פרוטוקול זה מתאר הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות הספוחה עם תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים יכול לשמש כדי לפקח פיוז'ן מקרופאג של דגימות החיים ומאפשרת סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של דגימות קבוע .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיית משטחי זכוכית אופטית באיכות ללמוד פיוז'ן מקרופאג
במאמר זה
סיכום
תקציר
להמחיש את היווצרות תאי ענק multinucleated (MGCs) מן החי דגימות מאתגרת בשל העובדה כי ביותר טכניקות הדמיה בשידור חי דורשות הפצת האור מבעד לזכוכית, אבל על זכוכית פיוז'ן מקרופאג הוא אירוע נדיר. פרוטוקול זה מציג הזיוף של משטחי זכוכית אופטית באיכות מספר היכן ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים הופכת זכוכית משטח fusogenic. ראשית, הכנה של משטחי זכוכית נקי כמתחילה חומר עבור שינוי פני השטח המתואר. שנית, שיטת מסופק עבור ספיחה של תרכובות המכילות ארוכי שרשרת פחמימנים להמרת הלא-fusogenic זכוכית מצע fusogenic. שלישית, פרוטוקול זה מתאר ייצור של micropatterns משטח המקדמים רמה גבוהה של שליטה ייתכן על היווצרות MGC. לבסוף, בדיית כלי הזכוכית התחתונה מתואר. דוגמאות לשימוש במבחנה התאים במערכת זו כמודל ללמוד פיוז'ן מקרופאג ויצירת MGC מוצגים.
מבוא
היווצרות של MGCs מלווה מספר מצבים פתולוגיים בגוף האדם מכובד על ידי דלקת כרונית1. למרות הסכם זה mononucleated מקרופאגים הפתיל טופס MGCs2, אך מספר מחקרים הראו היתוך בהקשר עם חיים דגימות3,4. זה בגלל משטחי זכוכית נקי הנדרשים עבור רוב טכניקות הדמיה לא לקדם פיוז'ן מקרופאג כאשר המושרה על ידי ציטוקינים דלקתיים5. אכן, אם זכוכית נקי משמש מצע פיוז'ן מקרופאג, ואז נמוך מטרות ביניים ההגדלה (קרי, X 10-20), יותר מ 15 h של רציפות הדמיה לעיתים קרובות נדרשים לקיים אירוע יחיד פיוז'ן.
על יד אחרים, משטחי פלסטיק fusogenic (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
נהלים לנצל חיות אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש ועדות-Mayo Clinic, Janelia מחקר בקמפוס אוניברסיטת המדינה של אריזונה.
1. הכנת ניקיתי חומצה מכסה זכוכית
הערה: ייתכן כיסוי זכוכית רכשה מיצרנים רבים לא תהיה נקייה כצפוי. לשקול באופן שגרתי ניקוי אצוות של כיסוי זכוכית לפני כל הליך שבו מעורב מיקרוסקופ.
- לרכוש לכתחילה גבוהה כיסוי זכוכית. לקחת טיפול מיוחד לבחור בעובי הנכון (או 0.17 0.15 מ"מ).
