פרוטוקול זה מתאר הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות הספוחה עם תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים יכול לשמש כדי לפקח פיוז'ן מקרופאג של דגימות החיים ומאפשרת סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של דגימות קבוע .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיית משטחי זכוכית אופטית באיכות ללמוד פיוז'ן מקרופאג
במאמר זה
סיכום
תקציר
להמחיש את היווצרות תאי ענק multinucleated (MGCs) מן החי דגימות מאתגרת בשל העובדה כי ביותר טכניקות הדמיה בשידור חי דורשות הפצת האור מבעד לזכוכית, אבל על זכוכית פיוז'ן מקרופאג הוא אירוע נדיר. פרוטוקול זה מציג הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות מספר היכן ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים הופכת זכוכית משטח fusogenic. ראשית, הכנה של משטחי זכוכית נקי כמתחילה חומר עבור שינוי פני השטח המתואר. שנית, שיטת מסופק עבור ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים להמרת הלא-fusogenic זכוכית מצע fusogenic. שלישית, פרוטוקול זה מתאר ייצור של micropatterns משטח המקדמים רמה גבוהה של שליטה ייתכן על היווצרות MGC. לבסוף, בדיית כלי הזכוכית התחתונה מתואר. דוגמאות לשימוש במבחנה התאים במערכת זו כמודל ללמוד פיוז'ן מקרופאג ויצירת MGC מוצגים.
מבוא
היווצרות של MGCs מלווה מספר מצבים פתולוגיים בגוף האדם מכובד על ידי דלקת כרונית1. למרות הסכם זה mononucleated מקרופאגים הפתיל טופס MGCs2, אך מספר מחקרים הראו היתוך בהקשר עם חיים דגימות3,4. זה בגלל משטחי זכוכית נקי הנדרשים עבור רוב טכניקות הדמיה לא לקדם פיוז'ן מקרופאג כאשר המושרה על ידי ציטוקינים דלקתיים5. אכן, אם זכוכית נקי משמש מצע פיוז'ן מקרופאג, ואז נמוך מטרות ביניים ההגדלה (קרי, X 10-20), יותר מ 15 h של רציפות הדמיה לעיתים קרובות נדרשים לקיים אירוע יחיד פיוז'ן.
על יד אחרים, משטחי פלסטיק fusogenic (למשל, permanox) או כיתה בקטריולוגית פלסטיק לקדם פיוז'ן2. עם זאת, הדמיה דרך פלסטיק הוא בעייתי, כיוון המצע עבה, מחליקי אור. זה מסבך הדמיה מאז זמן עבודה מרחק (LWD) מטרות נדרשים. עם זאת, המטרות LWD יש בדרך כלל איסוף קיבולת לעומת עמיתו שלהם תוקן coverslip אור נמוכה. יותר, טכניקות לנצל שינויים הקוטביות של האור עובר דרך הדגימה כגון התערבות דיפרנציאלית ניגודיות הם בלתי אפשרי מאחר פלסטיק הוא birefringent. המחסומים הקשורים לשימוש של פלסטיק בעץ־תה עוד יותר העובדה כי זה בלתי אפשרי לחזות איפה היווצרות MGC/פיוז'ן מקרופאג תתרחש על פני השטח. יחד, מגבלות אלה להגביל את החזיית פיוז'ן מקרופאג כדי שלב אופטיקה חדות, מורחב הכולל משכים הדמיה (> 15 שעות רצוף), ברזולוציה נמוכה.
לאחרונה זוהו משטח זכוכית fusogenic מאוד כשניצח מיקרוסקופ ברזולוציה סופר יחיד מולקולה עם קבוע מקרופאגים/MGCs4. התבוננות זו היה מפתיע כי לנקות זכוכית משטחים לקדם פיוז'ן בקצב נמוך מאוד של ~ 5% לאחר 24 שעות בנוכחות אינטרלוקין-4 (IL-4) כפי שנקבע על ידי היתוך גרעיני אינדקס4. מצאנו כי היכולת לקדם פיוז'ן היה עקב זיהום oleamide. ספיחה של oleamide או תרכובות אחרות שהכיל באופן דומה ארוכי שרשרת פחמימנים עשה את fusogenic זכוכית. רוב fusogenic מורכבים (פרפין) הייתה micropatterned, שהצפיפות רמה גבוהה של שליטה ייתכן פיוז'ן מקרופאג עלייה 2-fold מספר האירועים פיוז'ן נצפתה בתוך אותה כמות זמן בהשוואה permanox. משטחים אלה איכות אופטית סיפק הצצה ראשונה לתוך מורפולוגיות ו קינטיקה המפקחים על היווצרות של MGCs ב חי דגימות.
