Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Yoshiko Maida; Mami Yasukawa; Marco Ghilotti; Yoshinari Ando; Kenkichi Masutomi

doi:10.3791/57021

Research Article

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

DOI: 10.3791/57021

June 12, 2018

Yoshiko Maida*¹, Mami Yasukawa*¹, Marco Ghilotti¹, Yoshinari Ando¹, Kenkichi Masutomi¹

¹Division of Cancer Stem Cell,National Cancer Center Research Institute

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מסנתז לא רק דנ א telomeric, אלא גם כפול גדילי RNA באמצעות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA. כאן, אנו מתארים את assay שהוקם כדי לזהות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA של טרט אנדוגני.

Abstract

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) היא יחידה משנית קטליטי של טלומראז, זה מאריך טלומר באמצעות פעילות ה-DNA פולימראז תלוי-RNA. למרות טרט נקרא בשם של רוורס טרנסקריפטאז, ניתוח פילוגנטי מבניים של טרט מדגימים כי טרט חבר polymerases ימני, מתייחס תלויי-RNA RNA נגיפי polymerases (RdRPs) כמו גם נגיפי רוורס טרנסקריפטאז. אנחנו קודם כל לזהות RdRP הפעילות של טרט האדם שיוצר RNA משלים לעמוד על תבנית ללא קידוד RNA ותורמת RNA להשתיק בתאים סרטניים. כדי לנתח את הפעילות אנזימטי קאנונית הזו, אנחנו שפותחה RdRP assay עם טרט רקומביננטי בשנת 2009, לאחר מכן הוקמה במבחנה RdRP וזמינותו של טרט אנדוגני. כתב יד זה, אנו מתארים את השיטה השנייה. בקצרה, מכלולים חיסוניים טרט מבודד מן התאים, מודגרות עם תבנית ה-RNA ו- rNTPs כולל rNTP רדיואקטיבי עבור RdRP התגובה. כדי למנוע RNA חד-גדילי, התגובה מוצרים מטופלים עם RNase ואני המוצרים הסופיים הם ניתחו עם לזיהוי בג'ל. Radiolabeled מוצרים RdRP ניתן להבחין autoradiography לאחר חשיפה לילה.

Introduction

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מוכרת היטב יחידת משנה קטליטי של טלומראז, והארכת זה טלומר באמצעות רכיב ה-RNA טלומראז (TERC), תבנית ספציפית רנ א¹. למרות טרט polymerizes telomeric DNA כמרכיב של טלומראז, הניתוחים פילוגנטי מבניים מצביעים על כך טרט קשורה קשר הדוק עם תלויי-RNA RNA נגיפי polymerases (RdRPs), כמו גם נגיפי רוורס טרנסקריפטאז מניות תחומים עם אלה polymerases²^,³^,⁴. RdRP הוא האנזים מייצר גדיל RNA משלים לתבנית RNA. האנזים מקודד לא רק וירוסים אלא גם אורגניזמים מודל, כגון צמח, שמרים, תולעת, ותורם כפול גדילי סינתזה RNA מאת RdRP גנים ברמת השעתוק והתרגום post-transcriptional ג'ין להחרשת אלה אורגניזמים⁵^,⁶. למרות RdRP אנושי נעדר כבר הרבה זמן, מצאנו RdRP פעילות אנושית טרט ב 2009⁷.

תחילה אנחנו אישר RdRP הפעילות של טרט עם חלבון רקומביננטי⁷ולאחר מכן הוקמה assay רגיש במבחנה כדי לזהות RdRP פעילות של טרט אנדוגני⁸. . הנה, נדגים את במבחנה RdRP assay (IP-RdRP assay) עבור טרט אנדוגני. שיטה זו מתחיל עם immunoprecipitation (IP) של טרט אנדוגני, ואחריו במבחנה RdRP תגובה, שבו ribonucleotides רדיואקטיבי משולבים גדילי RNA המתהווה.

