הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

20.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56985

⸱

18 באוקטובר 2018

 ,  ,  , 
1Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, 2Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute and Department of Microbiology, Monash University

במאמר זה

סיכום

עכברים מייצגים מודל לא בפז ויוו ללמוד זיהום מחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים במערכת העיכול. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות ללימוד מושבת חיידקים ושינויים histopathological העכבר מודלים של הליקובקטר פילורי-הקשורים למחלה.

תקציר

הליקובקטר פילורי הוא. חיידק קיבה נוכח חצי מהאוכלוסייה הכללית, היא הגורם המשמעותי התחלואה והתמותה בבני אדם. מספר מודלים העכבר של זיהום הליקובקטר בקיבה פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הסלולר לפיה ח פילורי חיידקים ליישב את הבטן של בני-אדם כפונדקאים, לגרום למחלות. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקולים: 1) להתכונן המתלים חיידקי הזיהום ויוו של עכברים ויה intragastric gavage; 2) לקבוע את רמות מושבת חיידקים ברקמות קיבה העכבר, על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) וספירת קיימא; ו 3) להעריך שינויים פתולוגיים, מאת היסטולוגיה. כדי ליצור Helicobacter זיהום בעכברים, חיות (SPF) ללא פתוגן מסוים קודם מחוסנים עם המתלים (מכיל ≥ 105 המושבה יוצרי יחידות, CFUs) של העכבר-להמדינות זני גם הליקובקטר פילורי או אחרים spp. הליקובקטר בקיבה של חיות, כגון הליקובקטר חתול. -זיהום שלאחר זמן מתאים-נקודות, קיבות טוחנות, גזור sagittally לתוך רקמות שווה שני קטעים, אחד המרכיבים את האזורים antrum וגוף. אחד של קטעים אלה משמש לאחר מכן או ספירה מעשית או הפקת דנ א, ואילו השני הוא נתון לעיבוד היסטולוגית. מושבת חיידקים ושינויים histopathological בבטן עשויים להידרש באופן שגרתי בסעיפים רקמת קיבה מוכתם Warthin-כוכביים, Giemsa או Haematoxylin, אאוזין (H & E) כתמים, לפי הצורך. ניתוחים נוספים אימונולוגי עשוי להתבצע גם על ידי אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence על העכבר רקמת קיבה חלקים. הפרוטוקולים המתוארים להלן נועדו במיוחד כדי לאפשר את ההערכה בעכברים של פתולוגיות קיבה דמוי אלה הקשורות האדם ח פילורי מחלות, כולל דלקת, ניוון בלוטת הלימפה זקיק היווצרות. Inoculum הכנה והפרוטוקולים intragastric gavage עשוי גם להיות מותאם ללמוד בפתוגנזה של אחרים המעית האנושי גורמי מחלה לישוב עכברים, כגון סלמונלה Typhimurium או Citrobacter rodentium.

מבוא

הליקובקטר פילורי הוא. בצורת ספירלה, גראם שליליים, אנושי קיבה חיידק נוכח כל האוכלוסיות ברחבי העולם, עם זיהום המחירים במדינות מתפתחות מוערך לפי 80%1. למרות שרוב ח פילורי-אנשים נגועים הם אסימפטומטיים, יש לפתח מחלות חמורות יותר, ועד סרטן קיבה2כיב פפטי. ח פילורי-סרטן הקשורים בהרחבה מאופיינים על-ידי שינויים ממאירים בתאי אפיתל (GECs) או היווצרות של רקמות הלימפה קטרי במיוחד בבטן, וכתוצאה מכך אדנוקרצינומה קיבה או רירית הקשורים הלימפה לימפומה רקמות (מאלט), בהתאמה. ח פילורי מותאמת במיוחד כדי לשרוד גומחה אקולוגית קשה של הקיבה בשל נוכחותם של הגורמים התקפה אלימה ומנגנונים שונים להקל על הדבקות שלה, גדילה וחילוף החומרים במקצוע הזה. בפרט, ארסית זני ה פילורי להחזיק את 40 kb חטיבתי פתוגניות איילנד (חטיבתיפאי) מקודד כ 30 גנים הדרושים לייצור סוג 4 הפרשת מערכת (T4SS)3,4 . חטיבתי פאי-חיוביות ח פילורי זנים משויכים אינדוקציה של רמות גבוהות של דלקת כרונית במארח, אשר היה מעורב כמו קודמן חיוני של אדנוקרצינומה קיבה5.

