תגובות אנזימטיות אשד לסינתזה של כהלים אמינו כיראלי מ L-ליזין

למרות היתרונות הגלומים biocatalysis, השילוב של צעדים biocatalytic מסלולים סינטטיים או מסלולים biocatalytic הכולל בעיקר נותר מוגבל אנזימטי רזולוציות קינטי. המסלולים היה בשימוש נרחב כצעד ראשון בסינתזה אסימטרית כימותרפיה-אנזימטי, אך biocatalysis מציעה אפשרויות רבות יותר של קבוצה פונקציונלית interconversions עם סטריאוסלקטיביות גבוהה^1,2,3 . יתר על כן, כפי תגובות biocatalytic מתנהלים בתנאים דומים, לכן זה ריאלי לביצוע אשד תגובות ב-^4,סיר אחד אופנה⁵.

כהלים אמינו כיראלי הם מולקולות רב-תכליתי לשימוש חיל עזר בצבא הרומי או פיגומים סינתזה אורגנית⁶. Moiety אמינו אלכוהול נמצא לעתים קרובות מטבוליטים משניים, חומרים פעילים תרופות (API). כהלים β-אמינו הראשי זמין מחומצות אמינו α המתאימים על ידי סינתזה קונבנציונלי, אלא גישה כיראלי כהלים וγ-אמינו או כהלים אמינו משניות קרובות דורשת מייגע מסלולים סינטטיים יחד עם רגיש שליטה של ה סטריאוכימיה^7,8,9,10. עקב סטריאוסלקטיביות גבוהה שלה, biocatalysis עשוי לספק נתיב סינתטי עליון אלה אבני הבניין כיראלי^11,12,13,14.

בעבר דיווחנו הסינתזה של מונו - ו di-הידרוקסי-L-lysines על ידי hydroxylation אנזימטי diastereoselective על ידי dioxygenases של הברזל (II) / תלויי-α-ketoacid oxygenase המשפחה (αKAO) (איור 1)¹⁵. בפרט, dioxygenase KDO1 החל מ- L-ליזין, מזרז היווצרות של (3S) - הידרוקסי נגזרת (1), תוך כדי (4R) - נגזרת (2) נוצרת על ידי התגובה עם KDO2 dioxygenase. Regiodivergent רצופים hydroxylations על ידי KDO1 ו KDO2 להוביל להיווצרותם של (3R, 4R) - dihydroxy - L-ליזין (3) בצורה הטהורה שטיחות. עם זאת, הטווח מוגבל המצע של אנזימים אלה פוגעת שלהם ניצול גדול סינתזה, ובמיוחד hydroxylation של אמינים פשוטה, כפי moiety חומצה קרבוקסילית α-מיקום של קבוצת אמינו חיונית עבור פעילות¹⁶.

