מאמר שיטה

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

DOI:

10.3791/56889

⸱

1 בינואר 2018

 ,  , 
1Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד ללמוד תהליכים תאיים במהלך ההמרה גורל התא ב Caenorhabditis elegans ויוו. באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר ביטוי יזם מונחה חום-שוק של נוירון בתדר גורל שעתוק הגורם צ'ה-1 מציאה RNAi בתיווך דלדול של כרומטין מווסת גורם לין-53 נבט לתא נוירון התכנות יכול להיות שנצפו אין ויוו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחקר התהליכים הביולוגיים תא במהלך המרת את זהותם של סוגי תאים ספציפיים מספק תובנות מנגנון חשוב זה לשמור ולהגן על זהויות הסלולר. ההמרה של תאי הנבט לתוך נוירונים ספציפיים של נמטודות Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא כלי רב עוצמה עבור ביצוע מסכי גנטית על מנת לנתח מסלולים רגולטוריים אשר מגנה על זהויות תא הוקמה. תכנות מחדש של תאים נבט לסוג מסוים של נוירונים כינה ASE דורש חיות הטרנסגניים לאפשר ביטוי יתר רחבה של שעתוק Zn-האצבע פקטור (TF) צ'ה-1. צ'ה אנדוגני-1 מתבטאת אך ורק שני נוירונים הראש והוא נדרש לציין את גורל הנוירונים glutamatergic ASE, אשר ניתן לאבחן בקלות על ידי הכתבת gcy-5prom::gfp . גן טרנס המכיל חום-הלם מונחה יזם צ'ה-1 ג'ין ביטוי הבונה מאפשר ביטוי שגויה רחבה של צ'ה-1 החיה כולו על טיפול חום-הלם. השילוב של RNAi נגד גורם מווסת כרומטין לין-53, ביטוי יתר חום-הלם-induced צ'ה-1 מוביל התכנות של תא נבט תאים דמויי נוירון ASE. נתאר כאן את הליך RNAi מסוים והתנאים המתאימים לטיפול בחום-שוק של חיות הטרנסגניים בתערובות לזירוז בהצלחה תא הנבט המרה תא עצב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא גורל התכנות על ידי ביטוי חוץ רחמי TF כגון אלוהים TF myogenic, אשר, כאשר overexpressed, ממיר fibroblasts ישירות לתוך תאי השריר כמו1, היה מוקד מחקר במשך עשרות שנים. עם זאת, תאים הם לעתים קרובות עקשן לתהליך זה, עקב מנגנונים לשמור על זהותם הסלולר. בתאי הנבט להראות מידה דומה של הגנה, ויש מנגנונים כבסיס לעתים קרובות לשמש מחסום כדי למנוע המרה תא הנבט לתוך סוגי תאים אחרים עם ביטוי יתר TF בתדר הגורל. בדרך כלל, רגולציה epigenetic כגון שינויים היסטון, הכרומטין כופה מכשול עבור ההמרה של התא-הגורלות-2,-3. יש קודם לכן חלה גנטיקה הפוכה באמצעות RNAi טוק-דאונס C . elegans ואנו זיהו גורמים להגן על זהויות הסלולר, ובכך לנטרל התכנות בתאי הנבט לתוך הנוירונים4. באופן ספציפי, polycomb הדיכוי מורכבים 2 (PRC2) והמלווה היסטון מאוד שנשמרת לין-53 (CAF-1/RBBP/4/7 ב בני אדם) למנוע את ההמרה ישירה בתאי הנבט סוגים תאים סומטיים מסוים כגון נוירונים טעם glutamatergic C. elegans 4 , 5. כדי לזהות אלה תא הנבט התכנות גורמים מכשול, השתמשנו חיות הטרנסגניים נושאת את החום-הלם inducible Zn-האצבע TF צ'ה-1. צ'ה-1 מתבטאת בדרך כלל שני נוירונים ראש של C. elegans, איפה זה מציין שגורלו של נוירונים טעם glutamatergic כינה ASE6. גורל נוירון ASE, ניתן לאבחן על ידי הבעת הכתב פלורסנט ASE ספציפי gcy-5prom::gfp. GCY-5 הוא chemoreceptor רק הביע ב ASE נוירון נכון7. על לין-53 דלדול ידי RNAi, אינדוקציה של ביטוי חוץ רחמי רחבה של צ'ה-1 על ידי מכת חום, בתאי הנבט יכולים להיות מומרים נוירונים ויוו4,5. חשוב לציין, תזמון הטיפול RNAi היא קריטית כמו תולעים בוגרות בלבד (P0 הדור) חשופים לין-53 RNAi להצמיח F1 רומא בעלי חיים germline זה מתירניות עבור התכנות לתוך הנוירונים4.