ב פרוטוקול זה אנו מתארים את ייצור מגוון רחב של משטחי זכוכית זה יכול לשמש כדי לפקח על היווצרות של MGCs מן החי דגימות. בנוסף, אנו מראים כי משטחים אלה נתונות שיטות סופר-זיהוי רחוק-שדה. משטח פבריקציה נוספת תלויה מטרת הניסוי, כל השטח המתואר בדוגמאות הקשורות בטקסט שתמשיך.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלים לנצל חיות אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות-Mayo Clinic, Janelia מחקר בקמפוס אוניברסיטת המדינה של אריזונה.
1. הכנת ניקיתי חומצה מכסה זכוכית
הערה: ייתכן כיסוי זכוכית רכשה מיצרנים רבים לא תהיה נקייה כצפוי. לשקול באופן שגרתי ניקוי אצוות של כיסוי זכוכית לפני כל הליך שבו מעורב מיקרוסקופ.
- לרכוש לכתחילה גבוהה כיסוי זכוכית. לקחת טיפול מיוחד לבחור בעובי הנכון (או 0.17 0.15 מ"מ).
הערה: הבחירה של עובי כיסוי זכוכית תלוי המטרה מיקרוסקופ, רשומה ישירות החבית אובייקטיבית. - דגירה על חיפוי זכוכית 12 מ' חומצה הידרוכלורית בשכונה fume כימי מאוורר היטב עבור h 1 עם sonication (42 kHz, 70 W). חזור על שלב זה עבור שתי שעות נוספות עם טרי 12 M HCl.
- למלא גביע נפרד עם הנדסה גנטית מים ולהוסיף את מכסה הזכוכית. Sonicate הזכוכית המכסה למשך 5-10 דקות בשכונה כימי מאוורר היטב. חזור על שלב זה עשר פעמים.
- דגירה על זכוכית מכסה אצטון טהור בשכונה כימי מאוורר היטב למשך 30 דקות עם sonication. חזור על שלב זה עבור שתי פעמים נוספות.
- למלא גביע נפרדות עם מים הנדסה גנטית סטרילי ולהוסיף את מכסה הזכוכית. Sonicate הזכוכית המכסה למשך 5-10 דקות בשכונה כימי מאוורר היטב. חזור על שלב זה עשר פעמים.
- דגירה על זכוכית מכסה 100% אתיל אלכוהול בשכונה כימית למשך 30 דקות עם sonication. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
הערה: טוהר אתיל אלכוהול חשוב. מזהמים בצורה של מוצקים מומסים יתייבש על הזכוכית ולקדם פיוז'ן מקרופאג. - לאחסון לטווח ארוך, למקם את הזכוכית המכסה ניקיתי חומצה במיכל מלא טהור אתיל אלכוהול. לחלופין, יבש הזכוכית המכסה עם גז חנקן, בחנות desiccator ואקום.
2. הכנת משטחים אופטיים Fusogenic באיכות
- להמיס נטולת דימתיל סולפוקסיד התכה גבוהה נקודת פרפין, טולואן הנדסה גנטית.
הערה: מניות ריכוזים מתבצעים ב- 10 מ"ג/מ"ל, נמצאים מדולל 1:9 טולואן הנדסה גנטית כדי להפוך 1 מ"ג/מ"ל הפתרון עובד.
התראה: טולואן שצריך לנהוג בזהירות כמו teratogen. תשליך טולואן בתוכנית היגיינה כימי מוסדיים. - החל פרפין עובד פתרון זכוכית חיפוי יבש ניקיתי חומצה בווליום אחיד המכסה את פני השטח של זכוכית. Decant פתרון עודף ויבש הזכוכית המכסה עם גז חנקן או אוויר. לשימוש הכנה בתפזורת, צנצנת Coplin נועד להכיל את מכסה הזכוכית.
- פולנית הזכוכית הכיסוי לפי 3 קווי ציר x ולפי הבא 3 משיכות בציר y עם מגבון נטולת מוך (ראה טבלה של חומרים).
- מיד לפני הניסוי התנהלה, לשטוף את הזכוכית כיסוי סטרילי מים הנדסה גנטית ולאחר מכן לחטא למשך 15-30 דקות עם האור האולטרה סגול בשכונה בטיחות ביולוגית. לחלופין, לעקר את הזכוכית המכסה על ידי הקרנה אתילן אוקסיד או גאמא.
3. פחמימנים Micropatterning המכילים תרכובות להגבלת פיוז'ן כדי מראש אזורים
- יבש הזכוכית המכסה ניקיתי חומצה, לשתק את הזכוכית על משטח שטוח.