איור 1: Biocatalytic המרות של L-ליזין. המרה לתוך (3S) - הידרוקסי - L-ליזין (1) על ידי KDO1 dioxygenase; (4R) - הידרוקסי - L-ליזין (2) על ידי KDO2 dioxygenase; ו- (3R, 4R) - dihydroxy - L-ליזין (3) התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים מזורז במרוכז על ידי dioxygenases KDO1, KDO2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Decarboxylation היא תגובה נפוצה חילוף החומרים¹⁷. בפרט, חומצת אמינו בקרי קבוצת מחשבים (EC 4.1.1) הן ללא קופקטור (pyruvoyl תלוית) או אנזימים תלויי-פיפ, לעודד את decarboxylation של חומצות אמינו לתוך polyamines המתאים חיידקים, אורגניזמים גבוה^{18,19 , 20 , 21 , 22}. מונו - ו dihydroxy תרכובות (איור 3) 4–7, 10–11 שיתאימו cadaverine hydroxylated, diamine ב מתקבל על ידי decarboxylation של L-ליזין. Cadaverine הוא אבן בניין מפתח עבור התעשייה הכימית, ספציפי זה הוא רכיב של פולימרים פוליאמיד, פוליאוריתן. לכן, ייצור ביולוגי המבוסס על זה diamine ב ממשאבים מתחדשים משכה תשומת לב כחלופה המסלול מבוסס נפט, מיקרואורגניזמים שונים יש מהונדס למטרה זו. אלה מסלולים מטבוליים, ליזין DC (ולוויין) הוא האנזים מפתח. ולוויין הוא אנזים תלויי-פיפ השייכים אלנין racemase (AR) מבני המשפחה²³. פיפ תלוית בקרי התחום (Dc-פיפ) ידועים להיות מאוד ספציפי המצע. עם זאת, כמה אנזימים הבעלים את היכולת של הפקרות קלה, להיות פעיל לקראת חומצות אמינו L-ליזין ו- L-ornithine, כמו לדוגמה ולוויין של Selenomonas rumirantium (ולוויין_Srum), אשר יש קבועים קינטי דומה עבור ליזין ו ornithine decarboxylation^24,25. המצע מורחבת זו ירידה לפרטים גורם אנזים זה הוא מועמד טוב decarboxylation של מונו - ו di-הידרוקסי-L-ליזין. בנוסף, כדי למצוא DCs הפעיל לכיוון נגזרות הידרוקסיל של ליזין, בדקנו את הקשר גנומית של הגנים קידוד אנזימים αKAO. ואכן, בתוך הגנום prokaryotic הגנים קידוד אנזימים המעורבים באותו מסלול biosynthetic הוחלף נגזר בדרך כלל שיתוף מותאמים אשכולות גנים. הגן KDO2 (מתוך Chitinophaga pinensis) נמצאה שותף מקומי עם גן קידוד בשם פיפ-DC (איור 2). לעומת זאת, אין גנים קידוד עבור DC נמצאה בעת ניתוח ההקשר גנומית של dioxygenase KDO1. החלבון פיפ-DC מ ג pinensis (DC_Cpin) נבחר לכן כמועמד מבטיח כדי לעודד את השלב decarboxylation של התגובה בהתאם להיררכית הקשרים.

איור 2: הקשר גנומית של ג'ין KDO2 ב. pinensis ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

כתוצאה מכך, תיכננו תגובות אנזימטיות אשד מעורבים dioxygenases ו- DCs כדי להשיג את הסינתזה של כהלים אליפטיות כיראלי β, γ-אמינו מחומצות אמינו (איור 3). כפי שדווח בעבר, חמצון C-H על ידי את αKAO מציג מרכז הידרוקסי שהוחלפו stereogenic סה כ diastereoselectivity; כיראליות Cβ / וγ יישמרו בשלב decarboxylative, אשר משפיעה רק על פחמן Cα של ה moiety של חומצת אמינו¹⁶.

איור 3: ניתוח Retrosynthetic. (א) Retrosynthesis של β, γ-אמינו כהלים (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) L - הידרוקסי--ליזין, ו (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) ו- 1, 5-diaminopentan-3-ol (6) מ L-ליזין. Retrosynthesis (B) של β, γ - β, diols אמינו אלפא (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (10) ו- (2R, 4S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 4-diol (11) החל מ- (5R)- הידרוקסי-L-ליזין, ו- (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (7) החל מ- L-ליזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

החל מ- L-ליזין ו שלה (5R)-הידרוקסי נגזרת, אנו בזאת לדווח על שני/שלושה שלב, סיר אחד, תהליך אנזימטי שילוב dioxygenases פיפ-DCs כדי להשיג המטרה אמינו. ראש המנזר הסינתזה את המשקל מעבדה של מולקולות יעד, השיטה פותחה את המשקל אנליטיות כדי להתאים את תנאי ריאקציה, למשל, ריכוז אנזים, נדרש כדי לאפשר המרה מלאה של חומרי המוצא; אנו מציגים את הליך זה גם כן.

1. אנזים הכנה

1. אקספרס ולטהר חלבונים כמו שתואר לעיל²⁶.
   הערה: חומרים התקבלו עם ריכוז סופי הבאים: αKAO של Catenulispora acidiphila, UniProtKB מזהה: C7QJ42 (KDO1), 1.35 מ"ג/מ"ל; ΑKAO מ ג pinensis, UniProtKB מזהה: C7PLM6 (KDO2), 2.29 מ"ג/מ"ל; פיפ-DCs מ ס rumirantium, UniProtKB מזהה: O50657 (ולוויין_Srum), תא חינם לחלץ עם אנזים הכולל ב 12.44 מ"ג/מ"ל; פיפ-DC מ ג pinensis, UniProtKB מזהה: C7PLM7 (DC_Cpin), 2.62 מ"ג/מ"ל.

2. אופן ההכנה של פתרונות

הערה: כל הפתרונות שלהלן מוכנות במים יונים.