In vivo מודלים בעלי חיים, במיוחד עכברים, היה מאוד אינפורמטיבי על ידי ומאפשר לחוקרים לחקור את התרומה של המארח, גורמים חיידקי וסביבתיים על ה פילורי זיהום, מחלת התוצאה6. מחקרים בעבר הראו כי ממושך ח פילורי זיהום של עכברים על הרקע הגנטי C57BL/6 תוצאות בפיתוח של גסטריטיס כרונית של בלוטת להתנוון, שניהם ההיכר של ה פילורי זיהום7. יתר על כן, זיהום עם המין חיידקי קשורים חתולים/כלב, חתול ה', הוכח כדי לעודד היווצרות מאלט בעכברים עם התקדמות המחלה כפי שניתן לראות ב-8,לימפומה מאלט האנושי9מחלות דומות. הנפוץ ביותר בשימוש ח פילורי בידוד במחקרים קולוניזציה העכבר הוא "סידני המתח 1" (SS1) זן10, אשר חטיבתיפאי+ אך יש של T4SS שאינם פונקציונליים (T4SS−)11. זנים אחרים בשימוש נרחב כוללים ח פילורי B128 7.13 (חטיבתיפאי+/T4SS+)12 ו- X47-2AL (חטיבתיפאי–/T4SS−)13. ה חתול זיהומים, המתח CS1 ("החתול ספירלה 1", חטיבתיפאי–/T4SS−) נמצא בשימוש בדרך כלל14.

במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את הכנת הליקובקטר inocula ויוו זיהום, נוהל gavage intragastric של עכברים, כמו גם שיטות עיבוד רקמות לחקר שינויים histopathological בבטן. בפרט, מאמר זה יתמקד השיטות היסטולוגית נהגו להמחיש מושבת חיידקים להעריך שינויים histopathological, כולל היווצרות מאלט, רירית קיבה של עכברים נגועים. חלק מהשיטות המתוארות כאן עשוי להיות מותאם לחדר העבודה של פתוגנים במעיים אחרים כגון ס Typhimurium או rodentium ג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צמיחה והכנה של חיידקי Inocula

  1. הפשרת גליצרול המלאי של ה פילורי או חתול ה15 מ-80 מעלות צלזיוס ו תת-תרבות על פלטות אגר דם (HBA) סוס הכוללת: אגר דם בסיס מס ' 2 (ראה טבלה של חומרים); ששונה "אנטיביוטי בררני תוספת של Skirrow" (המורכב ואנקומיצין, 10 μg/mL; polymyxin B, ננוגרם למ"ל 25; וטרימטופרים, µg 5/mL; המפוטריצין, 2.5 μg/mL); ל- 5-10% (v/v) סוס דם15,16. החיידקים לגדול גם בתנאים microaerobic 2.5 או 3.5 L אנאירובית כדים המכילים את הגז המתאים חבילות (ראה טבלה של חומרים), ב- 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ח פילורי זנים הגדלים בתנאים אלה חייבים להיות subcultured אחרי 1-1.5 ימי דגירה, ואילו עבור ה חתול, לפחות 2 ימי דגירה נדרש בדרך כלל. מדיה ותרבות אחסון מתאימים תוארו ב פירוט בעבר15.
  2. היכונו inocula חיידקי זיהום העכבר מתרבויות בתחילת עד אמצע שלב לוגריתמי. הקציר חיידקים בעדינות מן פלטות אגר על ידי הצפה כל צלחת עם 1-2 מ של המוח הלב אינפוזיה (BHI) מרק. האחות המתלים של צלחות עם פיפטות פסטר.
    1. לחלופין, להכין inocula מחיידקים הליקובקטר כי יש כבר הופץ ב- BHI מרק עבור 16 – 18 h15. במקרה זה, לאסוף חיידקים על ידי צנטריפוגה מהירות נמוכה ב x 2,200 g 10 דקות ב 4 º C.
  3. להעריך את הכדאיות ואת תנועתיות של החיידקים על ידי בחינת תכשירים הר רטוב תחת מיקרוסקופ לעומת זאת שלב (המטרה X 100). הכן טעינות רטוב על ידי resuspending של loopful של חיידקים ב 10 – 20 μL droplet של BHI מרק על משטח זכוכית מיקרוסקופ. במקרה של חתול ה', אשר הינו חיידק הרבה יותר גדול מאשר ח פילורי, להשתמש haemocytometer לספור במדויק את המספרים של חיידקים קיימא. לאשר תרבות טוהר על ידי ביצוע גראם.
    הערה: השתמש רק ח פילורי inocula אם הרוב המכריע של חיידקים בעלי צורה bacillary או ספירליים (המורפולוגיה יכול להשתנות בהתאם המתח). ה חתול inocula בעיקר להכיל חיידקים בצורת הסליל. אל תשתמש inocula אם רוב החיידקים יש מורפולוגיה של coccoid, כמו טפסים אלה אינם קיימא לא תקים זיהום בעכברים.
  4. להעריך את מספר חיידקים inoculum על ידי ספירת תחת מיקרוסקופ לעומת זאת שלב המספר המשוער של חיידקים לכל שדה (המטרה X 100) ועל -ידי שימוש במדריך הבא: חיידק 1 לכל שדה = כ 106 המושבה יוצרי יחידות ( CFU) של הליקובקטר/mL; חיידקים 10 לכל שדה = כ 107 CFU/mL; חיידקים 100 לכל שדה = כ 108 CFU/mL, וכו '.
    1. בעת שימוש haemocytometer, לחשב CFU/mL באמצעות הנוסחה הבאה:
      CFU/mL (המספר הממוצע של חיידקים בתוך שדה 4 x 4) = x (דילול פקטור) x (104).
  5. להתאים את צפיפות תא החיידק inoculum כ 107–108 CFU/mL על ידי דילול במרק בשר BHI, במידת הצורך.
    1. כדי להבטיח מקסימלי הכדאיות חיידקי, להשתמש inocula עבור intragastric gavage בהקדם האפשרי לאחר ההכנה.
    2. תמיד לאשר ח פילורי תא צפיפות, הכדאיות על-ידי ביצוע ספירת קיימא inocula מיד לאחר הניתוח gavage (ראו להלן). זה לא תמיד אפשרי עבור חתול ה', כמו זה לא בדרך כלל בצורת מושבות המבודד במדיה תרבות. המספרים של קיימא הליקובקטרs ב- inocula לא יכול להיקבע על ידי מדידת צפיפות אופטית (600) לבד כמו בשיטה זו לא להפלות בין קיימא (קרי, bacillary/ספירלה/לוליינית), כלכלית ( קרי, coccoid) חיידקים.
    3. להשתמש בערכי צפיפות אופטית, כאמצעי להערכת המספרים של קיימא ח פילורי חיידקים inocula, אבל במקרה הזה, זה הכרחי הראשונה לייצר עקומת גדילה. בשביל זה, הערכים600 A של ה פילורי תרבויות במעקב לאורך זמן, בקורלציה ישירות נגד המספרים של חיידקים קיימא, נקבע על ידי ספירת צלחת.
      הערה: שיטה נוחה לביצוע כזה האישושים עקומת גדילה היא התרבות חיידקים בינוני נוזלי (סעיף 1.2), שימוש בתחתית שטוח רגיל תרביות רקמה מבחנות בחממה2 CO 10%. המספרים של CFUs, מחילופי aliquots של התרבויות שהושג h כל 4-6 במשך 2-3 ימים, ואז לעומת ערכים600 17המתאימה. חשוב לציין, עקומות גדילה להפיקם עבור כל זן ה פילורי , כמו אלה עשויים לגדול בקצב שונה, יתר על כן, לא כל זני לגדול גם ב 10% CO2.