תא נבט שתוארו לעיל כדי נוירון הליך הגיור C . elegans ניתן ללמוד מגוון של שאלות ביולוגיות כגון במשמעויות של איתות המסלולים ב תא גורל התכנות. למשל, השתמשנו תא נבט צ'ה-1-induced התכנות לתוך הנוירונים ASE על RNAi נגד לין-53 ללימוד במשמעויות של החריץ איתות בתהליך תא הנבט התכנות8. על ידי ביצוע RNAi כפול כדי שיתוף לרוקן לין-53 והיסטון את קידוד demethylase ג'ין utx-1 הראינו כי החריץ איתות לשביל מנטרל בתיווך PRC2 ג'ין להחרשת על ידי הפעלת ביטוי של UTX-1 germline8 . ממצא זה מדגים כי ההמרה תא הנבט את הנוירונים שמתואר פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את תהליך ביולוגי מורכבים כגון הסלולר התכנות אורגניזם שלם, בהקשר של שונות התפתחותיים וסביבתיים תנאים. יתר על כן, הוא מספק את הפרספקטיבה לאתגר בתאי הנבט בהבעת יתר שונים שר הגורל בתדר ללמוד את תפקידם בהגבלה של פלסטיות הסלולר9, או כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם להשראת תכנות מחדש של תאים נבט תא שני סוגי בתוך vivo.

בעוד יונקים בתרביות רקמה גם מאפשרים ללמוד היבטים שונים של התכנות גורל התא, התאים גדלו בתרבות מוגבלת היכולת לחקות תנאי מסלול איתות לעומת אורגניזם שלם. לכן, C. elegans הוא מודל רב תכליתי לבדיקה של התפקידים של תהליכים ביולוגיים שונים כגון חריץ איתות בזמן התכנות ויוו. בנוסף, זה מודל רב עוצמה עבור מסכי גנטי זה יחסית קל לתחזוקה ולשינוי גנטית על עלויות נמוכות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן לגבי טיפול בבעלי חיים אושרו על-ידי LaGeSo ברלין, גרמניה

1. פתרון הכנה

  1. צלחות NGM-אגר (1 ליטר)
    1. הוסף דור 3 של NaCl 2.5 גר' peptone מדיה (למשל, מה נשארתי-Peptone), 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/mL במלאי EtOH 95%), 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl2, 25 מ של 1 מ' K2PO4ו- 1 מ"ל של המפוטריצין (2.5 mg/mL במלאי).
  2. NGM-אגר RNAi צלחות (1 ליטר)
    1. הוסף דור 3 של NaCl, 2.5 g של peptone מדיה ו- 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving להוסיף, 1 מ"ל של כולסטרול (5 מ"ג/mL במלאי EtOH 95%), 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4, 1 מ של 1 מ' CaCl2, 25 מ של 1 מ' K-2-פו-4, 1 מ"ל של המפוטריצין (מניות 2.5 מ"ג/מ"ל), 1 מ"ל של 1 מ' IPTG , ו- carbenicillin 1 מ"ל (50 מ"ג/מ"ל).
  3. LB-אגר (1 ליטר)
    1. להוסיף 10 גרם של מדיה peptone, 5 גר' שמרים לחלץ, 5 g של NaCl, 20 גר' אגר, 10 מ של 1 מ' טריס pH 8.0. להוסיף H2O 1 ל' לאחר autoclaving, מוסיפים 1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל carbenicillin 2.5 מ של 5 מ"ג/מ"ל טטרציקלין.
  4. בינוני ליברות (1 ליטר)
    1. להוסיף 10 גרם של מדיה peptone, 5 גר' שמרים לחלץ, 5 g של NaCl, 10 מ של 1 מ' טריס pH 8.0. להוסיף H2O 1 ל' לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ"ל של 50 מ"ג/מ"ל carbenicillin.
  5. M9-buffer (1 ליטר)
    1. הוסף 6.0 גר' נה2HPO4, דור 3 של2פו ח'4, 5 g של NaCl ו- 50 מ"ג של ג'לטין. לפני השימוש, להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO4.
  6. פתרון הלבנת (10 מ"ל)
    1. להוסיף 1 מ"ל של NaClO ו- 2 מיליליטר 5 N NaOH. להוסיף H2O 10 מ"ל.

