Method Article

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

DOI:

10.3791/57021

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Stem Cell, National Cancer Center Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מסנתז לא רק דנ א telomeric, אלא גם כפול גדילי RNA באמצעות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA. כאן, אנו מתארים את assay שהוקם כדי לזהות פעילות RNA פולימראז תלוי-RNA של טרט אנדוגני.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) היא יחידה משנית קטליטי של טלומראז, זה מאריך טלומר באמצעות פעילות ה-DNA פולימראז תלוי-RNA. למרות טרט נקרא בשם של רוורס טרנסקריפטאז, ניתוח פילוגנטי מבניים של טרט מדגימים כי טרט חבר polymerases ימני, מתייחס תלויי-RNA RNA נגיפי polymerases (RdRPs) כמו גם נגיפי רוורס טרנסקריפטאז. אנחנו קודם כל לזהות RdRP הפעילות של טרט האדם שיוצר RNA משלים לעמוד על תבנית ללא קידוד RNA ותורמת RNA להשתיק בתאים סרטניים. כדי לנתח את הפעילות אנזימטי קאנונית הזו, אנחנו שפותחה RdRP assay עם טרט רקומביננטי בשנת 2009, לאחר מכן הוקמה במבחנה RdRP וזמינותו של טרט אנדוגני. כתב יד זה, אנו מתארים את השיטה השנייה. בקצרה, מכלולים חיסוניים טרט מבודד מן התאים, מודגרות עם תבנית ה-RNA ו- rNTPs כולל rNTP רדיואקטיבי עבור RdRP התגובה. כדי למנוע RNA חד-גדילי, התגובה מוצרים מטופלים עם RNase ואני המוצרים הסופיים הם ניתחו עם לזיהוי בג'ל. Radiolabeled מוצרים RdRP ניתן להבחין autoradiography לאחר חשיפה לילה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טלומראז האנושי רוורס טרנסקריפטאז (טרט) מוכרת היטב יחידת משנה קטליטי של טלומראז, והארכת זה טלומר באמצעות רכיב ה-RNA טלומראז (TERC), תבנית ספציפית רנ א1. למרות טרט polymerizes telomeric DNA כמרכיב של טלומראז, הניתוחים פילוגנטי מבניים מצביעים על כך טרט קשורה קשר הדוק עם תלויי-RNA RNA נגיפי polymerases (RdRPs), כמו גם נגיפי רוורס טרנסקריפטאז מניות תחומים עם אלה polymerases2,3,4. RdRP הוא האנזים מייצר גדיל RNA משלים לתבנית RNA. האנזים מקודד לא רק וירוסים אלא גם אורגניזמים מודל, כגון צמח, שמרים, תולעת, ותורם כפול גדילי סינתזה RNA מאת RdRP גנים ברמת השעתוק והתרגום post-transcriptional ג'ין להחרשת אלה אורגניזמים5,6 . למרות RdRP אנושי נעדר כבר הרבה זמן, מצאנו RdRP פעילות אנושית טרט ב 20097.

תחילה אנחנו אישר RdRP הפעילות של טרט עם חלבון רקומביננטי7ולאחר מכן הוקמה assay רגיש במבחנה כדי לזהות RdRP פעילות של טרט אנדוגני8. . הנה, נדגים את במבחנה RdRP assay (IP-RdRP assay) עבור טרט אנדוגני. שיטה זו מתחיל עם immunoprecipitation (IP) של טרט אנדוגני, ואחריו במבחנה RdRP תגובה, שבו ribonucleotides רדיואקטיבי משולבים גדילי RNA המתהווה.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מגיב ההתקנה

  1. ריאגנטים המשמשים לסנכרון תא
    1. כדי להפיק בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) המכילה תימידין 2.5 מ מ, לפזר 30.28 מ"ג של תימידין לכל 1 מ ל מים כיתה תרביות רקמה כדי להכין תימידין 125 מילימטר. Filtrate הפתרון עם יחידת מסנן 0.22 μm מזרק. להוסיף 1 מ"ל של תימידין הטרי 125 מילימטר לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) העובר סרום שור (FBS).
    2. כדי ליצור DMEM המכיל 0.1 μg/mL של nocodazole, להמיס nocodazole ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) להכין 5 μg/μL nocodazole. להוסיף 1 µL של 5 µg / µL nocodazole לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS.
    3. כדי ליצור DMEM המכיל 0.002% (vol/כרך) דימתיל סולפוקסיד, להוסיף 1 µL של דימתיל סולפוקסיד לכל 50 מ של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS.
  2. ריאגנטים המשמש IP-RdRP assay
    1. להכין פירוק מאגר ת 150 מ"מ NaCl, 20 מ"מ טריס-HCl (pH 7.4) ו- 0.5% (vol/כרך) Nonidet P-40 (NP-40). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
    2. להכין 5 x מאגר אצטט: 50 מ מ חומצה 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic (HEPES)-קו (pH 7.8), אצטט אשלגן 500 מ מ, 20 מ מ MgCl2. חנות הכימית בטמפרטורת החדר.
    3. הכנת מאגר אצטט x 1: 1 של מאגר לשטוף, 10% (vol/כרך) גליצרול, 0.1% (vol/כרך) טריטון x X-100 ו 0.06 פרוטאז מעכב קוקטייל, חומצה ethylenediamenetetraacetic (EDTA)-חינם. להכין מאגר שטיפת 1 ביום של שימוש או יום לפני השימוש. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
    4. להכין AGC פתרון: 1-מאגר אצטט, 10% (vol/כרך) גליצרול ו- 0.02% (wt/כרך) 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonat (בחורים). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
    5. כדי ליצור פתרון AGC המכיל 2 מ מ CaCl2, להוסיף 100 µL של 1 מ' CaCl2 לכל 50 מ של קובי פתרון. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
    6. כדי ליצור פתרון AGC המכיל 3 מ מ bis אתילן גליקול (b-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (EGTA), להוסיף 375 µL של 0.4 מ' EGTA (pH 7.5) לכל 50 מ של קובי פתרון. חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
    7. להכין שטיפת מאגר x 2: 1 אצטט מאגר בחורים 0.02% (wt/כרך). חנות הכימית-4 מעלות צלזיוס.
    8. להכין פתרון HMD: 0.2 מ' HEPES-קו (pH 7.8), 40 מ מ MgCl2 ו- 2 מ מ dithiothreitol (DTT). חנות הכימית ב-20 ° C.
      הערה: פתרון HMD צריך להתחדש לפחות שלושה חודשים.
    9. להכין 2 x מאגר Proteinase K: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.6), EDTA 20 מ מ ו- 1% (wt/כרך) dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות). חנות הכימית ב-20 ° C.
    10. להכין 2 x טעינת מאגר: 95% (vol/כרך) formamide, EDTA 20 מ מ ו- 1% (wt/כרך) ג כתום לאחסן הכימית ב-20 ° C.

2. הכנת הלה תאים

הערה: להכין הלה תאים מסונכרן mitotic שלב (מניפולציות) או חלוקת באופן אסינכרוני (unmanipulated). התרבות התאים בנוכחות 5% CO2 ב 37 º C.

  1. סינכרון של הלה בתאים מיטוזה
    1. צלחת עונה 1 פרק 106 תאים הלה עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS בצלחת תרבות 10 ס מ.
    2. יומיים לאחר ציפוי, החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM המכילה תימידין 2.5 מ"מ ו- 10% (vol/כרך) FBS. התרבות התאים במשך 24 שעות ביממה.
    3. רוחצים את התאים שלוש פעמים עם 10 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) (-), את התרבות התאים עם 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% (vol/כרך) FBS במשך 6 שעות.
    4. החלף את המדיום 10 מ"ל של DMEM המכילה 0.1 µg/mL של nocodazole ו- 10% (vol/כרך) FBS, התרבות התאים עבור 14 h.
    5. לנער את המנה תרבות בעדינות, ולאחזר את תגובת שיקוע המכילות את התאים mitotic מנותקת. לספור את התא עבור IP-RdRP וזמינותו.
    6. Centrifuge הדגימה ב 490 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: בגדר תא שניתן לאחסן ב- 80 ° c
  2. הכנה של תאים הלה unmanipulated
    1. צלחת עונה 1 פרק 106 תאים הלה עם 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% (vol/כרך) FBS בצלחת תרבות 10 ס מ.
    2. יומיים לאחר ציפוי, החלף את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% (vol/כרך) FBS. התרבות התאים אחר 30 אבני.
    3. החלף את המדיום 10 מ"ל של DMEM המכילה 0.002% (vol/כרך) דימתיל סולפוקסיד ו- 10% (vol/כרך) FBS, התרבות התאים עבור 14 h.
    4. לאסוף את התאים על ידי trypsinization באמצעות 0.7 מ של טריפסין (2.5 g/L) המכיל 1 מ מ EDTA. לספור את התא עבור IP-RdRP וזמינותו.
    5. Centrifuge הדגימה ב 490 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: בגדר תא שניתן לאחסן ב- 80 ° c

3. ה-IP-RdRP Assay

  1. חלבון A-agarose חרוז הכנה
    1. העבר 1 מ"ל (מיטה נפח 500 µL) של זיקה שרף צינור microcentrifuge 1.5 mL. צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
    2. µL 800 פירוק מאגר א להוסיף החרוזים ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. צנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעמיים (סה כ שלושה שוטף).
    3. להוסיף µL 800 פירוק מאגר של החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. לסובב את הצינור למשך הלילה (או לפחות 4 שעות) ב 4 ° C-מטרף רוטרי.
    4. Centrifuge את הצינור ב x 800 גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
    5. להוסיף 500 µL פירוק מאגר של החרוזים ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. לאחסן את החרוזים על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת תא lysate
    1. (אופציונלי) אם התאים מוקפאים בשלב 2, המקום, להפשיר את התאים קפוא בקרח עד התאים הופכים רופף.
    2. לשטוף את התאים פעם אחת עם 10 מ"ל ל- PBS (-). Centrifuge הדגימה ב x 1,450 g למשך 5 דקות ב 4 ° C, ולמחוק את תגובת שיקוע.
    3. Lyse התאים באמצעות פירוק כקרח מאגר (mL 1 פירוק מאגר A לכל עונה 1 פרק 107 של התאים) על ידי pipetting עדין.
    4. Sonicate המדגם צינור 1.5 מ עם התנאים הבאים; הגברה של sonicator ב- 25%, וכל sonicate 10 s.
    5. Centrifuge הדגימה ב x 20,400 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    6. לאסוף את תגובת שיקוע. העברת 1 מ"ל כל של תגובת שיקוע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL.
      התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.
  3. Immunoprecipitation
    1. מראש נקה את lysate מהשלב 3.2.6 על-ידי הוספת µL 40 (חרוז נפח 20 µL) של חלבון prewashed A-agarose חרוזים לכל 1 מיליליטר lysate. מערבבים היטב בעזרת היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים ולסובב את הדגימה למשך 30 דקות ב 4 º c
    2. Centrifuge הדגימה ב x 13,000 g עבור 1 דקות ב 4 ° C, ולשחזר את תגובת שיקוע.
    3. להוסיף 40 µL (מיטה נפח 20 µL) של חלבון prewashed A-agarose חרוזים, 10 µg של נוגדנים נגד טרט (שיבוט: 10E9-2)8 לתוך מאושר מראש lysate. לערבב היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים, לסובב את הדגימה ב 4 ° C בלילה.
    4. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.
    5. לשטוף את החרוזים עם שטיפת מאגר 1: להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר 1 החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, וכן לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שלוש פעמים נוספות.
    6. לשטוף את החרוזים פעם עם AGC לאודנום מ מ 2 CaCl2: להוסיף 1 מ"ל של קובי, לאודנום מ"מ 2 CaCl2 עד החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.
    7. להתייחס את החרוזים עם נוקלאז Micrococcal (MNase): להכין לתערובת התגובה MNase המתוארות בטבלה 1. Resuspend את החרוזים ב- 60 µL של תערובת התגובה MNase על ידי pipetting עדין. נתנער המדגם בעדינות (20 עד 25 סל ד) מסתובב של פטיפון של מטרף השוכן על מוניטורים מסוג Peltier למשך 15 דקות ב 25 º C.
      הערה: חשוב מאוד להשתמש של שייקר גלית ולעקוב בקפדנות את המהירות המותרת בשלב זה. סוג אחר של והאסטרטג, כגון מערבלים מסתובב, אינן מומלצות.
    8. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע.
    9. לשטוף את החרוזים פעמיים עם פתרון AGC המכיל 3 מ מ EGTA: להוסיף 1 מ"ל של פתרון AGC המכיל 3 מ מ EGTA כדי החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פעם אחת.
    10. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם שטיפת מאגר 2: להוסיף 1 מ"ל של שטיפת מאגר 2החרוזים, לערבב היטב על ידי היפוך הצינור, לסובב את הדגימה עבור 5 דקות ב 4 º C. Centrifuge הדגימה ב x 3,300 g למשך דקות 0.5-4 ° C, ולהסיר את תגובת שיקוע. לשמור את החרוזים על הקרח תוך הגדרת RdRP התגובה.
      התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.
  4. RdRP התגובה
    1. להכין תערובת התגובה RdRP צינור חדש כפי שמתואר בטבלה 2.
    2. להוסיף 6 µL של α -32P] UTP (3,000 Ci mmol) תערובת, לערבב היטב על ידי pipetting.