Protocol

1. מגיב ההתקנה

ריאגנטים המשמשים לסנכרון תא
1. כדי להפיק בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) המכילה תימידין 2.5 מ מ, לפזר 30.28 מ"ג של תימידין לכל 1 מ ל מים כיתה תרביות רקמה כדי להכין תימידין 125 מילימטר. Filtrate הפתרון עם יחידת מסנן 0.22 μm מזרק. להוסיף 1 מ"ל של תימידין הטרי 125 מילימטר לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) העובר סרום שור (FBS).
2. כדי ליצור DMEM המכיל 0.1 μg/mL של nocodazole, להמיס nocodazole ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) להכין 5 μg/μL nocodazole. להוסיף 1 µL של 5 µg / µL nocodazole לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS.
3. כדי ליצור DMEM המכיל 0.002% (vol/כרך) דימתיל סולפוקסיד, להוסיף 1 µL של דימתיל סולפוקסיד לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS.
ריאגנטים המשמש IP-RdRP assay
1. להכין פירוק מאגר ת 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.4) ו- 0.5% (vol/כרך) Nonidet P-40 (NP-40). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
2. להכין 5 x מאגר אצטט: 50 מ מ חומצה 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic (HEPES)-קו (pH 7.8), אצטט אשלגן 500 מ מ, 20 מ מ MgCl₂. חנות הכימית בטמפרטורת החדר.
3. הכנת מאגר אצטט x 1: 1 של מאגר לשטוף, 10% (vol/כרך) גליצרול, 0.1% (vol/כרך) טריטון x X-100 ו 0.06 פרוטאז מעכב קוקטייל, חומצה ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-חינם. להכין מאגר שטיפת 1 ביום של שימוש או יום לפני השימוש. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
4. להכין AGC פתרון: 1-מאגר אצטט, 10% (vol/כרך) גליצרול ו- 0.02% (wt/כרך) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonat (בחורים). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
5. כדי ליצור פתרון AGC המכיל 2 מ מ CaCl₂, להוסיף 100 µL של 1 מ' CaCl₂ לכל 50 מ של קובי פתרון. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
6. כדי ליצור פתרון AGC המכיל 3 מ מ bis אתילן גליקול (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (EGTA), להוסיף 375 µL של 0.4 מ' EGTA (pH 7.5) לכל 50 מ של קובי פתרון. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
7. להכין שטיפת מאגר x 2: 1 אצטט מאגר בחורים 0.02% (wt/כרך). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
8. להכין פתרון HMD: 0.2 מ' HEPES-קו (pH 7.8), 40 מ מ MgCl₂ ו- 2 מ מ dithiothreitol (DTT). חנות הכימית ב-20 ° C.
  הערה: פתרון HMD צריך להתחדש לפחות שלושה חודשים.
9. להכין 2 x מאגר Proteinase K: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.6), EDTA 20 מ מ ו- 1% (wt/כרך) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות). חנות הכימית ב-20 ° C.
10. להכין 2 x טעינת מאגר: 95% (vol/כרך) formamide, EDTA 20 מ מ ו- 1% (wt/כרך) ג כתום לאחסן הכימית ב-20 ° C.

2. הכנת הלה תאים

הערה: להכין הלה תאים מסונכרן mitotic שלב (מניפולציות) או חלוקת באופן אסינכרוני (unmanipulated). התרבות התאים בנוכחות 5% CO₂ ב 37 º C.