2. הכנת לוחות RNAi

הערה: C. elegans הוא בדרך כלל תרבותי במעבדה על צלחות פטרי 6 ס מ המכיל 7.5 mL של תולעים נימיות צמיחה בינוני אגר (NGM-אגר)10,11. פרוטוקול זה ממוטב עבור תולעים שמרו ב 15 º C. כדי להכין צלחות עם NGM, להשתמש בטכניקות סטרילי סטנדרטי כדי למנוע זיהום פטרייתי, חיידקי. לפניכם פרוטוקול להכין צלחות NGM בתוספת ריאגנטים עבור RNAi.

  1. הכינו צלחות NGM-אגר RNAi 6 ס מ המכיל 1 מ מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ו- 50 carbenicillin µg/mL. תנו להן להתייבש במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר האפל12.
    1. שמור RNAi צלחות ב 4 ° C בחושך. אין להשתמש אם שגילן עולה על 14 ימים.
  2. בחר RNAi השיבוט חיידקים (Escherichia coli HT115) המכילה את פלסמיד L4440 עם רצף הדנ א לין-53 ג'ין מן המלאי גליצרול קפואים זמינות RNAi ספריית13 על צלחות LB-אגר המכיל 50 µg/mL carbenicillin ו- 12.5 טטרציקלין µg/mL באמצעות התבנית streaking תלת-פאזי. מגדלים את החיידקים לילה של 37 ° C12. שיבוט זה מאפשר IPTG תלוית הייצור של לין-53 dsRNA של החיידק.
    1. בנוסף, לגדול חיידקים RNAi המכילים את פלסמיד L4440 ללא כל רצף גנים כמו בקרה הריק וקטור14.
  3. למחרת, לבחור מושבה בודדת של לין-53 או צלחות ריקות וקטור LB-אגר באמצעות פיפטה 200 µL עצה לחסן כל אחד מהם לתוך צינור תרבות נפרד המכיל 2 מ ל נוזל LB בינוני14 בתוספת 50 carbenicillin µg/mL. לגדול תרבויות בין לילה ב 37 ° C עד שיגיעו של צפיפות אופטית (OD) ב 600 nm של 0.6-0.8. למדוד את יתר באמצעות ספקטרופוטומטרים15.
    התראה: התקשורת LB נוזלי אינו אמור להכיל טטרציקלין לעומת הלוח LB-אגר המשמש ומבטא את החיידקים מן המלאי גליצרול, מאז הכללה של טטרציקלין שהאכילה הפניות ל- יעילות RNAi ירד 12
  4. להוסיף 500 µL של כל התרבות חיידקי (לין-53 או וקטור ריק) צלחות NGM-אגר RNAi 6 ס מ באמצעות של multipipette. דגירה צלחות עם מכסה סגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך להתייבש. במהלך תקופה זו, יניעו IPTG לוחית NGM הייצור של dsRNA של החיידק.
    1. להשתמש לפחות 3 צלחות לכל התרבות חיידקי לכל ניסוי. זה יספק 3 טכני משכפל עבור ניסוי.
  5. חנות צלחות NGM-אגר RNAi מיובשים עם חיידקים ב 4 ° C בחושך עד שבועיים.