1. להכין 1 מ' HEPES מאגר, pH 7.5; התאם עם 5 מ' של NaOH.
   הערה: במהלך השלב התאמת חומציות, ללבוש כפפות מגן, ביגוד מגן, הגנה העין והגנה הפנים (P280). במקרה של מגע עם העיניים (P305, P351, P338), לשטוף בזהירות עם מים מספר דקות הסרת עדשות מגע במידת האפשר. המשך שטיפה ולקרוא באופן מיידי של מרכז רעל או רופא (P310). הקוד P מתייחס המשפט זהירות (הזארד class וקטגוריה; ראו, למשל, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).
2. להכין 100 מ מ L-ליזין, 100 מ מ (5S) - הידרוקסי - L-ליזין, חומצה α-ketoglutaric 150 מ מ, ascorbate נתרן 100 מ מ, 10 מ מ אמוניום סולפט iron(II) hexahydrate (מור מלח), 100 מ מ pyridoxal 5-פוספט (פיפ) ו 100 מ מ dithiothreitol (DTT).
3. להכין 1 מ', 2 מ' ו- 6M של חומצת מלח (HCl) פתרון HCl 37% (שנהנתם פתרון 12 מ'), ביצוע ההוראות בטיחות אותו כמו אלו המתוארים 2.1.
   הערה: הפתרונות של α-ketoglutaric חומצה, סודיום אסקורבט אמוניום iron(II) סולפט hexahydrate חייב להיעשות טרי ביום של שימוש. הפתרון ליזין ניתן לאחסן במשך מספר חודשים בטמפרטורת החדר. הפתרון פיפ ניתן לאחסן במשך חודש-4 מעלות צלזיוס. הפתרון DTT ניתן לאחסן במשך חודש אחד ב-20 ° C.

3. אנליטית-סולם תגובות

1. פיתוח שיטות עבור התגובה decarboxylation של (5R) - הידרוקסי - L-ליזין
   1. להוסיף µL 11 של 1 מ' פתרון של HEPES מאגר pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ) כדי microtube 2 מ ל. לאחר מכן, הוסף µL 22 מ"מ (5S) L - הידרוקסי--ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ), 2.2 µL של 100 מ מ פיפ (ריכוז סופי 1 מ מ), ו µL 2.2 מ"מ DTT (ריכוז סופי 1 מ מ).
      הערה: במקרה של תגובה עם ולוויין_Srum, התוספת של DTT הוא לא הכרחי.
   2. הוסף את פיפ-DC מטוהרים (הריכוז הסופי 0.1 מ"ג/מ"ל). להשלים עם H₂O עבור נפח סופי של 220 µL.
   3. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד במשך 3 שעות.
      הערה: לנער את התערובת התגובה עם מכסה פתוח באוויר הפתוח מבטיח של חמצון טוב של התקשורת התגובה. לכן לא צורך בועה חמצן בתקשורת התגובה.
   4. לאסוף 10 µL של תערובת התגובה כדי להיות מנותח על פי הנוהל ניטור התגובה שמתואר בשלב 6. הדגימות רצוי derivatized, ניתח ישירות לאחר הדגימה.
2. פיתוח שיטות עבור התגובה אשד אנזימטי שילוב צעד hydroxylation מזורז על ידי αKAO עם decarboxylation על ידי פיפ-DC
   1. להוסיף µL 11 של 1 מ' של HEPES מאגר pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ) כדי microtube 2 מ ל. לאחר מכן, הוסף µL 22 של 150 מ מ של α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 5.5 µL של 100 מ מ של סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ), 22 µL 10 מ מ של מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ מ), ו- µL 22 מ"מ של L-ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ).
   2. להשלים עם H₂O עבור נפח סופי של 220 µL, לוקח בחשבון את עוצמת הקול של הפתרון אנזים כדי להוסיף בשלב 3.2.3.
   3. להוסיף את האנזים αKAO מטוהרים הנדרש לפי רגיוסלקטיביות יישוב: KDO1 על hydroxylation במצב C-3 או KDO2 תפקיד C-4 של L-ליזין. הריכוז הסופי של האנזים מטוהרים (0.05-0.5 mg/mL) היה נחוש לאפשר המרה מלאה ב שנהנתם 3 h.
   4. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד במשך 3 שעות.
   5. להוסיף µL 2.2 מ"מ של פיפ (הריכוז הסופי ~ 1 מ מ) ו- µL 2.2 מ"מ של DTT (ריכוז סופי ~ 1 מ"מ).
      הערה: במקרה של תגובה עם ולוויין_Srum, התוספת של DTT הוא לא הכרחי.
   6. להוסיף פיפ-DC מטוהרים בריכוז מאפשר המרה מלאה ב- 18 ח': ולוויין_Srum -הריכוז הסופי המשוער של 0.1 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO1, DC_Cpin -הריכוז הסופי המשוער של 0.5 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO2.
   7. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח-300 סל ד עבור 18 h.
   8. להפעיל שגרת ניטור כמו שלב 3.1.4.
3. פיתוח שיטות עבור התגובה אשד אנזימטי המשלב שני צעדים hydroxylation מזורז על ידי αKAOs עם decarboxylation על ידי פיפ-DC
   1. להפעיל צעדים 3.2.1-3.2.2.
   2. להוסיף KDO1 ריכוז סופי של 0.05 מ"ג/מ"ל. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד במשך 3 שעות.
   3. להוסיף KDO2 הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד עבור 18 h.
   4. הפעל את שלב 3.2.5.
   5. להוסיף את פיפ-DC DC מטוהרים_Cpin הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, עם מכסה פתוח באוויר הפתוח, על 300 סל ד עבור 18 h.
   6. הפעל את השגרה ניטור כמו שלב 3.1.4.