סינכרון של הלה בתאים מיטוזה
1. צלחת עונה 1 פרק 10⁶ תאים הלה עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS בצלחת תרבות 10 ס מ.
2. יומיים לאחר ציפוי, החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM המכילה תימידין 2.5 מ"מ ו- 10% (vol/כרך) FBS. התרבות התאים במשך 24 שעות ביממה.
3. רוחצים את התאים שלוש פעמים עם 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) (-), את התרבות התאים עם 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% (vol/כרך) FBS במשך 6 שעות.
4. החלף את המדיום 10 מ"ל של DMEM המכילה 0.1 µg/mL של nocodazole ו- 10% (vol/כרך) FBS, התרבות התאים עבור 14 h.
5. לנער את המנה תרבות בעדינות, ולאחזר את תגובת שיקוע המכילות את התאים mitotic מנותקת. לספור את התא עבור IP-RdRP וזמינותו.
6. Centrifuge הדגימה ב 490 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
  הערה: בגדר תא שניתן לאחסן ב- 80 ° c
הכנה של תאים הלה unmanipulated
1. צלחת עונה 1 פרק 10⁶ תאים הלה עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS בצלחת תרבות 10 ס מ.
2. יומיים לאחר ציפוי, החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% (vol/כרך) FBS. התרבות התאים אחר 30 אבני.
3. החלף את המדיום 10 מ"ל של DMEM המכילה 0.002% (vol/כרך) דימתיל סולפוקסיד ו- 10% (vol/כרך) FBS, התרבות התאים עבור 14 h.
4. לאסוף את התאים על ידי trypsinization באמצעות 0.7 מ של טריפסין (2.5 g/L) המכיל 1 מ מ EDTA. לספור את התא עבור IP-RdRP וזמינותו.
5. Centrifuge הדגימה ב 490 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
  הערה: בגדר תא שניתן לאחסן ב- 80 ° c

