מאמר שיטה

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56900

⸱

24 באפריל 2018

 ,  , 
1School of Life Science, University of Science and Technology of China, 2State key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.

תקציר

צריכת מזון הוא תחת שליטה הדוקה של המוח, אשר משלב את מצב פיזיולוגי, palatability ותוכן התזונתיים של המזון, וכן בעיות פקודות כדי להפעיל או להפסיק האכלה. פענוח התהליכים שבבסיס בקבלת ההחלטה של מתון האכלה נושאת השלכות עיקריים בהבנה שלנו של הפרעות פיזיולוגיות ופסיכולוגיות הקשורים האכלה שליטה ובמועד. שיטות פשוטות, כמותיים, חזקים נדרשים למדידת בליעה מזון בעלי חיים לאחר מניפולציה ניסויית, כגון בכפייה הגברת הפעילות של הנוירונים יעד מסוימים. . הנה, הצגנו מבוסס-צבען תיוג מבחני האכלה כדי להקל על המחקר neurogenetic של האכלה שליטה ב זבובי פירות למבוגרים. אנחנו סקור מבחני האכלה זמין ולאחר מכן לתאר את השיטות שלנו שלב אחר שלב מהגדרת ניתוח, המשלבים thermogenetic, optogenetic מניפולציה של נוירונים שליטה מוטיבציה האכלה עם assay צריכת מזון התווית על-ידי צבע. נדון גם את היתרונות והמגבלות של השיטות שלנו, לעומת מבחני האכלה אחרים, כדי לסייע לקוראים לבחור וזמינותו המתאים.

מבוא

לכימות בכמות האוכל בלע חשוב להערכת מספר היבטים של האכלה הפקדים על-ידי המוח כתגובה לאסונות לצרכים פנימיים (כגון הרעב הברית), גורמים חיצוניים (כגון איכות מזון ו palatability)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. בשנים האחרונות, המאמצים של פיענוח של סובסטרטים עצבית של האכלה שליטה בדרוזופילה להוביל להתפתחות של מבחני מרובים כדי לכמת את כמות המזון בלע במישרין לשמש בתור מדד של האכלה מוטיבציה 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

12,assay13 נימי מזין (CAFE) פותחה כדי למדוד את כמות הצריכה של מזון נוזלי ב microcapillary זכוכית. וזמינותו CAFE מאוד רגיש, לשחזור17 ומפשטת את המדידה של צריכת מזון, במיוחד עבור לכימות האכלה לטווח ארוך18. עם זאת, וזמינותו הזה דורש הזבובים לטפס אל קצה microcapillary ולהאכיל הפוך, אשר אינו מתאים עבור כל זנים. בנוסף, מפני הזבובים להיבדק באמצעות וזמינותו CAFE חייב להיות גדלו במזון נוזלי, ההשפעה של אלה תנאים על חילוף החומרים מצב או של תת-תזונה פוטנציאל לגידול נשאר להיות נחושים.

11,assay14 תגובה סיומת חוטם (פי) סופרת את התדירות של תגובות סיומת חוטם לכיוון נגיעות עדינות של המזון טיפות. לכל assay הוכיח היא דרך מצוינת כדי להעריך האכלה המוטיבציה של זבוב, ישבנים השפעת palatability ותוכן של מזון18,19. עם זאת, זה לא כימות ישירה של צריכת כמות.

לאחרונה, פותחה שיטה חצי אוטומטי, המדריך האכלה assay (MAFE)15. ב- MAFE, זבוב קיבוע אחד מוזן באופן ידני עם microcapillary המכיל מזון. בהתחשב בכך חוטם סיומת תגובות וצריכת מזון ניתן לנטר בו זמנית, MAFE מתאים הערכת הערכים התזונתיים ואת ההשפעות של טיפול תרופתי. עם זאת, שיתק זבוב עלול להשפיע לרעה על ביצועיו התנהגותית, כולל האכלה.