- בזהירות באמצעות מלקחיים, לטבול רשת שידור זהב finder מיקרוסקופ אלקטרונים בהפתרון עובד של compound(s) פחמימנים. בוחרים תרכובת פחמימנים שעונה היעד הסופי של הניסוי (ראה טבלה 1). לפתיל פתרון עודף משם על-ידי הקשה בעדינות את הרשת על נייר סינון, מיד למקם את הרשת במרכז הזכוכית המכסה. לאפשר את טולואן לייבוש למשך 2 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא.
- ודא כי הרשת היא מודבקת הזכוכית על-ידי היפוך בעדינות את הזכוכית. אם הרשת לניתוק וחזור על שלב מספר 3.2 באמצעות כוס כיסוי חדשה.
הערה: אם מסך פלזמה מנקה אינה זמינה, להשמיט שלב 3.4. - פלזמה תנקה את הזכוכית המכסה על ידי טיפול עם ואקום גז פלסמה.
הערה: הרשת finder משמשת כמסיכה להגן על השטח שמתחת הספוחה עם ארוכי שרשרת פחמימנים מ הפלזמה. האזורים שאינם הם מוגנים על-ידי הרשת מעובדים שאינן fusogenic על ידי חשיפה פלזמה. כמות הזמן שהזכוכית המכסה היא לחשוף כדי פלזמה צריך להיקבע מדעית. - בעזרת מלקחיים פיין-עצה, הסר בזהירות את הרשת ממשטח הזכוכית כדי לחשוף את micropattern.
4. בדיית כלי הזכוכית התחתונה
- לקדוח חור עגול 6-10 מ מ בחלק התחתון של 35 מ מ פלסטיק באמצעות מקדחה שלב צלחת פטרי.
הערה: חיוני להשתמש מקדחה צעד כדי ליצור קצוות חלקים. אם הקצוות גסות מדי, הזכוכית המכסה לא יקשרו שטוחות על החלק התחתון של המנה. משטחים שטוחים מושלם להקשות על מיקרוסקופ. - לערבב היטב, דגה elastomer סיליקון לפי הוראות היצרן (קרי, polydimethylsiloxane; PDMS).
- להחיל ציפוי דק של אלסטומר המוערכת רק עד הקצה (קריcircumscribing) החור.
הערה: elastomer אמור להופיע כלהקה רציפה אמנם דק סביב החור. - בעדינות חלות הזכוכית המכסה fusogenic (המתוארת בסעיף 2), או יבש ניקיתי חומצה כיסוי הזכוכית (המתוארת בסעיף 1) המנה על מנת לכסות את הבור מוקף elastomer. ודא כי הזכוכית המכסה מופיע מיושר עם החלק התחתון של המנה מרחיב מעבר קוטר החור כך חלק ניכר של הזכוכית היא בקשר עם הפלסטיק. לרפא את elastomer על ידי אפייה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 2-3 h.
- אם fusogenic זכוכית הוא המועדף, UV לעקר את התאים מאכל והתרבות על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. עם זאת, אם micropattern הוא המועדף, המשך לשלב 3.2 להכנה micropattern (פלזמה גז בשימוש במהלך micropatterning sterilizes המנה, חריפה זוגות PDMS זכוכית).
5. איסוף מקרופאגים Thioglycollate-elicited
- להזריק עכברים C57BL/6 בן שבוע 8 עם 0.5 מ של פתרון סטרילי של thioglycollate 4% ברואר כפי שתואר לעיל3,4,6.
- שבעים ושתיים שעות מאוחר יותר, להרדימו על פי טיפול בבעלי חיים מאושרים, השתמש בהנחיות, לאסוף מקרופאגים על ידי שטיפת הצפק בתמיסת כקרח באגירה פוספט בתוספת 5 מ מ ethylenediaminetetraacetate.
- Centrifuge של המקרופאגים ב g x 300 למשך 3 דקות ו resuspend ב 1 מ"ל של DMEM:F12 בתוספת 15 מ מ HEPES, אנטיביוטיקה % FBS ו- 1% 10 (תרבות בינוני).
הערה: התאים נספרים לאחר מכן עם hemocytometer נויבאואר. מקרופאגים מדולל על הריכוז המתאים, המוחל על המשטחים. מספר התאים כדי להחיל על משטח נתון יש לשקול בזהירות על ידי החוקר לצורך השאלה ניסיוני. התייעץ עם סטנדרטים ידועים בספרות העיקרית. - לאחר 30 דקות לשטוף את המשטחים עם HBSS בתוספת 0.1% BSA כדי להסיר תאים שאינם מחסידי, ולהחליף בינונית תרבות טריים. להחזיר את התרבויות החממה (5% CO2 באוויר ב 37 מעלות צלזיוס).