4. חצי מפוח סיר אחד התגובה Biocatalytic

הערה: תגובות אנזימטיות מתבצעות על 0.1 mmol של L-ליזין בכוס באוויר הפתוח 250 מ ל הבקבוק Erlenmeyer עבור הנפח הכולל של 10 מ"ל.

1. סינתזה של המעו ף monohydroxylated
   1. להוסיף 0.5 מ ל 1 מ' HEPES מאגר, pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ) הבקבוקון. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של 100 מ מ L-ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ), 1 מ"ל של 150 מ מ α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 0.25 mL של 100 מ מ סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ), 1 מ ל 10 מ מ מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ"מ).
   2. להשלים עם H₂O עבור נפח סופי של 10 מ"ל, לוקח בחשבון את עוצמת הקול של הפתרון אנזים כדי להוסיף בשלב 4.1.3.
   3. להוסיף את האנזים αKAO מטוהרים הנדרש לפי רגיוסלקטיביות יישוב: KDO1 על ריכוז סופי של 0.075 ק מ"ג/מ"ל עבור hydroxylation במצב C-3 או KDO2-ריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל תפקיד C-4 של L-ליזין. ריכוז האנזים מטוהרים הסופי נקבע כדי לאפשר המרה מלאה ב שנהנתם 3 h.
   4. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר 300 סל ד למשך פרק הזמן המתאים. כאשר ה-ניטור התגובה מציין תגובה hydroxylation הושלמה (להפעיל את כל השלבים מפורטים בשלב 6 עבור התגובה ניטור פרוטוקול), להמשיך לצעוד 4.1.5. זמן תגובה אופייני הוא 3 שעות.
   5. להוסיף תערובת התגובה αKAO µL 100 מ"מ פיפ (ריכוז סופי ~ 1 מ"מ). לאחר מכן, הוסף µL 100 מ"מ DTT (ריכוז סופי ~ 1 מ מ), למעט בעת שימוש ולוויין_Srum.
   6. להוסיף פיפ מטוהרים-DC: ולוויין_Srum ב הריכוז הסופי המשוער של 0.05 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO1 או DC_Cpin -הריכוז הסופי המשוער של 0.5 mg/mL עבור התגובה בהתאם להירארכיית הקשרים עם KDO2.
   7. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, 300 סל ד, עבור 18 h ולהמשיך ישירות אל השלבים מפורטים בשלב 4.3.
2. סינתזה של הנגזרת dihydroxylated
   1. להוסיף 0.5 מ ל 1 מ' HEPES מאגר, pH 7.5 (ריכוז סופי 50 מ מ), 1 מ"ל של 100 מ מ L-ליזין (הריכוז הסופי 10 מ מ), 1 מ"ל של 150 מ מ α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 0.25 mL של 100 מ מ סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ) , 1 מ ל 10 מ מ מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ"מ). להשלים עם H₂O עבור נפח סופי של 10 מ"ל, לוקח בחשבון את עוצמת הקול של הפתרון אנזים כדי להוסיף בשלב 4.2.2.