בנוסף, לטוס חוטם, גלאי פעילות (FlyPAD)10 פותחה באופן אוטומטי לכמת את התנהגות האכילה. באמצעות מכונת ראייה שיטות, FlyPAD רשומות האינטראקציות פיזי בין זבוב מזון כדי לכמת את התדירות והמשך של הרחבות חוטם כמחוון של האכלה מוטיבציה. FlyPAD מספק גישה תפוקה גבוהה כדי לנטר את התנהגויות האכילה של זבוב חינם-המעבר, הרגישות ואת החוסן של מערכת זו עדיין רחוק להיות מאושרות על ידי יותר מחקרים12.

אסטרטגיות תיוג משמשים לעתים קרובות כדי להעריך אוכל בליעה בזבובים. זה נפוץ כדי תווית המזון עם קליעים נותבים כימי, לאחר האכלה, למדוד את כמות בלע מעקב כדי לחשב את כמות צריכת המזון. קליעים נותבים רדיואקטיביים16,17,20,21,22,23,24,25 לאפשר איתור דרך הקוטיקולה בלי המגון של הזבובים. בשיטה זו מספק השתנות נמוך להפליא, רגישות גבוהה18, ריאלי עבור לימוד לטווח ארוך של צריכת המזון. עם זאת, הזמינות של רדיואיזוטופים שמיש, תעריפים שונים של ספיגת, והוצאת צריכים להילקח בחשבון כאשר עובדים עם זה וזמינותו.

תיוג והמעקב צריכת המזון בצבעים שאינם רעילים מזון הוא פשוטה ובטוחה אלטרנטיבית2,3,26,27,28. זבובים הם הומוגני לאחר האכלה עם מזון המכיל צבעי מסיסים ולא נספגים, ואת כמות צבע בלע זה מאוחר יותר לכמת באמצעות ספקטרופוטומטרים3,24,28,29 . אסטרטגיית תיוג הוא קל לביצוע, ומספק יעילות גבוהה, אבל עם אזהרה. הנפח של צריכת המזון מוערך מן לצבוע בלע הוא קטן יותר מאשר אמצעי האחסון בפועל כי הפרשה מתחילה מוקדם ככל 15 דקות לאחר זבובים יתחילו להיות. ניזונים17. בנוסף, וזמינותו מעריך בליעה מזון בדרך כלל תוך תקופה של 60-מין, אשר מתאים רק לחקירה לטווח קצר האכלה התנהגות24,28. יתר על כן, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים, כגון גנוטיפ17, מגדר17, הזדווגו המדינה17, לגידול צפיפות30,31,שעון ביולוגי32ומזון איכות3 , 8 , 16, צריכת המזון השפעה. לכן, ייתכן משך ההאכלה צריך להיות מותאם על פי תנאים מסוימים ניסיוני. מלבד בהנחיה כימות של צריכת מזון וצבעי מאכל משמשים גם כדי להעריך אוכל בחירות2,19,27, וכדי להמחיש את מניסקוס ב microcapillary CAFE assay12.

כאן, אנחנו מציגים מניפולציה פרוטוקול בשילוב של פעילות. עצבית בגישה תיוג-צבע. אסטרטגיה זו כבר הוכיח שימושי במחקר שלנו neurogenetic על האכלה שליטה זבובי פירות למבוגרים24. שיטת הניקוד ויזואלי מאפשר הערכה מהירה של צריכת מזון; לפיכך, מומלץ להקרנה דרך מספר רב של זנים במועד. המועמדים מן המסך ואז מאבחנים בפירוט באמצעות שיטה ערכי צבע מוחלטים לספק אובייקטיבית, כימות מדויק במחקר נוסף.