- שעתיים מאוחר יותר, תשאף המדיום והחלף בינוני תרבות בתוספת 10 ננוגרם למ"ל של IL-4. תמונה התאים כמתואר4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרמטרים physicochemical של חומרים יש השפעה דרמטית על מידת מקרופאג fusion7,8,9,10. יתר על כן, השטח מזהמים ידועים כדי לקדם פיוז'ן מקרופאג11. לכן חשוב נקי כדי להתחיל עם כיסוי זכוכית כפקד שלילי עבור פיוז'ן מקרופאג. כאשר ניקה כפי שמתואר פרוטוקול 1, הזכוכית המכסה היא במיוחד שטוח עם תכונות פני השטח, ברור אין בעוד ספיחה של ארוכי שרשרת פחמימנים ו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הצורך לזהות ולפתח לאחר מכן משטחי זכוכית אופטית באיכות המקדמים פיוז'ן מקרופאג נבע מן העובדה עד מחקר שפורסם לאחרונה לא ישירות דמיינו פיוז'ן מקרופאג בהקשר של חיים דגימות3, 4. זה בשל העובדה כי משטחי פלסטיק fusogenic המשמשים בדרך כלל דורשים LWD מטרות, מוגבלות במידה רבה לאופטיקה חדות שלב. מחסומים אלה היו להתגבר על ידי הנדסה על משטח זכוכית אופטית באיכות לא רק קידום שיעור יוצא דופן של פיוז'ן מקרופאג, אך פניני מידה מפתיעה של שליטה מרחבית על היווצרות של MGCs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
אנו מאחלים להודות חברים של Ugarova מעבדה, חוקרים במרכז על חילוף החומרים וביולוגיה וסקולרית לדיון מועיל של עבודה זו. ג'יימס פאוסט מבקש להביע את תודתי כדי המדריכים בקורס האירופי לביולוגיה מולקולרית מעבדה סופר רזולוציה מיקרוסקופיה של בשנת 2015. אנו רוצים להודות Khuon הילה זיו-Janelia על העזרה עם הכנת הדוגמא עבור LLSM. במהלך הסקירה ואת הצילומים חלקים של עבודה זו ג'יימס פאוסט נתמכה על ידי מלגת T32 (5T32DK007569-28). המרכיב סריג אור גיליון של עבודה זו נתמכה על ידי HHMI ואת בטי גורדון מור קרן. T.U. ממומן על ידי NIH הענק HL63199.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מנקה פלזמה | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| רשת Finder | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | G400F1-Au | כל רשת TEM זהב תעבוד |
| זכוכית כיסוי (22x22 מ"מ) | Thor Labs | CG15CH | השתמש רק בזכוכית כיסוי מחמירה גבוהה |
| שעוות פרפין | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | חייב להיות &אלפא;-נטול טוקופרול אם מוחלף |
| אולאמיד | סיגמא אולדריץ' | O2136 | להכין |
| טרי איזופרופנול | סיגמא אולדריץ' | 278475 | |
| טולואן | סיגמא אולדריץ' | 244511 | |
| אצטון | VWR אינטרנשיונל | BDH1101 | |
| אתנול | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 15050 | להשתמש נמוך מומס מוצקים אתנול |
| חומצה הידרוכלורית | Fischer Scientific | A144C-212 | שימוש לשטיפת חומצה כיסוי זכוכית |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | מערבבים ביחס של 1:10 וריפוי ב-50 מעלות; C עבור צלחת פטרי 4 שעות |
| 35 מ"מ | סנטה קרוז ביוטק | sc-351864 | |
| דומונט מס' 5 מלקחיים | מיקרוסקופיה אלקטרונית | 72705 | אידיאלי להסרת רשת TEM בסעיף 3.5 |
| FBS | אטלנטה ביולוגי | S11550 | |
| DMEM:F12 | קורנינג | 10-092 | מכיל 15 מ"מ HEPES |
| עט / | סטרפט קורנינג | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| תמיסת BSA | Sigma Aldrich | A9576 | שימוש ב-0.1% ב-HBSS לשטיפת מקרופאגים שאינם דבקים |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot ב-10 μ גרם/מ"ל ומאחסנים ב-20 מעלות; C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | שימוש עבור דגימות קבועות או טכניקות שאינן דורשות חומרי ניגוד |
| עכברי eGFP-LifeAct | n/ | a n/a לשימוש | בהדמיה פלואורסצנטית חיה |
| Kimwipe Kimberly | Clark | 34155 | השתמש לליטוש משטחים נספגים פחמימנים |
מקורות
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