   2. להוסיף KDO1 ריכוז סופי של 0.075 ק מ"ג/מ"ל. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר, 300 סל ד למשך פרק הזמן המתאים.
   3. כאשר ה-ניטור התגובה מציין תגובה hydroxylation הושלמה (ראה שלב 6 עבור התגובה ניטור פרוטוקול), להמשיך לצעוד 4.2.5. זמן תגובה אופייני הוא 3 שעות.
   4. להוסיף 1 מ"ל של 150 מ מ α-ketoglutaric חומצה (הריכוז הסופי 15 מ מ), 0.25 mL של 100 מ מ סודיום אסקורבט (הריכוז הסופי 2.5 מ מ), 1 מ ל 10 מ מ מור של מלח (ריכוז סופי 1 מ"מ).
   5. להוסיף KDO2 הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר 300 סל ד עבור 18 h.
   6. כאשר ה-ניטור התגובה מציין תגובה dihydroxylation הושלמה (ראה שלב 6 עבור התגובה ניטור פרוטוקול), להמשיך לצעוד 4.2.7. זמן תגובה אופייני הוא 18 h.
   7. להוסיף 100 µL 100 מ מ של DTT (ריכוז סופי ~ 1 מ מ), למעט בעת שימוש ולוויין את_Srum.
   8. להוסיף את DC מטוהרים_Cpin הריכוז הסופי המשוער של 0.5 מ"ג/מ"ל, מחושב באמצעות שעוצמת התגובה הראשונית.
   9. לנער את התערובת התגובה בטמפרטורת החדר 300 סל ד עבור 18 h.
3. מרווה
   1. לקרר את תערובת התגובה על ידי הצבת הזכוכית 250 מ ל Erlenmeyer הבקבוק באמבט קרח.
   2. להוסיף בזהירות, מעל שנהנתם 1 דקות, 0.25 mL של HCl M 6 ע י ניעור באופן ידני בעדינות את תערובת התגובה מקורר. פעל לפי הוראות הבטיחות אותו כמו אלה שתוארו בשלב 2.1.
   3. להעביר התערובת חומצי לתוך צנטריפוגה חרוט למטה 50 מ ל צינור באמצעות כוס פסטר פיפטה מצויד עם נורת, ואז צנטריפוגה-1,680 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   4. למשוך את תגובת שיקוע ולשמור בצד בבקבוקון סיבוב המדרגה 250 מ.
   5. להוסיף 10 מ ל מים יונים ברכבת התחתית התחתונה חרוט צנטריפוגה המכיל בגדר. מערבולת להשעות מחדש בגדר.
   6. צנטריפוגה ב g 1,680 x, 4 מעלות צלזיוס, למשך 15 דקות.
   7. למשוך את תגובת שיקוע והוסף אותו אל הבקבוק העגול-התחתון 250 מ ל המכיל את תגובת שיקוע הראשון (שלב 4.3.4).
   8. להקפיא את supernatants שנאספו על ידי טבילה + בקבוקי שתייה צידניות לתוך חנקן נוזלי ביד קבוע, מתערבל, להעביר מיד את הבקבוקון יריעה benchtop מייבש ההקפאה כדי למנוע את החומר מפשיר.
   9. בתום התהליך להקפיא ייבוש (לילה), הסר את הבקבוק. את המייבש ההקפאה.