חוץ מזה מבחני האכלה, נתאר גם thermogenetic27,33,34,35 ו- optogenetic36 שיטות בכפייה הפעלת נוירונים היעד בדרוזופילה. כדי להפעיל את הנוירונים מאת thermogenetic המבצע היא פשוטה ונוחה עם דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים Ankyrin 1 (dTRPA1), אשר הוא הקטיון טמפרטורה - ו ממותגת מתח ערוץ זה מגביר דעתנית עצביים כאשר הסביבה הטמפרטורה עולה מעל33,23 ° C37; עם זאת, בדיקות חיות בטמפרטורות גבוהות עשוי לייצר השפעות שליליות על התנהגות. גישה יעילה אחרת כדי להפעיל את הנוירונים בדרוזופילה משתמש optogenetics עם CsChrimson36, אשר הוא אדום-העביר גרסה של channelrhodopsin זה מגביר את רגישות של נוירונים לאור. Optogenetics מציע רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, פחות הפרעה התנהגויות מאשר thermogenetics. שילוב של מדידה כמותית של צריכת המזון עם המניפולציה של פעילות. עצבית מייצג גישה יעילה ללמוד את המנגנונים העצביים של האכלה.

נתאר בפירוט את הכנת האכלה החדר וזבובים להיבדק. באמצעות זבובים טאוטי-Gal4 כמו דגם24, אנו מתארים את הפעלת נוירונים באמצעות thermogenetics ו- optogenetics. שני מבחני של כימות של צריכת מזון עם התווית על-ידי צבע אוכל מתוארים גם בפרוטוקול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת החדר האכלה

הערה: תא האכלה עבור תיוג לצבוע assay האכלה מורכב משני חלקים: המיכל החיצוני (בתור כיסוי), הבתוך מיכל (כמקור מזון).

  1. לשנות את המיכל החיצוני מ בקבוקון זכוכית עבור culturing דרוזופילה (קוטר פנימי של 31.8 מ מ), בגובה של 80 מ"מ (איור 1 א', 1 ג'). כיסוי בתחתית המיכל עם שכבה של 1% agarose (5 מ"ל) כדי לשמור את ההגדרה האכלה כראוי humidified ולשמש מצע רך לזבובים לדרוך (איור 1B). המיכל ובכך מספק סביבה מבוקרת אבל נטורליסטי נושא עם לחץ מינימלי או הפרעה לזבובים.
    1. להכין את המיכל החיצוני. להשעות 0.5 גר' agarose ב 50 מ של מים מזוקקים כפול, חום עם עצבנות תכופים, והרתיחו להתמוסס לחלוטין על פגים עם צלחת חום.
    2. כאשר מתקרר agarose 1% עד בערך 60 ° C, להעביר 5 מ של 1% agarose ריקה מחוץ מיכל (איור 1B), ולתת המכולה תישאר פתוחה עד התקררה לטמפרטורת החדר להניב רכיב pad agarose.
  2. להכין אוכל התווית על-ידי צבע. הרכב המזון התווית על-ידי צבע משתנה בהתאם לתכלית ניסיוני. הנה דוגמה של הכנת האוכל התווית על-ידי צבע המכיל רק סוכרוז.
    1. להוסיף 0.5 גר' agarose 50 מ של מים מזוקקים כפול, חום עם עצבנות תכופים, והרתיחו להתמוסס לחלוטין על פגים עם צלחת חום.
    2. כאשר agarose 1% מעל מתקררת כ 60 מעלות, להוסיף agarose כדי להשיג 100 מ מ סוכרוז 1.71 גר' סוכרוז.
    3. להוסיף 0.25 g של צבע כחול (erioglaucine ניתרן) הפתרון agarose להצטייד במזון התווית על-ידי צבע 0.5% (w/v).
  3. להכין הבתוך המיכל. לשים את רוקן במכלים על משטח אופקי שטוח, ואז מוסיפים 750 µL של מזון התווית על-ידי צבע כחול מיכל מזון בודד, עזוב את זה לחזק לפחות 5 דקות.
    הערה: הבתוך מיכל הוא מאכל פלסטיק קטן עם קוטר פנימי של 13.6 מ מ, בגובה של 7.5 מ"מ (איור 1 א', 1 ג). זה הוא מלא באוכל התווית על-ידי צבע ולאחר מכן ימוקם במרכז משטח agarose של המיכל החיצוני.
  4. העברה של מילוי בתוך מיכל לתוך מיכל בחוץ מוכן ומקם אותה במרכז משטח agarose. תן את תאי האכלה שפתוחים בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות עד הקיר של המיכל החיצוני ללא עיבוי.
    הערה: הקיר היבש יש צורך למנוע את הזבובים להיות תקוע על גבי הקיר על ידי פנייה ישירה טיפות מים.
  5. להכין תאי האכלה עם אוכל ללא צבע (קומפוזיציה זהה אבל בלי לצבוע) על רקע חיסור.

