאים ישירות עם מאגר מדגם Laemmli. כאשר lysing בגדר תא עם מאגר מדגם Laemmli, מצאנו כי הסרת כל תגובת שיקוע בגדר תא ולא מחדש השעיית זה במאגר מדגם Laemmli, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים להכריז.

תודות

מכוני הבריאות הלאומיים הענק R01 CA149976 (גיל חזן) נתמך עבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן דודציל סולפט (SDS)פישר סיינטיפיקBP166-500SDS-PAGE
TEMEDFisher ScientificBP150-20SDS-PAGE
30% תמיסת אקרילאמידלביס Bio-Rad1610158SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8TEKNOVAT1588SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8TEKNOVAT1068SDS-PAGE
אמוניום פרסולפטפישר מדעיBP179-25SDS-PAGE
מיני-פרוטאן 3 מסרקBio-Rad1653360SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658005EDUSDS-PAGE
Transfer SystemBio-Rad1704155EDUהעברת
PowerPac HC ספק כוחBio-Rad1645052EDUאלקטרופורזה
מערכת הדמיהBio-Rad1708195זיהוי אותות
4x Laemmli מאגר דגימהBio-Rad1610747הכנתדגימת
10x Tris/Glycine/SDS מאגר אלקטרופורזהBio-Rad1610732EDUאלקטרופורזה
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710הכנתדגימת
EDU ערכת העברת RTA Mini PVDF, ל-40 כתמיםBio-Rad1704272 Transfer
מעכב פרוטאז קוקטיילסיגמא11697498001הכנת דגימה
מעכב פוספטאז קוקטייליםGold BiotechnologyGB-450-1הכנת דגימה
EIF4GCell Signaling2469WB נוגדנים, מאומת ב-1000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): איור 2
p-Rps6איתות תאים4858נוגדן WB, מאומת ב-1000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור):
איור 2 אקטין (מצומד HRP)abcamab49900WB, מאומת ב-500 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:5000
התייחסות (איור): איור 1, איור 2
LC-3Abcamab48394נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 5)
S6Cell Signaling2317נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 4)
4EBP1איתות תאים9644נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 4)
p-4EBP1איתות תאים2855נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 4)
נוגדן תא TSC2Cell Signaling4308WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 4)
HSP90איתות תאים4877נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 5)
איתות תאיPTEN9188נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 1)
mTORאיתות תאים2983נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 1)
p-mTORCell Signaling5536נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 1)
PP2ABאיתות תאים4953נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 1)
p-AMPKaCell Signaling2535WB נוגדן, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:1000
התייחסות (איור): ref5 (איור 1)
אקטיןסנטה קרוזsc-47778נוגדן WB, מאומת ב-15000 תאים
ריכוז נוגדנים: 1:3000
התייחסות (איור): ref5 (איור 4)
ערכת דלדול שושלת (עכבר)Miltenyi Biotec130-090-858טיהור תאי גזע ואב המטופויאטיים עמודות
LSMiltenyi Biotec130-041-305טיהור תאי גזע ואב המטופויאטיים
SCFPeproTech250-03גירוי זרחון
APC-Cy7 c-kit נוגדןThermoFisherA15423מיון תאים
אנטי-B220ThermoFisher48-0452-82מיון תאים
אנטי-CD3eThermoFisher48-0031-82מיון תאים
אנטי-Mac1ThermoFisher48-0112-82מיון תאים
אנטי-Gr1ThermoFisher48-5931-82מיון תאים
אנטי-Ter119ThermoFisher48-5921-82מיון
תאים צלחות מרווח עם 1.0 מ"מ משולב SpacersBio-Rad1653311SDS-PAGE
BSAמוצרי מחקר בינלאומייםA30075סרום חוסם ממברנה
אטלנטה ביולוגיתA12450תוסף בינוני
מונה תאיםInvitrogenAMQAF1000ספירת תאים
המוציטומטרThermoFisher  S17040ספירת תאים
flimDenville ScientificE3012
זיהוי אותות מעבד סרט רפואיKonicaSRC-101Aזיהוי אותות
Supersignal West Femto רגישות מקסימלית מצעTherom Scientific34096זיהוי אותות
Allegra X-15R צנטריפוגה (רוטור SX4750A)בקמן קולטרX-15Rדגימה הכנת
סולם חלבון BLUEstainGold BiotechnologyP007-500סדרן תאים אלקטרופורזה
BDFACSAria IIהכנת דגימה
IncublockDenville ScientificI0510אלקטרופורזה
EDU נוגדן

מקורות

  1. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  2. Du, J., et al. Signaling profiling at the single-cell level identifies a distinct signaling signature in murine hematopoietic stem cells. Stem Cells. 30 (7), 1447-1454 (2012).
  3. Signer, R. A., Magee, J. A., Salic, A., Morrison, S. J. Haematopoietic stem cells require a highly regulated protein synthesis rate. Nature. 509 (7498), 49-54 (2014).
  4. Wang, J., et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage. Cell. 148 (5), 1001-1014 (2012).
  5. Hoshii, T., et al. mTORC1 is essential for leukemia propagation but not stem cell self-renewal. J Clin Invest. 122 (6), 2114-2129 (2012).
  6. Signer, R. A., et al. The rate of protein synthesis in hematopoietic stem cells is limited partly by 4E-BPs. Genes Dev. 30 (15), 1698-1703 (2016).
  7. Cai, X., et al. Runx1 deficiency decreases ribosome biogenesis and confers stress resistance to hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Stem Cell. , (2015).
  8. Loven, J., et al. Revisiting global gene expression analysis. Cell. 151 (3), 476-482 (2012).
  9. JoVE Science Education Database. Using a Hemoacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  10. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  11. JoVE Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2017).
  12. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  13. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS PAGELaemmli

מאמרים קשורים