2. intragastric Gavage של עכברים עם הליקובקטר

הערה: שיטה זו של intragastric gavage שניתן להחיל על מינים אחרים חיידקי ליישב את הבטן למשל S. Typhimuriumrodentium ג, ליסטריה.

  1. 6 – 8-בת שבוע, ספציפית נטולת פתוגן (SPF) ולהשתמש הליקובקטר-חינם עכברים זכר או נקבה. להשתמש בבעלי חיים עם רקע גנטי C57BL/6 לניסויים זיהום עם ה פילורי או חתול ה'. במחקר הנוכחי, אנו נעשה שימוש פראי-סוג (WT), מהונדסים גנטית C57BL/6 עכברים שחסרו קולטן החיסון מולדים מפתח (הנקרא מעלף או חיות KO).
    הערה: עכברים על רקע גנטי אחר יכול לשמש גם עבור זיהומים הליקובקטר , עם זאת, רמות קולוניזציה וחומרת המחלה עשוי להיות מושפע הסוג של המארח רקע18,19.
  2. מחוק לגמרי את inoculum חיידקי (שלב 1.5) לתוך מזרקים חד פעמיות 1 מ"ל ולהחליף את המחטים שסופקו עם מחטים מד 23 שעליו הם קטטרים מוצמדת פוליאתילן חד פעמיות (אורך, 6 – 8 ס מ; קוטר פנימי, מ"מ 0.58). הדקו קטטרים כדי מחטים זעירות על ידי היישום של רצועות קטנות של פלסטיק הסרט (ראה טבלה של חומרים). לחלופין, החלף את מכלול המחט/קטטר על-ידי שימוש סטרילי פלסטיק צינורות האכלה (20 מד x 38 מ מ).
  3. פיזית לרסן עכברים עם אחיזה חזקה בבית הזה. הצוואר ואת הזנב.
    הערה: הליך זה יכול להתבצע ללא הרדמה, או לחלופין, עם השימוש של הרדמה נשאפים, כגון methoxyflurane או איזופלוריין15.
  4. הכנס קטטר לתוך המרכז של הלסת פתוח, מדריך בכיוון סימטרית לכיוון הוושט. להאריך את הצוואר של העכבר כדי לאפשר נוחות גישה אל הקיבה דרך הוושט (ורחוק קנה הנשימה) עד רוב או כל של הקטטר אינה גלויה, התנגדות מורגשת, התואם הבסיס של הקיבה. לספק aliquot מסוים, בדרך כלל 100 μL לכל חיסון (איור 1).
    הערה: עכברים צריך להיות gavaged עם ≥ 105 CFU כדי להבטיח פתולוגיה קולוניזציה ומחלות אופטימלית.
  5. עכברים בבית במתקן בעלי SPF משך זמן הניסוי.
    הערה: פתולוגיה קשה ו אדנוקרצינומה בעכברים WT C57BL/6 הוא רק ציין כ 24 חודשים לאחר הפגיעה20. עם זאת, אפקט זה ייתכן שיאיצו כמה חיות מהונדס גנטית, או בעכברים עם רקע גנטי אחר.
  6. עם סיומו של ההליך gavage, לבצע שינוי של הטכניקה ק ו Misra כדי לקבוע את המספרים של קיימא ח פילורי חיידקים מנוהל על עכברים. בשביל זה, inoculum הוא באופן סדרתי מדולל (מתוך 10− 1 עד 10−5) ב- BHI באמצעות השיטה המתוארת ב פירוט בעבר15.
    הערה: כדי להבטיח בידוד של המושבות יחיד, HBA צלחות צריך להתחמם, ייבוש בתנור בטיחות ביולוגית ארון או 37 ° C חממה במשך 10-15 דקות לפני השימוש.