2. הכנת זבובים

הערה: נקבה בוגרת טסה 5-10 יום לאחר וגיחתו משמשים בדרך כלל עבור מבחני האכלה. מומלץ להכין את הזבובים של אחרים שונים, כולל פקדי גנטי, וכדי לבדוק במקביל. זבובים 20 (מתוך תא האכלה אחת) ליצור נקודת נתונים אחת.

  1. קח בחשבון את צפיפות האוכלוסייה לגידול הזבוב הבוגר. בדרך כלל, שליטה בצפיפות האוכלוסין על ידי שינוי מספר הורים זבובים לפי הזנים וממדים בקבוקי תרבות. לדוגמה, להעביר בקבוק תרבות עם (קוטר של 31.8 מ מ), בגובה של 80 מ מ 15 זכרים ונקבות 30 של קנטון-S ותנו הנקבות להטיל ביצים במשך יום אחד ואז הסר שהמבוגר זבובים.
  2. היכונו זבובים להפעלה thermogenetic.
    1. השתמש את מערכת Gal4/UAS38 לבטא dTRPA133 נוירונים שונים על ידי מעבר ש-UAS-dTrpA1 טס עם קווים נהג GAL4 שונים (איור 2B).
    2. לשמור את הזבובים הבוגרים על מזון רגיל 22 ° C 60% לחות יחסית, מחזור בהירה-כהה 12 h/12 שעות.
    3. יומיים לפני ההזנה assay, למיין, לאסוף זבובים על CO2 לעוף משטח במיקרוסקופ סטריאו לתוך בקבוקון מזון טרי, לשמור על צפיפות של 20 זבובים לכל מבחנה.
  3. היכונו זבובים להפעלה optogenetic.
    1. השתמש את מערכת Gal4/UAS38 כדי לבטא CsChrimson36 בנוירונים שונים על ידי מעבר זבובים UAS-CsChrimson עם קווים שונים של מנהל ההתקן GAL4.
    2. לאחרונה לאסוף זבובים eclosed (תוך 24 שעות) ולהעביר אותם לתוך בקבוקון עם תקן מזון המכיל 400 מיקרומטר כל-טרנס-רשתית.
    3. כדי למנוע הפעלה מוקדמת, לעטוף את הבקבוקונים rearing ברדיד אלומיניום ושמת אותם לתוך תיבת כהה להגן על זבובים גירוי אור לא רצויים. שמור את הזבובים 25 ° c, 60% לחות בחושך 4-6 ימים.
    4. יומיים לפני ההאכלה וזמינותו, מיון הנקבה טסה על משטח לעוף2 CO תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאסוף זבובים 20 לתוך המבחנה ממזון אחד ולשמור אותם בחושך לפני הבדיקה האכלה.
    5. לנהל את כל הפעולות תחת אור עמום במהירות האפשרית כדי למנוע את ההשפעות שנגרמו על ידי אור מקיף. השתמש מנורת LED ממוקמים רחוק מאזור העבודה, העוצמה באזור העבודה µW/ס מ 52.
      הערה: שימוש ברעב קנטון-S זבובים כפקד חיובי עבור וזמינותו האכלה. לשלול את היתושים הללו של מזון ולשמור על agarose 1% במשך 24 שעות לפני הבדיקה האכלה. הרמות של צריכת מזון של הזבובים האלה לעזור להעריך את תנודות היומיומית.