3. ה-IP-RdRP Assay

חלבון A-agarose חרוז הכנה
1. העבר 1 מ"ל (מיטה נפח 500 µL) של זיקה שרף צינור microcentrifuge 1.5 mL. צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
2. µL 800 פירוק מאגר א להוסיף החרוזים ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים (סה כ שלושה שוטף).
3. להוסיף µL 800 פירוק מאגר של החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. לסובב את הצינור למשך הלילה (או לפחות 4 שעות) ב 4 ° C-מטרף רוטרי.
4. Centrifuge את הצינור ב x 800 גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
5. להוסיף 500 µL פירוק מאגר של החרוזים ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. לאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס.
הכנת תא lysate
1. (אופציונלי) אם התאים מוקפאים בשלב 2, המקום, להפשיר את התאים קפוא בקרח עד התאים הופכים רופף.
2. לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל ל- PBS (-). Centrifuge הדגימה ב x 1,450 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
3. Lyse התאים באמצעות פירוק כקרח מאגר (mL 1 פירוק מאגר A לכל עונה 1 פרק 10⁷ של התאים) על ידי pipetting עדין.
4. Sonicate המדגם צינור 1.5 מ עם התנאים הבאים; הגברה של sonicator ב- 25%, וכל sonicate 10 s.
5. Centrifuge הדגימה ב x 20,400 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
6. לאסוף את תגובת שיקוע. העברת 1 מ"ל כל של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL.
  התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.
Immunoprecipitation
1. מראש נקה את lysate מהשלב 3.2.6 על-ידי הוספת µL 40 (חרוז נפח 20 µL) של חלבון prewashed A-agarose חרוזים לכל 1 מיליליטר lysate. מערבבים היטב בעזרת היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים ולסובב את הדגימה למשך 30 דקות ב 4 º c
2. Centrifuge הדגימה ב x 13,000 g עבור 1 דקות ב 4 ° C, ולשחזר את תגובת שיקוע.
3. להוסיף 40 µL (מיטה נפח 20 µL) של חלבון prewashed A-agarose חרוזים, 10 µg של נוגדנים נגד טרט (שיבוט: 10E9-2)⁸ לתוך מאושר מראש lysate. לערבב היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים, לסובב את הדגימה ב 4 ° C בלילה.
4. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.
5. לשטוף את החרוזים עם שטיפת מאגר 1: להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר 1 החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, וכן לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שלוש פעמים נוספות.
6. לשטוף את החרוזים פעם עם AGC לאודנום מ מ 2 CaCl₂: להוסיף 1 מ"ל של קובי, לאודנום מ"מ 2 CaCl₂עד החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.
7. להתייחס את החרוזים עם נוקלאז Micrococcal (MNase): להכין לתערובת התגובה MNase המתוארות בטבלה 1. Resuspend את החרוזים ב- 60 µL של תערובת התגובה MNase על ידי pipetting עדין. נתנער המדגם בעדינות (20 עד 25 סל ד) מסתובב של פטיפון של מטרף השוכן על מוניטורים מסוג Peltier למשך 15 דקות ב 25 º C.
  הערה: חשוב מאוד להשתמש של שייקר גלית ולעקוב בקפדנות את המהירות המותרת בשלב זה. סוג אחר של והאסטרטג, כגון מערבלים מסתובב, אינן מומלצות.
8. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.
9. לשטוף את החרוזים פעמיים עם פתרון AGC המכיל 3 מ מ EGTA: להוסיף 1 מ"ל של פתרון AGC המכיל 3 מ מ EGTA כדי החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת.
10. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם שטיפת מאגר 2: להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר 2החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. לשמור את החרוזים על הקרח תוך הגדרת RdRP התגובה.
  התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.
RdRP התגובה
1. להכין תערובת התגובה RdRP צינור חדש כפי שמתואר בטבלה 2.
2. להוסיף 6 µL של α -³²P] UTP (3,000 Ci mmol) תערובת, לערבב היטב על ידי pipetting.
  הערה: ATP [α -³²P], [α -³²P] CTP או α -³²P] GTP יכול לשמש עבור התגובה במקום [α -³²P] UTP.
3. להוסיף 1 µL של תבנית ה-RNA (µg 1/µL) התערובת, לערבב היטב על ידי pipetting.
  הערה: כדי ליצור וזמינותו RdRP, התבנית RNA הבאים מומלץ: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' ⁹.
4. Resuspend את החרוזים עם 20 µL של תערובת התגובה RdRP מהשלב 3.4.3 על-ידי pipetting.
5. לנער את הדגימה בעדינות (20 עד 25 סל ד) ב מסתובב של פטיפון של מטרף בלב של מוניטורים מסוג peltier עבור 2 h ב- 32 מעלות צלזיוס.
6. להוסיף תערובת התגובה 5.4 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) ו- 45.4 µL 2 x Proteinase K המאגר. לערבב על ידי pipetting וללחוץ (20 עד 25 סל ד) הדגימה על מסתובב השוכן על מוניטורים מסוג Peltier למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
7. להוסיף 109.2 µL של מים נטולי RNase המדגם.
8. להוסיף 200 µL של חומצת פנול-כלורופורם המדגם. מערבבים היטב בעזרת מערבולת ולאחר מכן centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את פאזה מימית צינור חדש. חזור על שלב זה פעם אחת.
9. הוסף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט (ה-pH = 5.2), 4 µL של משקעים ושמני 250 µL של אתנול לשלב מימית. לנער את הצינור היטב לערבוב, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
10. לשטוף את גלולה עם 300 µL של אתנול (vol/כרך) 70% קר, המאוחסנים ב-20 ° C. Centrifuge הדגימה ב x 21,100 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
11. למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
  התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.
  הערה: בגדר מהשלב 3.4.11 שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים.
טיפול RNase
1. Resuspend בגדר של שלב µL 3.4.11 ב 20 RNase ללא מים.
2. להכין תערובת התגובה RNase צינור חדש כמפורט בטבלה3.
3. להוסיף µL 180 של תערובת התגובה RNase המדגם, וכן דגירה הצינור עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
4. להוסיף µL 2.3 למען חברה דמוקרטית 10% (vol/כרך) הדגימה, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.
5. להוסיף 2 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) הדגימה, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.
6. להוסיף µL 205 של חומצת פנול-כלורופורם המדגם. לערבב היטב על ידי מערבולת, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את פאזה מימית צינור חדש.
7. הוסף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2), 4 µL נושאת משקעים, 250 µL של אתנול לשלב מימית. לנער את הצינור היטב לערבוב, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
8. לשטוף את גלולה עם 300 µL של אתנול (vol/כרך) 70% קר, המאוחסנים ב-20 ° C. Centrifuge הדגימה ב x 21,100 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
9. למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
  הערה: בגדר מהשלב 3.5.9 שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים.
אלקטרופורזה בג'ל ו- autoradiography
1. Resuspend הדגימה עם µL 20 RNase ללא מים.
2. הוסף 20 µL של 2 x טעינת מאגר.
3. להרתיח המדגם 10 דקות ב 95 ° C. למחוץ את הדגימה על הקרח.
4. הפעל את הג'ל. במקרה גודל התבנית הוא nts 34 (ראה גם שלב 3.4.3), 7 מ' אוריאה - 10% ג'ל לזיהוי משמש denaturing בג'ל.
5. יבש את הג'ל עם ג'ל מייבש.
6. לחשוף את הסרט מיובשים-הג'ל בתוך קלטת רנטגן עם מסך המגביה ב-80 מעלות צלזיוס.