הערה: הבחירה של עובי כיסוי זכוכית תלוי המטרה מיקרוסקופ, רשומה ישירות החבית אובייקטיבית. - דגירה על חיפוי זכוכית 12 מ' חומצה הידרוכלורית בשכונה fume כימי מאוורר היטב עבור h 1 עם sonication (42 kHz, 70 W). חזור על ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרמטרים physicochemical של חומרים יש השפעה דרמטית על מידת מקרופאג fusion7,8,9,10. יתר על כן, השטח מזהמים ידועים כדי לקדם פיוז'ן מקרופאג11. לכן חשוב נקי כדי להתחיל עם כיסוי זכוכית כפקד שלילי עבור פיוז'ן מקרופאג. כאשר ניקה כפי שמתואר פרוטוקול 1, הזכוכית המכסה היא במיוחד שטוח עם תכונות פני השטח, ברור אין בעוד ספיחה של ארוכי שרשרת פחמימנים ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הצורך לזהות ולפתח לאחר מכן משטחי זכוכית אופטית באיכות המקדמים פיוז'ן מקרופאג נבע מן העובדה עד מחקר שפורסם לאחרונה לא ישירות דמיינו פיוז'ן מקרופאג בהקשר של חיים דגימות3, 4. זה בשל העובדה כי משטחי פלסטיק fusogenic המשמשים בדרך כלל דורשים LWD מטרות, מוגבלות במידה רבה לאופטיקה חדות שלב. מחסומים אלה היו להתגבר על ידי הנדסה על משטח זכוכית אופטית באיכות לא רק קידום שיעור יוצא דופן של פיוז'ן מקרופאג, אך פניני מידה מפתיעה של שליטה מרחבית על היווצרות של MGCs.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
תודות
אנו מאחלים להודות חברים של Ugarova מעבדה, חוקרים במרכז על חילוף החומרים וביולוגיה וסקולרית לדיון מועיל של עבודה זו. ג'יימס פאוסט מבקש להביע את תודתי כדי המדריכים בקורס האירופי לביולוגיה מולקולרית מעבדה סופר רזולוציה מיקרוסקופיה של בשנת 2015. אנו רוצים להודות Khuon הילה זיו-Janelia על העזרה עם הכנת הדוגמא עבור LLSM. במהלך הסקירה ואת הצילומים חלקים של עבודה זו ג'יימס פאוסט נתמכה על ידי מלגת T32 (5T32DK007569-28). המרכיב סריג אור גיליון של עבודה זו נתמכה על ידי HHMI ואת בטי גורדון מור קרן. T.U. ממומן על ידי NIH הענק HL63199.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מנקה פלזמה | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| רשת Finder | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | G400F1-Au | כל רשת TEM זהב תעבוד |
| זכוכית כיסוי (22x22 מ"מ) | Thor Labs | CG15CH | השתמש רק בזכוכית כיסוי מחמירה גבוהה |
| שעוות פרפין | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | חייב להיות &אלפא;-נטול טוקופרול אם מוחלף |
| אולאמיד | סיגמא אולדריץ' | O2136 | להכין |
| טרי איזופרופנול | סיגמא אולדריץ' | 278475 | |
| טולואן | סיגמא אולדריץ' | 244511 | |
| אצטון | VWR אינטרנשיונל | BDH1101 | |
| אתנול | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 15050 | להשתמש נמוך מומס מוצקים אתנול |
| חומצה הידרוכלורית | Fischer Scientific | A144C-212 | שימוש לשטיפת חומצה כיסוי זכוכית |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | מערבבים ביחס של 1:10 וריפוי ב-50 מעלות; C עבור צלחת פטרי 4 שעות |
| 35 מ"מ | סנטה קרוז ביוטק | sc-351864 | |
| דומונט מס' 5 מלקחיים | מיקרוסקופיה אלקטרונית | 72705 | אידיאלי להסרת רשת TEM בסעיף 3.5 |
| FBS | אטלנטה ביולוגי | S11550 | |
| DMEM:F12 | קורנינג | 10-092 | מכיל 15 מ"מ HEPES |
| עט / | סטרפט קורנינג | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| תמיסת BSA | Sigma Aldrich | A9576 | שימוש ב-0.1% ב-HBSS לשטיפת מקרופאגים שאינם דבקים |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot ב-10 μ גרם/מ"ל ומאחסנים ב-20 מעלות; C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | שימוש עבור דגימות קבועות או טכניקות שאינן דורשות חומרי ניגוד |
| עכברי eGFP-LifeAct | n/ | a n/a לשימוש | בהדמיה פלואורסצנטית חיה |
| Kimwipe Kimberly | Clark | 34155 | השתמש לליטוש משטחים נספגים פחמימנים |
מקורות
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487(1995).
- Helming, L., Gordon, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