3. הפעלת thermogenetic

  1. לערוך ניסויים האכלה כל באותו זמן של היום סביב Zeitgeber זמן 4-631,32, כדי למזער את הווריאציות עקב השעון הביולוגי.
  2. להכין אינקובטור (או חדר קטן עם תנור מבוקרי טמפרטורה) כמו הסביבה חימום.
  3. לפני ניסויים התנהגותיים, equilibrate את תאי האכלה מוכן בטמפרטורה ניסיוני (30 ° C) במשך שעתיים להבטיח הטמפרטורה היחסית המדים בבית הבליעה האכלה.
  4. כדי להתחיל את תהליך ההזנה, בזהירות להעביר זבובים 20 מ שלהם המבחנה הביתה לתא האכלה preheated על-ידי הקשה עדין. להמשיך בתהליך ההאכלה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ( איור 3 א) .
    הערה: המחאות כנגד תכופים שפת ההינדי, כגון פותחים וסוגרים את הדלת חממה, להשפיע לרעה על ההתנהגות האכלה, וכך צריך להיות ממוזער.
  5. הפסקת האכלה ב 60 דקות על ידי הקפאת את תאי האכלה ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.
    הערה: הקפאה מסייעת לעצור בפטריה בלשכה כל בו זמנית. הקפאת זבובים ב-80 מעלות צלזיוס משמשת לשתי מטרות, המתות חסד הזבובים ועל אחסון עד המגון עד לשבוע אחד.
  6. עבור קבוצת בקרת טמפרטורה, העברת הזבובים 20 לתוך טמפרטורת החדר. האכלה קאמרית עם אוכל לצבוע בצבע כדי להתחיל את תהליך ההזנה ב 22 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
  7. הפסקת האכלה של קבוצת בקרת טמפרטורה על ידי הקפאת התאים ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.

4. Optogenetic הפעלה

  1. לערוך ניסויים האכלה כל באותו זמן של היום סביב Zeitgeber זמן 4-631,32, כדי למזער את הווריאציות עקב השעון הביולוגי.
  2. בזהירות להעביר זבובים 20 בקבוקון אחד לתא הזנה על-ידי הקשה עדין ולאחר מכן שים תא לצדדים על הכיוונון תאורה (איור 4A, 4B).
    1. Optogenetic תמרון, משתמשים במערך של נוריות כתום (607 ננומטר) כמקור של גירוי האור, תיקון לוח פלקסיגלס אופקי מעל נוריות לתמוך ההזנה צ'יימברס בזמן תאורה. שמור את ההתקנה בתוך אינקובטור 25 ° c עם 60% לחות (איור 4A, 4B).
    2. לעורר את הזבובים הבקרה הגנטית במקביל של טאוטי > CsChrimson זבובים, אך שונים האכלה צ'יימברס.
  3. המשך תהליך ההזנה עבור 60 דקות עם תאורה האחורי על ידי אור הכתום.
    1. לקבוע את עוצמות תאורה אופטימלית עבור optogenetics השפעול36. עבור של טאוטי > CsChrimson זבובים, עוצמה של 2.2 מ"מ/mW2 גורם לשיתוק (הפסקת ומכניקה) ואובדן שליטה בתנוחה, לכן, להשתמש עוצמה ביניים של 0.1 מ"מ/mW2 כדי לגרות את של טאוטי > CsChrimson עף במהלך הבחינה האכלה.
  4. הפסקת ההזנה על ידי הקפאת תאי האכלה ב- 80 ° C (או-20 ° C) במשך 30 דקות.

5. חזותי הערכה של צריכת מזון

הערה: הגישה הבקיע החזותי מספק של הערכה כמותית למחצה של מזון consumptions. למרות שהוא לא הכי אובייקטיבי כשיטת אופטי, שיטה זו מאפשרת לעבור דרך מספר רב של זנים לטוס במועד, הופכים אותו למתאים לשימוש הראשון עגול של מסך גנטית כדי לצמצם במהירות את רשימת המועמדים לבדיקות נוספות.

  1. לאחר תהליך ההאכלה, עזים ומתנגד, ציון הזבוב על מפקד פד לעוף2 תחת מיקרוסקופ סטריאו. לתת ניקוד בודדים כל זבוב בהתבסס על נפח עוצמת בצבע צבען אוכל בבטן שלה (איור 2 א).
    הערה: קריטריונים להערכת חזותי: מערכת ניקוד יש 4 רמות של צריכת המזון המתאים אמצעי אחסון שונים ועוצמות של האוכל צבעוניים על הבטן.
    1. הציון לא טס בלי אוכל לצבוע בצבע לזיהוי ציון 0; תן אותם עם צבע כחול (בקושי לזיהוי) חלש או באוכל לצבוע בצבע שיתפסו פחות משליש אמצעי האחסון של הבטן ציון של 1.
    2. הציון טסה עם אוכל לצבוע בצבע עז כובשת מחצית אחת של הבטן ציון של 2.
    3. ציון אלה עם אינטנסיבי צבוע תוכן כובש יותר ממחצית הבטן ציון של 3 (איור 2 א).
  2. לחשב את הפרופורציה של זבובים עם ציונים שונים לכל תנאי הניסוי (איור 2B).

6. ערכי צבע מוחלטים כימות של צריכת מזון

  1. לאחר הפסקת האכלה, שופכים זבובים 20 כל הנקה קאמרית על חתיכת נייר במשקל ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צינור 1.5 mL בעזרת מברשת רכה.
    הערה: לא לקחת את כל התאים מהאחסון-80 ° C במקביל כדי למנוע זבובים נצמדים לקיר קאמרית בגלל עיבוי מים על תא קר.
  2. להוסיף 500 µL של PBST הצינור, homogenize את הזבובים באמצעות מפעל שחיקה בתדר 60hz עבור 5 s.
    1. לאשר המגון מספיק על ידי תצפית כאשר אין שברי לזיהוי של חלקי גוף.
  3. לסובב את הצינורות עם homogenates למשך 30 דקות-13,000 סל ד כדי לנקות את הלכלוך.
  4. לאחר צנטריפוגה, להעביר µL 100 של תגובת שיקוע טוב של צלחת 96-ובכן.
  5. לאחר כל דוגמאות נטענים, לשים את הצלחת לקורא צלחת כדי למדוד את ספיגת של הדגימות-630 ננומטר.
  6. כדי להסיר את ספיגת רקע, להפחית את ספיגת של supernatants מהזבובים מוזן על אוכל בלי לצבוע ספיגת של תגובת שיקוע של הזבובים מזון-fed כחול.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי, בהתאם הקומפוזיציות של האוכל. מתי אוכל לעוף (בלי לצבוע) יוצר ספיגת-630 ננומטר, יש צורך לבצע שלב זה לחסל את הרקע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מסך thermogenetic.

תיאבון מוגבר באופן חריג גורמת צריכת המזון גבוהות, ללא קשר צרכים פיזיולוגיים. אנחנו מנוצל ערכה זו לעיצוב של תפוקה גבוהה מסך התנהגותית להשיג ידיות גנטי של נוירונים הקשור רעב, שבעה מצבים (איור 1). המסך הניב של טאוטי-Gal424. כאשר הנוירונים של טאוטי-Gal4 הופעלו בכוח ב 30 מעלות צלזיוס, של טאוטי > TrpA1 זבובים בלע כמויות גדולות יותר ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דו ח זה יעסוק על תהליך טכני של תיוג לצבוע מבחני האכלה של צריכת מזון בהקשר של thermogenetic ושליטה optogenetic ההפעלה לתמרן נוירונים האכלה. פרוטוקול זה פשוטה ואמינה יעזור להבהיר את הפונקציה של המועמד נוירונים בהאכלה שליטה, כדי למדוד את העדפת מזון זבובים, וכדי לזהות שחקנים הרומן המעגלים שליטה האכלה באמצעות האכלה מבוססות מסכי גנטי24.