5. טיהור של כהלים אמינו מן תערובת התגובה אנזימטי גולמי

1. שרף חילוף יונים
   1. להמיס את המוצר הליחה הכמות המינימלית של מימית 0.1 M של HCl (שנהנתם 4 מ"ל) עד חלקיקים מוצקים כבר אינם גלויים לעין-עירומה.
   2. תנאי sulfonic חומצה קבוצה פונקציונלית קטיון שרף, רשת 200-400, בעמודה זכוכית (20 x 250 מ מ) על ידי eluting בלחץ אטמוספירי מ' 1 HCl (עמודה 4 כרכים) ואחריו 0.1 M HCl (4 כרכים עמודה; טור אמצעי = 10 מ ל).
   3. לטעון את המדגם בקפידה בחלק העליון של השרף על הקירות של העמודה זכוכית באמצעות micropipette 1,000 µL. לאחר מכן, לשטוף ברכבת התחתית התחתונה חרוט צנטריפוגה שהכיל את המוצר הגולמי שלוש פעמים עם 1 מ ל 0.1 M של HCl תמיסה מימית לכל לשטוף, לטעון את אמצעי האחסון שטיפה הנוצרת על גבי העמודה באותה דרך.
   4. Elute עם שאינו ליניארי הדרגתיות: 4 כרכים עמודה של 0.1 M HCl, 4 כרכים עמודה של מים, 4 כרכים עמודה של 5% NH₄הו, 4 כרכים עמודה של 10% NH₄הו, 4 כרכים עמודה של 15% או NH-₄, 4 כרכים עמודה של 20% NH₄או , 4 כרכים עמודה של 25% NH₄הו ו לבסוף 4 כרכים עמודה של 28% NH₄הו.
   5. לפקח על הטיהור באמצעות HPLC (ראה שלב 6).
   6. בריכה שברים המכיל את המתחם (NH₄או 20-28%) ולהקפיא כפי שמתואר שלבים 4.3.8-4.3.9.
      הערה: העמודה יונים חוזר לאחר • תנאי עם מים יונים כדי ניטרול • תנאי מים (שנהנתם 50 מ"ל) ואחריו שפוץ מאת eluting עם 50 מ של 1 מ' של HCl.
2. SPE
   1. Solubilize את מתחם הליחה שנהנתם 2 מ ל H-₃פו-₄-/water (20 µL/mL).
   2. המקום מצב מעורב קטיון SPE 6 מ"ל-מחסנית יריעה החילוץ מחוברת משאבה מים. מצב המחסנית על-ידי ציור דרך 4 מ"ל של מתנול תחת לחץ מופחת שמספק את יריעה. Equilibrate הדיו על ידי ציור דרך 4 מיליליטר H₃פו₄/water (20 µL/mL).
   3. לטעון את הדגימה אל מיכל הדיו באמצעות micropipette µL 1,000 בחלק העליון של השרף על הקירות של העמודה זכוכית, ולשטוף את המבחנה המכילה את המוצר שלוש פעמים עם 0.75 מ ל H₃פו₄/water (20 µL/mL) לכל לשטוף. לטעון את אמצעי האחסון שטיפה הנוצרת על גבי העמודה באותה דרך.
   4. לשטוף את המחסנית על-ידי eluting תחת לחץ מופחת, שמספק את סעפת, מ 4 ל 2% HCOOH במים, ואז עם 4 מ ל מים. Elute במילוי הדרגתי של NH₄או במים (4 מ עבור כל • תנאי, החל מ- 4% NH₄או: 10%, 15%, 15%, 20% ו- 28%).
   5. לפקח על הטיהור באמצעות HPLC על-ידי ניתוח כל שבר על פי התגובה ניטור פרוטוקול המתואר בשלב 6. לשמור כל השברים המכיל טהור הרצויים נגזרת לפי אולטרה סגול (UV) chromatogram והמשך לשלב 5.2.6.
   6. בריכת שברים המכיל את הרצוי מורכבים לתוך 100 מ ל סביב הבקבוק. התחתון, לשטוף את הצינורות המכילים השברים עם מים, ולהוסיף האחסון שטיפה 100 mL עגול בתחתית הבקבוק.
   7. הסר את הממס תחת לחץ מופחת באמצעות המאדה מאובזר עם קומקום אמבט מים תרמוסטט ב 40 מעלות צלזיוס ומחובר משאבת ואקום שוכן בגובה 10 mbar.
   8. Solubilize המוצק באמצעי אחסון מינימלי של מים ולהעביר את הפתרון לתוך 25 מ ל שנשקל עגול בתחתית הבקבוק. לשטוף את הבקבוק עם נפח מינימלי של מים, להוסיף אמצעי האחסון יש לשטוף הבקבוקון 25 מ ל, והמשך לשלב 5.2.9.
   9. שוקל את המוצר מטוהרים, לחשב את התשואה.
   10. להמיס את המוצר מטוהרים בהיקף מינימלי של 2 מ' של HCl עד חלקיקים מוצקים כבר אינם גלויים לעין-העירום ולהקפיא כפי שמתואר שלבים 4.3.8-4.3.9.
       הערה: כהלים אמינו הם תרכובות רגיש, נשמרים מלחי הידרוכלוריד שלהם.