Representative Results

עם התבנית המומלצת RNA, מוצרים RdRP רדיואקטיבי הם נצפו בין 20-30 נוקלאוטידים (nt) באופן ספציפי בתאים הלה בשלב mitotic לאחר חשיפה לילה (איור 1 א'). בדרך כלל, עוצמת האות של המוצרים RdRP מדגים שתי הפסגות הממוקמים בסביבות 25 nt ו- 30 nt ב consonance עם התפלגות גודל של המוצרים מאושרות על ידי הדור הבא רצפי9. בניגוד mitotic תאים, הלה תאים ללא סינכרון להפגין כמעט היעדר nt 20 – 30 המוצרים רדיואקטיבי. אותות סגלגל, הממוקמות מתחת 20 nt כל הדגימות, הן נשתל לא ספציפית.

במקרה זה יש רק ~ 30 nt מוצר עם האות חלש בתאים הלה mitotic, הוא מציין כי התגובה RdRP לא עלו יפה. לדוגמה, אם MNase הטיפול מבוצע בערך, באופן בלתי הולם, עוצמת אות בהלה mitotic תאים יתקצר באופן משמעותי (איור 1B). RdRP התגובה הופיעה עם פתרון HMD הישן גם מפחית את המוצרים (איור 1C).

איור 1 : נציג RdRP מוצרים של טרט אנדוגני בתאים הלה mitotic. (א) שלוש תוצאות נציג של IP-RdRP וזמינותו בתאים הלה מטופלים עם nocodazole (מניפולציות) או דימתיל סולפוקסיד (unmanipulated). 34 מסונתז כימית nt RNA שימש כתבנית. (B) IP-RdRP assay בתאים הלה mitotic הופיעה עם טיפול MNase לא הולם. (ג) IP-RdRP assay בתאים הלה mitotic הופיעה עם פתרון HMD טריים או ישן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ריאגנטים	נפח
נוקלאז micrococcal, U 20/µL	1 ΜL
מאגר נוקלאז micrococcal, 10 x	8 ΜL
RNase ללא מים	51 ΜL

טבלה 1: MNase התגובה רכיב לערבב.

ריאגנטים	נפח
חברים, 0.07% (wt/כרך)	6 ΜL
פתרון HMD	2 ΜL
rATP, 80 מ מ	0.5 ΜL
rGTP, 8 מ מ	1 ΜL
rUTP, 0.4 מ מ	1 ΜL
rCTP, 8 מ מ	1 ΜL
RNase מעכב, U 40/µL	0.5 ΜL
RNase ללא מים	1 ΜL

טבלה 2: RdRP התגובה רכיב לערבב.

ריאגנטים	נפח
RNase אחד Ribonuclease, U 10/µL	0.2 ΜL
מאגר התגובה, 10 x	20 ΜL
RNase ללא מים	159.8 ΜL

טבלה 3: Ribonuclease התגובה רכיב לערבב.

Discussion

המחברים אין לחשוף.