לצבוע תיוג אסטרטגיה אפשרית בחקירת התנהגויות האכלה לטווח קצר. לצבוע, erioglaucine ניתרן, מומס והוא בלע עם האוכל, הוא מחוון קריטי של צריכת מזון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (2012CB825504), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (91232720 ו- 9163210042), האקדמיה הסינית של מדעי (CA) (GJHZ201302 ו- QYZDY-דר-מז-SMC015), ב"אהבה תוכנית קרן (OPP1119434), ו- 100-כשרונות של רשויות אישורים כדי ז'ו י'.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
UAS-CsChrimsonBloomintoon55135
UAS-dTrpA1Bloomintoon26263
TDC1-GAL4 Bloomintoon9312
TDC2-GAL4Bloomintoon9313
sNPF-GAL4סופק על ידי Z. Zhao
NPF-GAL4סופק על ידי Y. Rao
TH-GAL4סופק על ידי Y. Rao
5-HT-GAL4סופק על ידי Y. Rao
AKH-GAL4סופק על ידי Y. Rao
dip2-GAL4מסופק על ידי Y. Rao
Taotie-GAL4מסופק על ידי J. Carlson
AgaroseBiowestG-10
סוכרוזSigmaS7903
מלח דיסודיום ErioglaucineSigma861146
כל טרנס-רשתית סיגמא R2500מאוחסן בחושך
Triton X-100Amresco9002-93-01
זבובים1 ליטר מזון מכיל: 77.7 גרם קמח תירס, 32.19 גרם שמרים, 5 גרם אגר, 0.726 גרם CaCl2, 31.62 גרם סוכרוז, 63.2 גרם גלוקוז, 2 גרם אשלגן סורבט, pH     
  1x מאגר PBS 1 ליטר 1X PBS מכיל: 8 גרם Nacl, 0.2 גרם Kcl, 1.44 גרם Na2HPO4, 0.24 גרם KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer1X PBS עם 1% Triton X-100
  טחנת טחינהשאנג האי ג'ינג שיןTissuelyser-24
חממהנינג בו ג'יאנג נאןHWS-80
מערבל מגנטי עם צלחת חוםצ'אנג ג'ואו בו יואןCJJ 78-1
ספקטרומטרThorlabsCCS200/M
ספקטרופוטומטר מיקרופלייטתרמו מדעי Multiskan GO סוג: 1510, REF 51119200
מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי לייקה  מיקרוסקופ סטריאו M205FA
Leica S6E
מיכל חיצוניJiang Su Hai Menבקבוקון זכוכית בקוטר 31.8 מ"מ וגובה 80 מ"מ (ממד פנימי)
מיכל פנימי בייג'ינג יי רן מכונות מפעלצלחת פלסטיק בקוטר 13.6 מ"מ וגובה 7.5 מ"מ (ממד פנימי)
1.5 מ"ל צינורות אפנדורףHai Men Ning Mong
  96 צלחתבאר Corning Incorporated  Costar 3599
נוריותשין שינג יואן גואנגדיאן607 ננומטר, 3W https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058
מזון

מקורות

  1. Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
  2. Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
  3. Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
  4. Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
  5. Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
  6. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  7. Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109(2012).
  8. Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
  9. Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
  10. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560(2014).
  11. Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223(2005).
  12. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
  13. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
  14. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
  15. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87(2015).
  16. Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
  17. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
  18. Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
  19. Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
  20. Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
  21. Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
  22. Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
  23. Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192(2017).
  24. Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633(2016).
  25. Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
  26. Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
  27. Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
  28. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063(2009).
  29. Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
  30. Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
  31. Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
  32. Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
  33. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
  34. Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
  35. Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
  36. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  37. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
  40. Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
  41. Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
  42. Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Drosophila melanogaster

מאמרים קשורים