6. תגובה ניטור וניתוח המוצר

1. Derivatization של מצעים ומוצרי לפני ניתוח HPLC
   הערה: מצעים, מוצרי צריכה להיות derivatized כמו נגזרות ארומטי להגדיל detectivity כרומטוגרפי שלהם UV. השתמשנו 1-פטור-2, 4-dinitrobenzene (DNFB). כל מדגם היה מוזרק HPLC מיד לאחר derivatization.
   1. לקחת 10 µL של התגובה אנזימטיות, העברה 1.5 mL microtube. להוסיף 10 µL של 0.25 M של תמיסה מימית של₃ NaHCO 100 µL של אתנול, 30 µL של 2.5 מ"ג/מ"ל של פתרון DNFB אתנול.
   2. לסגור את microtube ומנערים הפתרון שיתקבל עבור 1 h-65 ° C, ב- 1000 סל ד. כיבוי עם 10 µL 1 מ' של HCl.
   3. לסנן מעל 4 מ מ קוטר מסנן שאינו סטרילי מזרק עם מיקרומטר 0.22 נקבובית גודל polyvinylidene הידרופיליות פלואוריד (PVDF) קרום באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל.
2. לבצע ניטור של התגובה dioxygenase באמצעות כל מערכת מסוגל להפריד derivatized חומצות אמינו. פרוטוקול זה כרוך UV זיהוי של חומצות אמינו derivatized על ידי קבוצה כרומופור²⁷dinitrobenzene (DNB).
   1. מתאים את HPLC עם סי18 חיבור פוטוני endcapping שלב הפוכה עמודה (5 מיקרומטר, 3 x 150 מ מ).
   2. Equilibrate את העמודה סי18 עם eluent (30:70) B (MeCN + 0.1% TFA) כדי eluent A (H₂O + 0.1% TFA) בספיקה של 1 mL/min ו- 35 º C למשך 15 דקות (תואם לאמצעי אחסון עמודה שנהנתם 20).
   3. מזריקים µL 10 של תערובת התגובה derivatized (ראה שלב 6.1) אל העמודה סי18 HPLC. משתמשים בתערובת של MeCN, 0.1% TFA/H₂O ו- 0.1% TFA כמו eluent עם מעבר צבע ליניארי (יחס 30:70 כדי 70:30 ב 9 דקות, 35 ° C, טמפרטורה זרימה 1 mL/min).
   4. השתמש בזיהוי UV שוכן בגובה 400 nm לנתח את המוצרים eluted על העמודה כרומטוגרפי. DNB-ליזין elutes בדרך כלל בסביבות 6.5 דקות DNB hydroxylated-בסביבות 5.5 דקות ליזין, dihydroxylated DNB-ליזין בסביבות 4.2 min, DNB-aminodiol בסביבות 5.3 min.

7. NMR ניתוח של כהלים אמינו מטוהרים

1. להמיס מטוהרים כהלים אמינו D₂O (700 µL) ולהעביר את הפתרון ל צינור תהודה מגנטית גרעינית (NMR).
2. רוכשים ¹H ו- ¹³ספקטרום C NMR לפי המתאים NMR מתקן פרוטוקולים²⁸.

בעבר דיווחנו הסינתזה של מונו - ו di-הידרוקסי-L-lysines על ידי hydroxylation אנזימטי diastereoselective על ידי dioxygenases של הברזל (II) / αKAO המשפחה (איור 1)16. כדי למטב את הפרוטוקול של המפלים כולו המובאים כאן, המשלבים צעדים hydroxylation אחד או שניים על ידי αKAO ואחריו צעד decarboxylation על ידי פיפ-DC, התנאים התגובה הותאמו כדי לספק את הדרישות של שניהם תגובות אנזימטיות. התחלנו על ידי חקירת הפעילויות של שני בקרי קבוצת מחשבים, ולווייןSrum ו DCCpin, לכיוון זמינים מסחרית (5R) - הידרוקסי - L-ליזין. ואז אנחנו לבדיקה הפעילויות DC לכיוון נגזרים מונו, 3-הידרוקסי-L-ליזין (1) ו- 4-הידרוקסי-L-ליזין (2), ב- cascade עם הצעד חמצון על ידי את αKAO המתאים. טבלה 1 מציגה את התוצאות של decarboxylations biocatalytic של מונו-הידרוקסי-L-lysines. המרות נמדדו על ידי HPLC לאחר derivatization של תערובת התגובה עם DNFB לתת DNB המתאימים derivatized סובסטרטים ומוצרים.