Disclosures

Acknowledgements

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הפרויקט עבור פיתוח מחקר חדשני על ותרופות לסרטן (P-ישירות) (15cm0106102h0002, והספקה) לבין הפרוייקט לחקר הסרטן ואבולוציה טיפולית (P-צור) (16 ס"מ 01061150001, והספקה) מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED; קרן המדע טקדה (עיון); מענק של הקרן לחקר סרטן הנסיכה Takamatsu (13-24520, עיון); ו JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16K07133 (עיון).

Materials

פורממיד,

דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM)	Wako	044-29765
סרום בקר עוברי (FBS)	CORNING	35-010-CV
תמיסה מעורבת פניצילין-סטרפטומיצין	nacalai tesque	26253-84
תמיסת חומצה טריפסין-אתילנדיאמנטטראצטית (EDTA)	nacalai tesque	32777-44
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS(-))Wako		166-23555
ת'ימידין	נקלאי טסק	07147-61
Nocodazole	Sigma	M1404
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	נקלאי טסק	08904-85
נתרן כלורי	נקלאי טסק	31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	nacalai tesque	35434-21
חומצה	הידרוכלוריתנקלאי טסק	18321-05
Nonidet P-40 (NP-40)	נקלאי טסק	25223-04
פירס חלבון A פלוס אגרוז	תרמו סיינטיפיק	22812
2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל] חומצה אתנסולפונית (HEPES)	נקלאי טסק	17514-15
אשלגן הידרוקסיד	וואקו	168-21815
אשלגן אצטט	נקלאי טסק	28405-05
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2• 6H2O)	Wako	135-00165
גליצרול	נקלאי טסק	17045-65
פוליאוקסיאתילן (10) אתר אוקטילפניל (טריטון X-100)	Wako	169-21105
cOmplete, ללא EDTA	Roche Applied Science	11 873 580 001
סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2• 2H2O)	נקלאי טסק	06731-05
מיקרוקוק נוקלאז (MNase)	Takara Bio	2910A
אתילן גליקול ביס (b-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)	nacalai tesque	15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)	nacalai tesque	07957-64
Dithiothreitol (DTT)	nacalai tesque	14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100 מ"מ כל אחד	Promega	E6000
[a-³²P]UTP (3,000 ci/mmol)	PerkinElmer	NEG507H	השתמש ב-RI טרי לבדיקת
מעכב RNase	TOYOBO	SIN-201
Proteinase K	Takara	9033
חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 ( עם IAA, 125:24:1)	Life Technologies	AM9720
3 M נתרן אצטט	NIPPON GENE	316-90081
אתנול (99.5)	Nacalai tesque	14713-95
Dr. GenTLE Precipitation Carrier	Takara Bio	9094
RNase One Ribonuclease	Promega	M4265
נתרן דודציל סולפט (SDS)	nacalai טסק	02873-75
טק נקלאי	נטול יונים	16345-65
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)	נקלאי טסק	15130-95
אורנג' G	נקלאי טסק	25401-22
אינקובטור CO2	למשל, צנטריפוגה ASTEC	SCA-325DRS
	למשל, TOMY	EX-135	לשלב ב')
צנטריפוגה מיקרו בקירור	למשל, KUBOTA	3740	לשלב 6.2
סוניקטור	Qsonica	Q125	הגדר מיקרו-טיפ (#4422) על הסוניקטור, לשלב 6.4
צנטריפוגה מיקרו בקירור	למשל, TOMY	MX-305	לשלב 6.5
חממה מקוררת	למשל, Panasonic	MIR-154-PJ	הגדר שייקר סיבובי בפנים
שייקר סיבובי	למשל, TAITEC	RT-5
אינקובטור מקורר	למשל, TAITEC	BR-43FL	הגדר שייקר " מיני גל" בפנים, לשלב 7.7
מיני גל	כאחד	WEV-03	שייקר לשלבים 7.7, 8.5 ו-8.6
אינקובטור	למשל, TAITEC	HB-80	הגדר שייקר " מיני גל" בפנים, עבור שלב 8.5 ו-8.6
חממת בלוקים	למשל, ASTEC	BI-516S

References

Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434 (2006).
Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי