Method Article

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

DOI:

10.3791/57020

⸱

May 11th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקיקים דמויי וירוס (האח מים) שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות זיהוי וטיפול במחלות שונות. יישום זה מסתמך על ההנדסה הגנטית, הרכבה עצמית, ציסטאין ההטיה כדי למלא את היישום פילוח הגידול של האח מים רקומביננטי. לעומת גנטי מציע שינוי לבד, כימיה ההטיה של פפטידים זרים כדי האח מים משמעותי יתרון משום שהיא מאפשרת מגוון רחב של גופים, כגון peptides סינתטי או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים בצורה מווסתת ו גמיש ללא שינוי של מכלול האח מים.

. הנה, נדגים כיצד להשתמש את הפטיטיס E וירוס ננו-חלקיק (HEVNP), modularized theranostic קפסולה, כנשא משלוח רב תכליתיים. פונקציות של HEVNPs כוללים פילוח רקמות, הדמיה ומסירת טיפולית. בהתבסס על המחקר המבני ומבוססת של HEVNP, משקעי מבנית עצמאית, השטח החשופים נבחרו עבור החלפת ציסטאין כאתרי ההטיה לקבוצות מקושרים maleimide כימי באמצעות קישורים תיול-סלקטיבית. אחד מסוים ציסטאין-השתנה HEVNP (תחליף Cys של אספרגין-573 aa (HEVNP - 573C)) היה מצומדת השד סרטן תאים ספציפיים ליגנד, LXY30 ומוענקת -סגול (ניר) זריחה צבען (Cy5.5), עיבוד של הגידול, ממוקדות HEVNPs כמו קפסולות אבחון יעיל (LXY30-HEVNP-Cy5.5). אסטרטגיות הנדסיות דומה יכול להיות מועסק עם שאר מכלולי macromolecular עם הבראבה ידועים לחקור יישומים פוטנציאליים משלוח theranostic.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של וקטורים בגודל ננו במשלוח איבחוניות, המכונה nanotheranostics, השתנתה הרבה בתחום הביו-רפואי מן הטיפולים כללית לקראת משלוח ממוקד1 משלוח nanotheranostic יישוב משתלב בגודל ננו וקטורים (חלקיקים) עם מולקולות theranostic לכוון stably theranostic מולקולות ספציפיות רקמה חולה או מסלול ביוכימי2,3,4 . ננו-רפואה הגיע לחזית של משלוח ממוקד כי חלקיקים בגודל אופטימלי יש את היכולת לייצב את זרימת הדם של מולקולות theranostic, באופן סלקטיבי היעד מולקולות על פני התא המוצג לרקמות החולות. פלטפורמות nanotheranostic רבות עדיין סובלים ספיגת תא פסיבי, השפלה טרום בוגרת, ר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HEVNP ייצור בתאי חרקים

הערה: כל הפעולות הבאות צריכה להתבצע בשכונה התרבות תאים. מתייחסים לפרסום הקודם שלנו מפורט יותר HEVNP ייצור הליכים11.

  1. תרבות Sf9 בתאי חרקים תא מדיה (ראה טבלה של חומרים) 50-75% למפגש ב- 6-ובכן צלחות.
  2. באמצעות תא חרקים ריאגנטים תרביות תאים על פי הפרוטוקולים של היצרן, transfect Bacmids המכיל ORF2 HEVNP - 573 C לתאים Sf99 כדי לייצר baculovirus רקומביננטי. דגירה התאים transfected ב 27 מעלות צלזיוס במשך 3-6 ימים, בהתאם הכדאיות של תאים.
  3. לאסוף תגובת שיקוע ב- 3-6 ימים לאחר הפגיעה (לאחר התאים transfected הם lysed עקב זיהום baculovirus) ככל P0 baculovirus מניו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דומה HEV-האח מים, Cys כל ששינה HEVNPs הנוצרת capsids icosahedral מסיסים, ולא צבורים בתמיסה במהלך הייצור או טיהור. לפני ואחרי נטיה צעד אחר צעד maleimide-ביוטין, כל אחד Cys שונה HEVNPs היו להבחין מגניחותיה HEV-האח מים בתוך הכתם שלילי EM (איור 2). Maleimide-ביוטין יעילות ההטיה ל Cys ששונה HEVNPs נבחנה לראשונה עם סופג המערבי דרך איגוד chemiluminescent streptavidin. בעקבות נטיה maleimide-ביוטין, Cys ששינה HEVNPs מוצגים streptavidin מחייב אותות (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניגוד ההליך זמן רב הנדסה גנטית, אשר בדרך כלל לוקח שבועות, כאן אנחנו להדגים שני שלבים פשוטים והליכי צעד אחד ההטיה כימי, אשר יכולה להסתיים בתוך 3 ימים, של הוספת הסרטן מיקוד ליגנד ו/או קרינה פלואורסצנטית צבע זיהוי לאתרים Cys/ליס של HEVNPs. ניתן להשתמש בטכניקה המסך עבור היעד ליגנד הטוב ביותר מתוך מאגר של מועמדים, ובכך מנצל השירותים סינתזה של מולקולה פפטיד זמין/קטן במועד סביר ועלות משלוח.

בניגוד המסורתי הנדסה גנטית, אשר תוכל רק להכניס את polypeptides לחלבונים עניין, הבניין כימי יכול להתחבר חומרים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לאשר חסות המימון כדי RHC על ידי NIH להעניק #' s: AI095382, EB021230, CA198880, המכון הלאומי מזון, חקלאות, כמו גם את התוכנית מן המניין פינלנד.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
יחידות דיאליזה MINI, 10K MWCOThermo Fisher Scientific69572מיני יחידת דיאליזה
High Five CellsThermo Fisher ScientificB85502Tn5
תאים SF9 תאים Thermo Fisher Scientific11496015Sf9 תאי
Bac-to-Bac מערכת ביטוי BaculovirusThermo Fisher ScientificA11101, A11100מערכת ביטוי Baculovirus
Bac-to-Bac Baculovirus Expression SystemLife Technologies10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024Bacmid
ESF921 Insect Cell MediaExpression Systems LLC96-001-01חרק מדיה סלולרית
Cy5.5 NHS ester, 5 מ"גLumiprobe Corp27020Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalt Columns, 40K MWCO, 0.5 מ"לThermo Scientific87766עמוד התפלה
ספין MES הידראטסיגמא-אולדריץ' כימיקל ושות 'M8250-250GMES
צנטריפוגה אולטרה-צלולה Ultra-Clear צינורות אולטרה-צנטריפוגהBeckman Coulter, Incתלוי ברוטורצינור אולטרה צנטריפוגה
NuPage 4-12% ביס-טריס חלבון ג'לתרמו פישר מדעיNPO321BOXSDS חלבון ג'ל
Cellfectin II מגיבתרמו פישר מגיבטרנספקציה10362100
מדעי EMS זוהר מפרקאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעזוהר מפרק

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
  2. Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E Virus NanoparticlesChemical ConjugationSurface FunctionalizationMaleimide BiotinLXY30 LigandCy5 5 Fluorescent TagClick ChemistryTEM ImagingConfocal MicroscopySpin Desalting Column

Related Articles