טבלה 1: decarboxylation Biocatalytic של monohydroxy-L-lysines. תנאי ריאקציה: המצע (10 מ מ), פיפ-DC (0.1 עד 0.15 מ ג מ ל-1), HEPES מאגר (50 מ"מ, pH 7.5), פיפ (1 מ מ), DTT (1 מ"מ; לא נעשה שימוש עם ולווייןSrum), לילה, RT, 300 סל ד. () מסונתז enzymatically בתוך באתרו. (b) 0.1 מ"ג/מ"ל. (ג) 0.15 מ"ג/מ"ל; n.d.: לא מזוהה

ה-DC מ ס rumirantium (ולווייןSrum) הציג פעילות לקראת כל lysines הידרוקסי מונו עם המרה הטוב ביותר של 3 - ו 5-המעו ף המקביל diamines כיראלי הידרוקסי (ערכי 1, 3 ו- 5). כצפוי, DCCpin, ה-DC של הקשר גנומית αKAO, התברר כי המתאים ביותר עבורך decarboxylation של (4R) - הידרוקסי - L-ליזין (2) (ערך 6). תחת התגובה השגרתית תנאים ההמרה של (3S) - הידרוקסי - L-ליזין (1) לתוך המקביל decarboxylated (5) עם DCCpin היה נמוך (ערך 4), ללא פעילות נצפתה לכיוון (5R)- הידרוקסי-L-ליזין (כניסה 2).

לבסוף, אנו בחן את פעילותם של שני בקרי התחום לכיוון נגזרות di-הידרוקסי-L-ליזין 3, 8ו 9, מסונתז באתרו על-ידי אחד או שני שלבים hydroxylation על ידי KDO1, KDO2 או שילוב של השניים (איור 2). תוצאות decarboxylation biocatalytic של di-הידרוקסי-L-lysines מסוכמות בטבלה 2.

בטבלה 2: decarboxylation Biocatalytic של dihydroxy-L-lysines. תנאי ריאקציה: המצע (10 מ מ), פיפ-DC (0.1 עד 0.15 mg/mL), HEPES מאגר (50 מ"מ, pH 7.5), פיפ (1 מ מ), DTT (1 מ"מ; לא נעשה שימוש עם ולווייןSrum), לילה, RT, 300 סל ד. () מסונתז enzymatically בתוך באתרו. (b) 0.1 מ"ג/מ"ל. (ג) 0.15 מ"ג/מ"ל; n.d.: לא זוהה.

לגבי decarboxylation של dihydroxy-L-lysines 3, 8, 9, התוצאות לא היו משביעות רצון לחלוטין. בתנאים התגובה השגרתית, בלבד (3R, 4R) - dihydroxy - L-ליזין (3) הוסב באופן כמותי diamine ב המתאימים dihydroxy 7 (ערכים 1 - 2). ההמרה של 4, 5-dihydroxy-L-ליזין (8) היה בינוני (ערכים 3-4) אבל זו ראוי לציין כי זה יכולים להשתפר על ידי המגביר את טעינת אנזים. אף אחד שני שנבדקו פיפ-Dc נמצאו פעילים לכיוון 3.5-dihydroxy-L-ליזין (9) (ערכים 5-6).

התגובות אשד אנזימטי מפגין ההמרה כמותיים כפי שנקבע על-ידי ניטור HPLC היו מדורגים בהצלחה (איור 4).

איור 4: נציג נתונים אנליטיים על המפל אנזימטי שלושה שלבים- (א) HPLC ניטור של biocatalytic המרה של L-ליזין לתוך (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentan-2, 3-diol (7). RT = זמן השמירה. (B) 1H NMR ו- (ג) 13C NMR של אלכוהול אמינו (7) לאחר טיהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פרוטוקול טיהור שהוצגו במסמך זה מאפשר חילוץ יעיל מורכב אמינו מן התערובת מורכבת התגובה אנזימטי. אמינו 4, 5, 6ו- 7 התקבלו של התשואות מעולה (איור 5).

איור 5: מפלי אנזימטי לסינתזה של אמינו. סינתזה של (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4), (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5), 1, 5-diaminopentan-3-ol (6), ו- (2R, 3R) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.