3. קצירת רקמות מן פוסט-הניסוי עכברים

  1. המתת חסד עכברים באמצעות שאיפת פחמן דו-חמצני או נקע בצוואר הרחם, על פי ועדת האתיקה הרלוונטיים עבור ניסויים בבעלי חיים.
  2. פתיחת חלל הבטן, לסלק את הקיבה באמצעות מספריים בסדר, מעוקל.
    הערה: סרה יכולה גם להיות שנאספו על ידי ניקוב הלב כדי לסייע בחקירה של התגובות Helicobacter זיהום מערכתי. בנוסף, האוסף של טחולים ואת בלוטות הלימפה paragastric שימושיים בלימוד תגובות מערכת החיסון מסתגלת.
  3. לחתוך את הבטן לאורך שכדור גדול יותר, להסיר את שאריות המזון על ידי עדין כביסה בפוספט סטרילי buffered מלוחים (PBS) צינורות 50 מ.
  4. לשטוף את הקיבה שוב ב- PBS סטרילי, ואז רושמות את משקל רטוב באמצעות פטרי פלסטיק tared 6 ס מ.
  5. לשטח את הבטן ומנתחים sagittally לשני מקטעים שווים רקמה, כל הכוללת: antrum, הגוף ואזורים שאינם הבלוטות forestomach (איור 2). להסיר את האזור הלא-הבלוטות ולשקול אחד חצי של כל הבטן לפני הוספת או 1 מ"ל של BHI סטרילי (עבור ספירה מעשית) או תצמיד קפוא חנקן נוזלי (להפקת DNA/RNA).
    הערה: צינורות המכיל רקמות BHI יש לאחסן בקירור עד שיהיו מוכנים להיות מעובד. הצמד רקמות הקיבה קפוא יכול לשמש גם כדי לחלץ RNA או חלבונים qPCR (PCR כמותי) או ניתוחים סופג המערבי, בהתאמה.
  6. הוסף הבטן אחרים חצי צינור 15 מ"ל המכיל 10% פורמלין. לטבול רקמות בפורמלין 10% 10 s ולשטח ואז לצד העליון של צינורות. לאפשר לרקמות לתקן לפני מחדש אנו ממליצים 10% הפתרון פורמלין למשך תקופה מינימלית של 24 שעות.
    הערה: רקמות יכול להישאר בפורמלין 10% במשך שבועות רבים לפני עיבוד היסטולוגיה. אחסון ממושך של רקמות, אולם, משפיעה על שלה אדריכלות ו/או antigenicity וכתוצאה מכך תת אופטימלית בתוצאות ניתוחים במורד הזרם.

4. אישור של כיבוש חיידקי הזיהום שלאחר הקיבה

  1. ספירת קיימא של ה פילורי בקיבה
    1. תוספת סטרילי צלחות מארח (hba) עם אנטיביוטיקה נוספים (200 μg/mL עצמאית ו חומצה naladixic μg/מ"ל) לפני ביצוע ספירות המושבה מ העכבר נגוע קיבות16.
    2. Homogenize מקטעים הקיבה גם באופן ידני, באמצעות micropestles פוליפרופילן autoclavable, או באמצעות מכשיר מכני דיסוציאציה (ראה טבלה של חומרים).
    3. להכין דילולים טורי כפולים (10− 1 עד 10−2) של homogenates קיבה וכתוצאה מכך ב- BHI סטרילי.
      הערה: דילולים צריך ייקבע בהתבסס על עומסים חיידקי טיפוסי השיג עבור נתון ח פילורי זן המשמש זיהום, כמו גם משך הזמן של זיהום. ניתן להשתמש גם דגימות מדולל.
    4. לחלק מראש מיובשים צלחות מארח (hba) (ראה הערה לעיל) שלושה או ארבעה מקטעים. באמצעות עיבוד של הטכניקה ק ו Misra, להוסיף 10 – 100 מ ל כל דילול על גבי קטע של צלחת אגר, מפיצים את עצמם באמצעות לולאות פלסטיק סטרילית15.
    5. לאפשר את הצלחות יבש ולאחר מכן מקם אותם בעמדה הפוכה (צד המכסה למטה) בצנצנות גז אובליגטוריים. כדי לשמור על לחות בתוך הצנצנות, לכלול צלחת פטרי המכיל מים.
    6. דגירה צנצנות ב 37 ° C עד מושבות יוצרים (בדרך כלל 4-7 ימים).
    7. למנות segment(s) המכיל בין מושבות המבודד 10 עד 100.
      הערה: ח פילורי מושבות וצמיחה ה חתול על צלחות ניתן להבדיל בין אלה של שאר חברי microbiota קיבה מאתר באמצעות בדיקות תקן אוראז, קטלאז, אוקסידאז. ח פילורי חתול ה' הם חיוביים עבור כל שלוש בדיקות.
    8. לחשב בקטריאלי טוען כמו (CFU/g של רקמה), באמצעות הנוסחה הבאה:
      [× (המספר הממוצע של המושבות שנספרו) (דילול פקטור) x (נפח מצופה)] / (קיבה משקל).
  2. זיהוי של ה חתול דלקת ברקמות קיבה על ידי פולימראז תגובת שרשרת (PCR)
    1. לחלץ את הדנ א מקיבות העכבר באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של בידוד ה-DNA, או ערכת זמינים מסחרית.
    2. לקבוע את ריכוז הדנ א דוגמאות שימוש בטכניקה כימות fluorometric (ראה טבלה של חומרים).
    3. להגדיר תגובות PCR מיקוד שבר 325-בסיסי זוגות (bp) של ג'ין (ureB) אוראז B21 ה חתול . כל התגובה צריך להכיל: 100 ננוגרם של דנ א גנומי; 1 מ"מ כל של קדימה (5'-AAA ATC CAC גה GAC TGG GG-3'), הפוכה (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') תחל; dNTPs 200 מ"מ; 0.5 יחידות של אנזימים, את כמויות מתאימות של מאגר מים נטולי נוקלאז.
      הערה: זוג oligonucleotide הזה תוכנן כדי לזהות לאגד רצפים הומולוגיים בגנים ureB ח פילורי וח' חתול אבל כאשר נתון לתנאים PCR להלן, לא אלה נוכח ureB הגנים של enterohepatic הליקובקטר spp.
    4. לבצע הגברה PCR באמצעות פרופיל תרמי הבאים: חימום ב 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו 35 מחזורי 94 ° C ל 30 s, 61 ° C ' s 30 ' 72 ° C עבור 1 דקות, לפני מחזיק ב 20 º C.
    5. להפעיל את מוצרי ה-PCR על 2% agarose ג'ל למשך 30 דקות ב- 100 וולט.

5. היסטולוגית ניתוחים של הליקובקטר -נגוע העכבר הקיבה מקטעים

  1. עיבוד של רקמות הקיבה
    1. להסיר רקמות הקיבה פורמלין, המקום נקי פטרי.
    2. חתוך רקמות הקיבה עם איזמל לרצועות כמה שווים בגודלם האורך (כל 2-3 מ מ עובי) ולמקם שכותרתה קלטות ההטבעה המכילה קצף ריפוד.
    3. תיקון רקמות הקיבה על ידי הצבת קלטות ההטבעה בתוך צנצנת מלאה 80% אתנול.
      הערה: קיבות שניתן לעבד באופן מיידי או לאחסן עד 1 – 2 ימים לפני שתמשיך לשלב הבא.
    4. תהליך קיבות על מעבד רקמות אוטומטיות, מתוכנת עם ההגדרות הבאות:
      התייבשות: 70% אתנול - 1 מחזור, 20 דקות; 90% אתנול - 1 מחזור, 20 דקות; 100% אתנול - 2 מחזורים, 20 דקות + 1 מחזור, מחזור מינימום 40 + 1, 1 h.
      ניקוי: קסילן – 2 מחזורים, 30 דקות + מחזור 1, 45 min.
      הספגה: פרפין ב 60 מעלות צלזיוס - 1.25 h h 1 + 1 מחזור, מחזור 45 דקות + 1, מחזור 1.
    5. הסר את הדגימות מעובד מהמכונה, לשמור בטמפרטורת החדר להטבעת פרפין.
  2. פרפין הטבעה של רקמות הקיבה מעובד
    1. מניחים בתבניות בסיס נירוסטה על השלב של יחידת ההטבעה כדי לחמם את הבסיסים של התבניות.
      הערה: מכונת הטבעה להגדיר ב 60 מעלות צלזיוס להטבעת פרפין יעיל.
    2. במקום קסטות שעווה המכילים את הדגימות לאזור שעווה חמה אמבט חמים צלחת של יחידת ההטבעה עד שעווה מתמוסס לחלוטין.
      הערה: מומלץ כי המדגם להיות מוטבע זמן קצר לאחר שעווה מתמוסס. פעולה זו מבטיחה כי התקשות של רקמות לא מתרחשת.
    3. ממלאים חצי התבניות מפלדת פרפין. בעזרת מלקחיים חמים, להסיר רצועות רקמת הקיבה קלטות ולדחוף בעדינות שהבטן רצועות דרך הפרפין לבסיס של התבניות. להתמצא רקמות רצועות בזווית ישרה לבסיס של התבניות בקפידה כך מטרותיהם הפרוס פונות כלפי מעלה.
      הערה: השלבים הבאים צריכה להתבצע מהר ככל האפשר להימנע התקשות והפרדה של השכבות פרפין במרחק רחובות מוטבעים. הכיוון הנכון של רקמות הקיבה הוא קריטי עבור ניתוחים במורד הזרם.
    4. מניחים בתבניות על הצלחת הקרה של יחידת ההטבעה כדי לתקן את דגימות במקום, מחדש להתמצא רקמות במידת הצורך.
      הערה: אם הרקמות. להפוך ניתק ומתחיל הפרפין להקשיח, המקום בתבניות חזרה לצלחת חמים כדי להמיס את השעווה ולהכניס מחדש רקמות בתוך תבניות.
    5. מניחים מחצית שכותרתה ההטבעה הקלטות (אשר שימשו עיבוד רקמה) על החלק העליון של התבניות ומלא בעדינות עם שעווה חמה. אל תאפשר פרפין תציף.
    6. בעדינות מניחים בתבניות על צלחת קר, להתקרר.
    7. ברגע הפרפין הגדיר באופן מלא, להפריד את אבני מוטבע בתבניות. פרפין עודף נקי בקצוות קלטת באמצעות צלחת חמה (מוגדר מעל 80 ° C) או מגרד. ניתן לאחסן בלוקים בטמפרטורת החדר עד חלוקתה מבוצעת.
  3. חלוקתה של רקמות
    1. להירגע בלוקים רקמות פרפין-מוטבע על הקרח וחום באמבט מים מלא מים הנדסה גנטית כדי 40 – 45 מעלות צלזיוס.
    2. לאבטח את הלהב מחזיק האזמל הקטן, לקבוע את זווית הסיווג בין 1-5° כדי למנוע מגע בין בלוק סכין והפנים ההיבט, לפני הוספת בלוקים פרפין.
      הערה: ודא בלוקים ברורים הפרפין עודף רכשה מלהטביע, כמו זה עלול לעכב את ההתאמה של הרחוב.
    3. להתמצא הלהב עבור חתך ישר על פני הרחוב. חותכים בעדינות סעיפים 2-3 דק כדי להבטיח למקם נכון את הרחוב.
    4. חתוך קוביות על ידי עובי של 10 – 30 מ מ. שלב זה מבטיח כי יהיה לחתוך פני שטח מקסימלי של כל רצועת רקמה.
    5. חותכים 10 מיקרומטר ומקטעים להשליך כל המכילים חורים שנגרמו על ידי גיזום.
    6. בזהירות לאסוף במקטעים באמצעות פינצטה ולממן אותם באמבט מים לשיטוח. השתמש פינצטה כדי להפריד כל מקטע.