      הערה: ATP [α -32P], [α -32P] CTP או α -32P] GTP יכול לשמש עבור התגובה במקום [α -32P] UTP.
    3. להוסיף 1 µL של תבנית ה-RNA (µg 1/µL) התערובת, לערבב היטב על ידי pipetting.
      הערה: כדי ליצור וזמינותו RdRP, התבנית RNA הבאים מומלץ: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.
    4. Resuspend את החרוזים עם 20 µL של תערובת התגובה RdRP מהשלב 3.4.3 על-ידי pipetting.
    5. לנער את הדגימה בעדינות (20 עד 25 סל ד) ב מסתובב של פטיפון של מטרף בלב של מוניטורים מסוג peltier עבור 2 h ב- 32 מעלות צלזיוס.
    6. להוסיף תערובת התגובה 5.4 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) ו- 45.4 µL 2 x Proteinase K המאגר. לערבב על ידי pipetting וללחוץ (20 עד 25 סל ד) הדגימה על מסתובב השוכן על מוניטורים מסוג Peltier למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    7. להוסיף 109.2 µL של מים נטולי RNase המדגם.
    8. להוסיף 200 µL של חומצת פנול-כלורופורם המדגם. מערבבים היטב בעזרת מערבולת ולאחר מכן centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את פאזה מימית צינור חדש. חזור על שלב זה פעם אחת.
    9. הוסף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט (ה-pH = 5.2), 4 µL של משקעים ושמני 250 µL של אתנול לשלב מימית. לנער את הצינור היטב לערבוב, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    10. לשטוף את גלולה עם 300 µL של אתנול (vol/כרך) 70% קר, המאוחסנים ב-20 ° C. Centrifuge הדגימה ב x 21,100 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    11. למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
      התראה: ביצוע כל ההליכים בתנאים ללא RNase.
      הערה: בגדר מהשלב 3.4.11 שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים.
  5. טיפול RNase
    1. Resuspend בגדר של שלב µL 3.4.11 ב 20 RNase ללא מים.
    2. להכין תערובת התגובה RNase צינור חדש כמפורט בטבלה3.
    3. להוסיף µL 180 של תערובת התגובה RNase המדגם, וכן דגירה הצינור עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף µL 2.3 למען חברה דמוקרטית 10% (vol/כרך) הדגימה, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.
    5. להוסיף 2 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) הדגימה, תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 º C.
    6. להוסיף µL 205 של חומצת פנול-כלורופורם המדגם. לערבב היטב על ידי מערבולת, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את פאזה מימית צינור חדש.
    7. הוסף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2), 4 µL נושאת משקעים, 250 µL של אתנול לשלב מימית. לנער את הצינור היטב לערבוב, ואז centrifuge את הדגימה ב x 21,100 g למשך 20 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.
    8. לשטוף את גלולה עם 300 µL של אתנול (vol/כרך) 70% קר, המאוחסנים ב-20 ° C. Centrifuge הדגימה ב x 21,100 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
    9. למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
      הערה: בגדר מהשלב 3.5.9 שניתן לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס לפחות 2 ימים.
  6. אלקטרופורזה בג'ל ו- autoradiography
    1. Resuspend הדגימה עם µL 20 RNase ללא מים.
    2. הוסף 20 µL של 2 x טעינת מאגר.
    3. להרתיח המדגם 10 דקות ב 95 ° C. למחוץ את הדגימה על הקרח.
    4. הפעל את הג'ל. במקרה גודל התבנית הוא nts 34 (ראה גם שלב 3.4.3), 7 מ' אוריאה - 10% ג'ל לזיהוי משמש denaturing בג'ל.
    5. יבש את הג'ל עם ג'ל מייבש.
    6. לחשוף את הסרט מיובשים-הג'ל בתוך קלטת רנטגן עם מסך המגביה ב-80 מעלות צלזיוס.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם התבנית המומלצת RNA, מוצרים RdRP רדיואקטיבי הם נצפו בין 20-30 נוקלאוטידים (nt) באופן ספציפי בתאים הלה בשלב mitotic לאחר חשיפה לילה (איור 1 א'). בדרך כלל, עוצמת האות של המוצרים RdRP מדגים שתי הפסגות הממוקמים בסביבות 25 nt ו- 30 nt ב consonance עם התפלגות גודל של המוצרים מאושרות על ידי הדור הבא רצפי9. בניגוד mitotic תאים, הלה תאים ללא סינכרון להפגין כמעט היעדר nt 20 – 30 המוצרים רדיואקטיבי. אותות סגלגל, הממוקמות מתחת 20 nt כל הדגימות, הן נשתל לא ספציפית.