3. הכנה של C. elegans זן BAT28

  1. לשמור על המתח תולעת BAT288 המכיל את transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)], ntIs1 [gcy-5prom::gfp] על חיידקים OP50 באמצעות לוחות NGM-אגר רגיל ב 15 º C.
    הערה: עבור פרוטוקול מפורט על תרבות נמטודות, ראה10. Rol-6(su1006) אלל דומיננטי, נפוץ פנוטיפי הזרקת סמן16 הגורמת התנועה מתגלגלת טיפוסי. הוא משמש את transgene otIs305 כדי לעקוב אחר hsp-16.2prom::che-1.
    1. לשמור על המתח BAT28 ב 15 ° C בכל עת על מנת למנוע הפעלת precautious hsp-16.2prom::che-1 transgene. לצמצם חשיפה לטמפרטורות גבוהות יותר מאשר 15 ° C לטיפול במתח ככל האפשר.
  2. גיל-תולעים לסנכרן, להשתמש בטכניקה הלבנת17.
    1. לשטוף צלחות 6 ס מ NGM-אגר המכיל מבוגרים וביצים של BAT28 באמצעות מאגר M9 µL 900. צניפה תולעים על ידי צריך שתוציאו ב g x 900 עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע.
    2. להוסיף 0.5-1 מ של הלבנת פתרון ומנערים את הצינור עבור 1 דקות עד תולעים בוגרות יתחילו להתפוצץ פתוח. צג באמצעות stereomicroscope רגיל.
    3. צניפה תולעים על ידי צריך שתוציאו ב g x 900 עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע.
    4. רחץ בגדר תולעת 3 פעמים על-ידי הוספת µL 800 M9 המאגר צריך שתוציאו ב 900 x g.
    5. מניחים את הביצים נקי על טרי NGM-צלחות עם חיידקים OP50. לגדול אוכלוסיה מולבן על חיידקים OP50 ב 15 ° C עד שיגיעו L4 הבמה (כ- 4 ימים). L4 הזחלים ניתן לזהות על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך הצד הבטני תולעת18 באמצעות stereomicroscope סטנדרטי.
      הערה: כדי להשיג את תא נבט נוירון פנוטיפ המרה על דלדול של לין-53, זה צריך להיות מרוקנים את הדור הורים (P0).
מניה על פנוטיפ ההמרה נעשה בקרב הדור הבא (שקבורה דור F1). כדי להשיג את deplete לין-53 כבר ב P0, L4. נתונים RNAi.
  • העברה ידנית 50 L4 הבמה תולעים לכל שכפול באמצעות חוט פלטינה כדי צלחת NGM לא מכילות כל חיידק ולתת תולעים התרחק כל חיידק OP50 שהועברו. תעזוב את התולעים לעבור על הצלחת עבור 5 דקות. שימוש חיידקים מן הלוחות NGM-אגר RNAi נזרע בעבר עם לין-53 RNAi חיידקים (או בקרה הריק וקטור) כדי להעביר הצלחות RNAi בהתאמה.
    1. למנוע העברת חיידקים OP50 הלוחות RNAi בפועל. לעבוד מהר כדי למזער את זמן החשיפה של המתח לטמפרטורות גבוה יותר מאשר 15 ° C.
  • דגירה תולעים על צלחות RNAi NGM-אגר ב 15 מעלות צלזיוס במשך כ- 7 ימים עד F1 צאצא. של התולעים מגיע L3-L4 הבמה. הם ניתן בבירור להפריד בין החיות P0 מאז הם גדולים יותר, עבה יותר הוא צאצא F1.
    1. בדיקה חזותית תחת stereomicroscope סטנדרטי אם F1 רומא תולעים להראות פנוטיפ בולט של הפות (pvul), כפי שמוצג באיור1. RNAi נגד לין-53 יש תופעות pleiotropic וגורם של פנוטיפ pvul בו ניתן להשתמש כדי להעריך אם RNAi נגד לין-53 הוכתרה בהצלחה.
      הערה: RNAi נגד לין-53 יכול גם לגרום הקטלניות של העוברים F1. אפקט זה מגביר אם הצלחות נחשפים לתארים גבוהים מ- 15 ° C לפני בעלי חיים הגיעו L3-L4 הבמה. ניתן לזהות עוברי המת על ידי משפחה בהפרעה וחוסר הבקיעה.
    2. דגירה צלחות בחושך כיוון IPTG הוא רגיש אור.

    • 4. אינדוקציה של תא הנבט התכנות

    1. דגירה שנבדקו צלחות RNAi המכיל לין-53 ולרוקן וקטור רומא F1 RNAi שטופלו במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך כדי להפעיל את צ'ה-1. שימוש במדגרה פרקו שכן הוא מאפשר הלם חום יעיל יותר.
    2. לאפשר בהלם-חום בעלי חיים כדי לשחזר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז דגירה צלחות 25 ° c בלילה בחושך.
    3. שימוש stereomicroscope סטנדרטי מצמידים מקור אור זריחה, לבחון חיות תחת מסנן ה-GFP עבור gcy-5prom::gfp-נגזר אותות באזור אמצע הגוף של התולעים, כמוצג באיור2. ערכת מיקרוסקופ עבור אותות GFP: עירור המרבי-488 ננומטר עם פליטה המרבי-509 ננומטר.
    4. להעריך את מידת תא הנבט המרה תא עצב על ידי הרכבה חיות עם GFP אותות באזור אמצע הגוף אגר המכילות pad מיקרוסקופ שקופיות19.
      1. לספור את מספר בעלי החיים מציג את תא הנבט המרה נוירון לעומת החיות כהה כדי להעריך את penetrance פנוטיפ. בדרך כלל, בסביבות 30% מבעלי החיים מראים אותות בדידים GFP germline על התרוקנות לין-53 , ואילו לא יותר מ-5% של בעלי החיים להראות אותות GFP ' מאטום לשקוף ' germline על ריק וקטור RNAi.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    כפי שמוצג באיור1, כי התערוכה של פנוטיפ pvul F1 חיות להמחיש יישום מוצלח של לין-53 RNAi. בעלי חיים אלה נוטים לאפשר המרה של תאי נבט שלהם לתוך תאי נוירון דמוי ASE על חום-הלם אינדוקציה של צ'ה-1 ביטוי יתר כמופיע באיור2. בניגוד תולעים שגדל על הפקד ריק וקטור RNAi לין-53 RNAi טיפול תניב חיות המציגים חוץ רחמי GFP-אותות באזור אמצע הגוף לאחר מכת חום, הדגירה 25 º C למשך הלילה כפי שתואר קודם4, 8. תחת מיקרוסקופ epifluorescence של תולעים אלה מדוקדקת יותר כי התאים מציג אותות GFP גם להציג תחזיות כמו נוירון (איור 2B, החצים הלבנים) האופייניים עבור תאים עצביים. אם לא הצליחה RNAi נגד לין-53 או חום-הלם התנאים היו בלתי הולם GFP אותות ידמה לאלה בשליטה RNAi שטופלו חיות (איור 2). חשוב לציין, למנוע גרימת ביטוי יתר של צ'ה-1 על ידי חום אינדוקציה לפני בעלי חיים מגיעים באמצע שלב L3. בעלי חיים, כי היו צעירים מדי, בזמן האינדוקציה ביטוי צ'ה-1 ניתן להציג gcy חוץ רחמי - 5prom::gfp ביטוי באזורים אחרים של הגוף כמו הפות המתפתח כפי שמוצג באיור 313.

    figure-results-1
    איור 1: Pvul פנוטיפ הנגרמת על ידי RNAi נגד לין-53- (למעלה) DIC תמונה של L4/צעירים למבוגרים הבמה F1 רומא תולעים נגזר אמהות RNAi מטופלים פקד או לין-53 . גודל ברים = 20 מיקרומטר. (למטה) חיות שטופלו לין-53 RNAi התצוגה פנוטיפ בולט הפות (pvul) (חץ שחור-ראשי). פנוטיפ pvul מאשרת כי RNAi נגד לין-53 היה מוצלח. גודל ברים = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-results-2
    איור 2: תולעים עם תא הנבט בהצלחה מחדש לתוך הנוירונים. (א) BAT28 זן חיות גדל על הווקטור ריק לא מראים אותות GFP ב germline לאחר מכת חום אינדוקציה של ביטוי צ'ה-1 . קו מקווקו לבן מתווה תולעת. גודל ברים = 20 מיקרומטר. (B) בניגוד BAT28 זן חיות גדל על הפקד ריק וקטור חיות RNAi גדל על לין-53 RNAi התצוגה אותות gcy-5prom::gfp באזור אמצע הגוף. תמונות של המקטע אמצע הגוף עם אותות GFP שצולמו 63 X הגדלה לחשוף תאים GFP-חיוביות מציג בליטות (חץ לבן-ראשי). תכונה זו מורפולוגי מציין כי בתאי הנבט שעברו המרה לתוך תאי נוירון דמוי ASE. כוכביות לבן לסמן אוטומטית-זריחה נגזר המעי. כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם 20 X 63 X הגדלה הגדלה. קו מקווקו לבן מתווה תולעים. גודל ברים = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    figure-results-3
    איור 3: תולעת בשלב מוקדם עם GFP חוץ רחמי- BAT28 זן חיות גדל על החיידק RNAi וקטור ריק שהיו מכת חום המושרה על צ'ה-1 ביטוי בשלבים המוקדמים זחל כגון L2 הצגת אותות GFP באזור אמצע הגוף (כוכביות לבן). אותות אלה אינם עקב תא הנבט התכנות. קו מקווקו לבן מתווה תולעת. גודל ברים = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    בעוד הפרוטוקול המתואר באמצעות הטרנסגניים של C. elegans זן BAT28, RNAi נגד לין-53 היא פשוטה, מספר צעדים חיוניים על מנת להבטיח את התוצאה המקווה של נבט התא של נוירון התכנות. חשוב כי המתח BAT28 נשמרת ב 15 ° C בכל עת לפני הניסויים. במהלך טיפול ותחזוקה של המתח, הפעם בטמפרטורות מעל 15 ° C צריך למזער ככל האפשר. מכת חום תקין תנאים חשובים מאז לא מספיקות אינדוקציה של צ'ה-1 ביטוי לא יביא תא נבט ל ASE נוירון המרה. זה ניתן להבחין באמצעות מדידה של penetrance פנוטיפ כמפורט בפרוטוקול. חום רב-הלם יכול להוביל הקטלניות של בעלי החיים. למשל, צלחות הונחו על הקרקע התחתונה של חממה אוויר סטטי או ליד הקירות הפנימיים לעיתים קרובות לחוות טיפול בחום רב. לכן, מומלץ להשתמש של חממה חום פרקו. בנוסף, העיתוי של אינדוקציה מכת חום היא קריטית מאז ביטוי יתר של צ'ה-1 במהלך שדרגות מוקדם יותר ואז L3 יכול להוביל חוץ רחמי gcy-5prom::gfp אינדוקציה באזורי גוף שונים כגון הפות (איור 3) 9. יתר על כן, ניתן להבחין מכת חום מקיף penetrance פנוטיפ בבעלי RNAi וקטור ריק אשר לא צריך להאריך 5% ו- auto-זריחה מוגברת של רקמות אחרות, כלומר המעי.

    בצורה אקראית, חיידקים RNAi יכולה לאבד את הפעילות שלהם לייצר ביעילות dsRNA של הגן היעד. למרבה הצער, זה לא יכול להיות זוהה לפני הניסוי RNAi. במקרים כאלה צריך לגדול פס צח מ גליצרול כמתואר בסעיף 2 של הפרוטוקול. אם יש עדיין לא גרם RNAi pleiotropic פנוטיפ גלוי כמו למשל פנוטיפ pvul הנגרמת על ידי RNAi מוצלח נגד לין-53, ואז פלסמיד בידוד ה-DNA של החיידק בהתאמה, יש לבצעו, חיידקים HT115 טרי צריך להיות טרנספורמציה עם פלסמיד L4400 המכיל את רצף לין-53 .

    חשוב, המתח BAT28 יש פנוטיפ רולר הנגרמת על ידי הזרקת סמן pRF4, אשר שימש במהלך transgenesis של החיות עם hsp-16.2prom::che-1 לבנות DNA. לעיתים, חיות לאבד את פנוטיפ מתגלגל, אשר יכולה להצביע על ההשתקה hsp-16.2prom::che-1 transgene. כדי לשמר כראוי את המתח BAT28, לבחור רולר 10, לבעלי צלחת טריים, להפיץ בחירת עבור לצלם בעלי חיים.