    7. איסוף מקטעים מן המים הרותחים במקום על גבי מדרון זכוכית טעון (ראה טבלה של חומרים).
    8. לאחסן שקופיות זקוף במעמד שקופית ומניחים בתוך אינקובטור ב 37 º C. סעיפים יבשים בין לילה.
    9. חנות מקטעים בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן עבור ניתוחים שלאחר מכן.
  4. Haematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת רקמות הקיבה
    1. Dewax השקופיות באמצעות 3 שוטף של קסילן למשך 5 דקות כל אחד, ואחריו שוטף 3 ב- 100% אתנול, למשך 3 דקות. ודא פתרונות טריים משמשים בכל שלב.
    2. לשטוף שקופיות במי ברז עבור s 30 – 60.
    3. הסר את המים העודפים על-ידי בעדינות הקשה בתחתית השקופיות על מגבת נייר. הכתם עם Haematoxylin מסוננים במשך 3 דקות ודא סעיפים מכוסים במידה מספקת הפתרון.
    4. לשטוף שקופיות תחת ברז מים זורמים עד המים זורמים ברורה.
    5. טובלים שקופיות במי ברז של סקוט עבור s 8-10. אל תחשוף את השקופיות הפתרון יותר מ- 10 s כמו זה יגרום כתמים כהים, אינטנסיביים. ניתן להציג מכתים סעיפים תחת מיקרוסקופ. צביעת יעיל בשלב זה תגרום צבע "מותק כחול".
      הערה: להכין את מי הברז של סקוט על ידי המסת דור 2 של נתרן מימן פחמתי (NaHCO3), 20 גרם של מגנזיום סולפט (MgSO4) ב 1 ליטר של מים מזוקקים.
    6. לשטוף שקופיות במי ברז עבור s 30 – 60.
    7. להסיר את המים העודפים כמתואר בשלב 3 ולאחר מכן כתם עם % 1 מסוננים אאוזין מימית למשך 3 דקות.
    8. לשטוף שקופיות תחת ברז מים זורמים עד המים זורמים ברורה.
      הערה: צביעת יכול להיות מוערך באמצעות מיקרוסקופ אור. אם צביעת כהה מדי, שקופיות יכול להיות מיובש אתנול 100% למשך יותר הזמן שצוין. אם נדרשת כתמים כהים, שקופיות יכול להיות מוכתם אאוזין למשך 1-2 דקות יותר, לפני שממשיכים לשלבים הבאים.
    9. מייבשים השקופיות בעזרת מנקי 3 100% אתנול ל 30 s כל אחד, ואחריו 3 שוטף של קסילן למשך 2 דקות. ודא פתרונות טריים משמשים בכל שלב.
    10. הר שקופיות עם הרכבה בינונית. להוסיף טיפה של הרכבה בינונית במרכז coverslip נקי לפני בעדינות הצבת שקופית למעלה עם מקטעים פונה כלפי מטה.
      הערה: לא לייבש שקופיות לפני כיסוי גולשות.
    11. במקום שקופיות על משטח שטוח, לאפשר לאוויר יבש. שקופיות יכולים גם להיות מיובש בשכונה fume כדי להאיץ את זמן ייבוש.
  5. צביעת Giemsa של רקמות הקיבה
    1. Dewax השקופיות בעזרת מנקי 2 של histolene עבור 5 דקות כל אחד, 2 שוטף של אתנול 100% למשך 3 דקות ולאחר מכן שטיפה סופי ב-70% אתנול במשך 3 דקות ודא פתרונות טריים משמשים עבור כל כביסה.
    2. לשטוף שקופיות במי ברז עבור s 30 – 60.
    3. הכן Giemsa פתרון על ידי ערבוב גימזה 20% 80% מזוקק במים. כתם שקופיות עם פתרון Giemsa 1 h.
    4. המקום שקופיות ב- 100 מ של מים מזוקקים המכילים 3-4 טיפות של חומצה אצטית עבור s 2-3.
      הערה: פתרון יש לערבב היטב לפני השימוש. בשלב זה, שקופיות אמור להופיע בצבע תכלת.
    5. לשטוף את השקופיות אתנול 96% ל 30 s.
    6. רחץ בשקופיות 3 אמבטיות של אלכוהול איזופרופיל למשך 2 דקות כל אחד, ואחריו 3 מרחצאות histolene למשך 2 דקות. השתמש טריים אלכוהול איזופרופיל histolene עבור כל כביסה.
    7. Coverslip שקופיות הרכבה בינונית, כפי שהוסבר קודם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטת gavage דרך הפה כדי להשיג זיהום intragastric עם ה פילורי או ה חתול עכבר מאתר דגמים (איור 1). לאחר המתת חסד, קיבות הוסר, שקל, מחולק ל 2 חצאים שווים הכוללת את antrum, הגוף ואזורים שאינם הבלוטות של רקמות הקיבה (איור 2). האזור הלא-הבלוטות מוסר לפני ביצוע כל הבדיקות.

קולוניזציה מוצלחת של בעלי חיים בדרך כלל אושר על ידי ביצוע קיימא סומכים ח פילורי-נגוע homogenates קיבה ולאחר מכן ספירת מושבות בו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מודל העכבר ויוו זיהום הליקובקטר . השלבים הקריטיים של ההליך הם: 1) הכנת הליקובקטר inocula המכיל חיידקים קיימא תאי; 2) משלוח של המספרים המתאימים של חיידקים העכבר באמצעות intragastric gavage; 3) גילוי של זיהום חיידקי המושבה סופר ו/או PCR; . ו-4) עיבוד של רקמות הקיבה כדי לאפשר את ההערכה של histopathology ב נגוע בטנם. הצעות נוספות עבור שינויים, שיקולים טכניים ולפתרון נדונים להלן.

השיטה של גידול spp. הליקובקטר באמצעות אגר דם בסיס מס ' 2 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים רוצה להודות גב' א דה פאולי, גב' ג'ורג'י. ריי מקאן לקבלת סיוע טכני. המחברים להכיר השימוש במתקני וסיוע טכני של פלטפורמה היסטולוגיה מונש, המחלקה של האנטומיה, ביולוגיה התפתחותית, אוניברסיטת מונש. המעבדה נתמך על ידי מימון הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) רוזה לוקסמבורג (APP1079930, APP1107930). רוזה לוקסמבורג נתמך על ידי מלגת מחקר בכיר מ NHMRC (APP1079904). KD ו- MC שניהם נתמכים על ידי מונש מלגות לתואר שני. KD נתמך גם על ידי המרכז מולדת חסינות, זיהומיות מחלות, מכון הדסון למחקר רפואי, בעוד MC יש מלגת לתארים מתקדמים הבינלאומי מן הפקולטה לרפואה, לסיעוד למדעי הבריאות, אוניברסיטת מונש. מחקר על הדסון המכון של המחקר הרפואי נתמך על ידי תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<ריאגנטים בקטריולוגיים חזקים>
אגר דם אוקסואיד מס' 2תרמו פישר CM0271B מדעייש להמיס במים נטולי ניזון לפני עיקור
פרימיום דפיברין דם סוסאוסטרלי אתי ביולוגיPDHB100
Bacto Brain Heart Infusion BrothBD Bioscience237500להמיס במים נטולי ניון לפני העיקור
חבילות גז CampyGenThermo Fischer ScientificCN0035A/CN0025A
היסטולוגי ריאגנטים
פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%סיגמא אולדריץ'HT501128
אלכוהול אבסולוט, 100%ChemSupplyAL048-20L-P
איזופרופנול (2-פרופנול)Merck100995
קסילן (ללא גופרית)ChemSupplyXT003-20L
המטוקסיליןענברScientific MH-1Lלפני השימוש מסנן
Eosin, Aqueous StainAmber ScientificEOCA-1Lלפני השימוש
Wright-Giemsa Stain, שונהSigma AldrichWG80-2.5Lלדלל לפני השימוש (20% Giemsa, 80% מים נטולי יונים)
היסטולןGrale Scientific11031/5
DPX הרכבה בינוניתVWR1.00579.0500
<חזק>ריאגנטים לביולוגיה מולקולרית
קיוביט dsDNA BR ערכת בדיקהתרמו פישר מדעיQ32850
אוליגונוקלאוטידיםסיגמא אולדריץ'טמפרטורת החישול של ureB פריימרים ששימשו במחקר זה היא 61 מעלות; ערכת C
GoTaq Flexi DNA PolymerasePromegaM8291כוללת 10x מאגר PCR ומגנזיום כלוריד
dNTPsBiolineBIO-39028יש לדלל ל-10 מ"מ במים סטריליים ללא נוקלאז לפני השימוש
בדרגה מולקולרית אגרוזביוליןBIO-41025
נתרן מימן קרבונטUnivar (Ajax Fine Chemicals)A475-500G
מגנזיום סולפט הפטהידראטChem-SupplyMA048-500G
<חזק>אנטיביוטיקה
ונקומיציןסיגמא אולדריץ'V2002-1Gמתמוסס במים נטולי יונים
פולימיקסין Bסיגמא אולדריץ'P4932-5MUמתמוסס במים נטולי יונים
Trimethoprim (≥ 98% HPLC)Sigma AldrichT7883מתמוסס ב-100% (אבסולוטי) אתנול
אמפוטריציןאמרסקו (אסטרלי סיינטיפיק)E437-100MGמתמוסס במים נטולי יונים
Bacitracin מ-Bacillus licheniformisSigma AldrichB0125מתמוסס במים נטולי יונים
חומצה NaladixicSigma AldrichN8878מתמוסס במים נטולי יונים
<ריאגנטים חזקים>אחרים
מתוקסיפלורן (Pentrhox)התפתחויות רפואיות בינלאומיותלא ישים
פרפלסט שעוות פרפלסטפלוס, Leica Biosystems39601006
<חזק>ציוד וכלי פלסטיק
אוקסואיד צנצנות אנאירוביותתרמו פישר סיינטיפיקHP0011 / HP0031
COPAN Pasteur PipettesInterpath Services200CS01
Eppendorf 5810R צנטריפוגהלאסוף כדורי חיידקים על ידי צנטריפוגה ב -2,200 סל"ד למשך 10 דקות ב -4 מעלות; C
23 גרם מחט גלישה מדויקתBD Bioscience301805
Parafilm MBemis, VWRPM996
Portex צינורות פוליאתן עדיניםSmiths Medical800/100/200
צנתרי הזנה מפלסטיקInstech  מעבדותFTP20-30
1 מ"ל טוברקולין לואר להחליק מזרקים חד פעמייםBD Bioscience302100
מיקרופסטל אפנדורף לצינורות 1.2 - 2 מ"לפוליפרופילן הניתנים לחיטויסיגמא אולדריץ'Z317314
GentleMACs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235השתמש בתוכניות gentleMACS מוגדרות מראש לרקמת קיבה של עכבר
M Tubes (כובע כתום)Miltenyi Biotec30-093-236
Qubit FluorometerThermo Fischer ScientificQ33216
לולאת פלסטיק סטריליתLabServLBSLP7202
צלחת קרה, Leica EG1160 מערכת הטבעהLeica Biosystemsלא ישים
מערכת תבניות בסיס רקמה-טק, תבנית בסיס 38 x 25 x 6סאקורה, אלפן אן דן ריין4124
Tissue-Tek III Uni-Casette SystemSakura, Alphen aan den Rijn4170
Microtome, Leica RM2235Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus שקופיות זכוכיתMenzel Glaser, Thermo Fischer Scientific4951PLUS4
בסיס מפוגל מסנן של מאייר עלי המשמשים להומוגניזציה של הקיבה

מקורות

  1. Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, Suppl 1. 1-9 (2011).
  2. Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
  3. Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
  4. Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
  5. Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
  6. O'Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
  7. Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
  8. Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
  9. Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
  10. Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
  11. Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
  12. Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
  13. Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
  14. Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
  15. Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
  16. Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
  17. Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 8, Unit8B 1 (2012).
  18. Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
  19. Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181(2012).
  20. Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
  21. Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
  22. Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
  23. Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9(2015).
  24. Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
  25. Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396(2009).
  26. Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
  27. McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
  28. Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
  29. Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
  30. Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
  31. Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Helicobacter pyloriWarthin Starry
העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.