    היישום של הפרוטוקול מוגבלת להליך F1 RNAi, מה שאומר כי חיות שהוריהם (P0 הדור) לא נחשפו ל- לין-53 RNAi לא יציג תא הנבט המרה נוירון עקב הצלה אימהי4. הליך חלופי כדי להמיר בתאי הנבט נוירונים תואר על ידי Ciosk ועמיתיו15 באמצעות RNAi דפיקה למטה של gld-1 ו- mex-3 ללא ביטוי יתר של פקטור שעתוק. אולם, הנוירונים שהושג לא שייכים לסוג מסוים של נוירונים, בתאי הנבט גם להמיר לתאי השריר כמו על מציאה RNAi בתיווך דלדול של gld-1 ו- mex-3-15. בעבר, זה כבר הוכיחה RNAi נגד לין-53 מותר המרה תא הנבט לתוך תאי נוירון דמוי GABAergic על ביטוי יתר של הגורם שעתוק homoedomain Pitx מסוג UNC-3016 שנים ולא צ'ה-14 . עבור כיוונים לעתיד, ניתן להמיר שעתוק שונים בתדר הגורל, גורמים יכול להיבדק אם לין-53 דלה בתאי הנבט סוגי תאים אחרים מאשר נוירונים ספציפיים. בהקשר זה, ביטוי של הגורם שעתוק myogenic bHLH HLH-1, homolog של יונקים אלוהים17, גורם המרה של תא הנבט השרירים על לין-53 RNAi5. הוקמה התיכנות בתאי הנבט סוג תאים סומטיים מסוים על לין-53 RNAi, ביטוי יתר של גורם שעתוק המתאים בתדר הגורל יכול לשמש עבור מספר מסכי גנטיים שונים. מסכי משתיק קול או שיפור כזה יכול לעזור לנתח מסלולים תקינה כי תפקיד במהלך ההמרה גורל התא.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים הכריזו כי אין אינטרסים מתחרים קיימים.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנו מודים אלינה El-חליל, מרטינה Hajduskova לקבלת סיוע טכני. אנו מודים לחברים בקבוצה Tursun להערות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי ERC-StG-2014-637530 ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 והיא נתמכת על ידי מקס Delbrueck המרכז לרפואה מולקולרית באגודה הלמהולץ.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    <חזק>כימיקלים 
    Agar-Agar, Kobe IRoth5210.1
    Bactopeptone א. הרטנשטיין בע"מ211 677פפטון מדיה 
    תמצית שמרים AppliChemA1552,0100
    אמפוטריצין BUSBiologicalA2220
    CaCl2Merck Biosciences208290
    כולסטרולרוט8866.2
    ג'לטיןרוט4275.3
    IPTGסיגמא15502-10G
    K2PO4RothT875.2
    KH2PO4Roth 3904.2
    MgSO4VWR25,163,364
    Na2HPO4RothP030.1
    NaClORoth9265.1
    NaClORoth9062.3
    NaOH (5 N)Roth KK71.1
    TrisRothAE15.2
    CarbenicillinRoth634412
    TetracyclineRoth2371.2
    Incubators
    Incubator ניו ברונסוויק סיינטיפיק C24M1247-0052לחממת הלם חום
     Sanyo MIR-55534210לתחזוקת זני תולעים ב-15 מעלות; C או 25 מעלות; מיקרוסקופ
    Cמיקרוסקופים
    מיקרוסקופ פלואורסצנטיM205 FALeica
    (הדמיה) + מצלמהAxio Imager 2Zeiss
    מיקרוסקופ (הדמיה) + מצלמהSensicamPCO
    סטריאומיקרוסקופSMZ745Nikon
    חיידקי זנים
    Escherichia coli HT115F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5
    promoter -T7 polymerase) (פולימראז T7 מושרה IPTG) (RNAse
    III מינוס).
    Escherichia coli OP50  Uracil auxotroph E. coli strain
    Worm strain
    BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::
    3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.    		נגזר מ-OH9846 פי 4 יותר הצלבה לאחור עם N2
    RNAi Clones
    lin-53SourceBioscienceID I-4D14ספריית Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
    וטור ריק: L4440Addgene #1654
    <חזק>שונות
    בחירת תולעים תוצרת עצמית באמצעות פיפטה פסטר וחוט פלטינה
    מיקרוסקופ

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), (1987).
    2. Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. , 1-12 (2015).
    3. Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).
    4. Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331 (6015), 304-308 (2011).
    5. Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. , 1-9 (2012).
    6. Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21 (13), 1653(2007).
    7. Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).
    8. Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
    9. Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100(2017).
    10. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77 (1), 71(1974).
    11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
    12. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
    13. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
    14. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18 (1), 419357(2000).
    15. Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311 (5762), 851-853 (2006).
    16. Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).
    17. Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).
    18. Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).
    19. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , 1-75 (2006).

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    C elegansRNAi LIN 53CHE 1ASE

    מאמרים קשורים