במקרה זה יש רק ~ 30 nt מוצר עם האות חלש בתאים הלה mitotic, הוא מציין כי התגובה RdRP לא עלו יפה. לדוגמה, אם MNase הטיפול מבוצע בערך, באופן בלתי הולם, עוצמת אות בהלה mitotic תאים יתקצר באופן משמעותי (איור 1B). RdRP התגובה הופיעה עם פתרון HMD הישן גם מפחית את המוצרים (איור 1C).

figure-results-1
איור 1 : נציג RdRP מוצרים של טרט אנדוגני בתאים הלה mitotic. (א) שלוש תוצאות נציג של IP-RdRP וזמינותו בתאים הלה מטופלים עם nocodazole (מניפולציות) או דימתיל סולפוקסיד (unmanipulated). 34 מסונתז כימית nt RNA שימש כתבנית. (B) IP-RdRP assay בתאים הלה mitotic הופיעה עם טיפול MNase לא הולם. (ג) IP-RdRP assay בתאים הלה mitotic הופיעה עם פתרון HMD טריים או ישן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ריאגנטיםנפח
נוקלאז micrococcal, U 20/µL1 ΜL
מאגר נוקלאז micrococcal, 10 x8 ΜL
RNase ללא מים51 ΜL

טבלה 1: MNase התגובה רכיב לערבב.

ריאגנטיםנפח
חברים, 0.07% (wt/כרך)6 ΜL
פתרון HMD2 ΜL
rATP, 80 מ מ0.5 ΜL
rGTP, 8 מ מ1 ΜL
rUTP, 0.4 מ מ1 ΜL
rCTP, 8 מ מ1 ΜL
RNase מעכב, U 40/µL0.5 ΜL
RNase ללא מים1 ΜL

טבלה 2: RdRP התגובה רכיב לערבב.

ריאגנטיםנפח
RNase אחד Ribonuclease, U 10/µL0.2 ΜL
מאגר התגובה, 10 x20 ΜL
RNase ללא מים159.8 ΜL

טבלה 3: Ribonuclease התגובה רכיב לערבב.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IP-RdRP וזמינותו היא שיטה רגיש כדי לזהות RdRP הפעילות של טרט אנושי. חלבון טרט מתבטא מאוד mitotic תאים הלה, שבו טרט טפסים RdRP מורכבים8,9,10. הדבר מצביע על כי תאים הלה mitotic הם חומר אופטימלית כדי לזהות RdRP פעילות. ב פרוטוקול המתואר לעיל, תאים הלה mitotic ו בלתי-מסונכרנות כלולים חיובי, דוגמא שלילית, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 1A, RdRP assay מוצרים מהתבנית RNA המומלצת בתאים הלה mitotic להראות אותות רדיואקטיבי רחבה בין 20-30 nt. בנוסף הלה תאים, יש לבצע את הבדיקה עם סוגים שונים של שורות תאים, ואנו מצא כי ניתן לשנות את דפוס אות ב סוגי תאים שונים9: הופעה כלשהי אות חזק רק בסביבות 30 nt, הופעה כלשהי דפוס פעולה דומה עם הלה תאים. אנו אמורה גם לבצע את הבדיקה עם תבניות RNA חוץ 34 nt תבנית8, קצר, ארוך (~ 300 nt) RNAs עם רצפים שונים, והשיג בהצלחה RdRP מוצרים מתבניות אלה אם כי ייתכן עדיפות מסוימת. למשפט הראשון, עם זאת, אנו ממליצים להשתמש הלה תאים שלב mitotic ואת התבנית nt רנ א 34. RdRPs ליצור זוגיות גדילי RNA פריימר תלוית והן של פריימר תלויית האופן11. דיווחנו כי טרט המשמרת את המאפיין7,האנושי RdRP9; טרט מסנתז dsRNA מתבנית RNA עם מבנה 3'-foldback דרך הגב-לקרקע מנגנון7. עבור תבנית nt רנ א 34, טרט מסנתז גדילים משלימים ללא שימוש תחל9. במיוחד לזהות מוצרים RdRP מסונתז באופן שאינו תלוי-פריימר, קרי דה נובו מסונתז RNA מוצרים, [α -32P] NTP יכול להיות מוחלף עם [γ -32P] NTP ב התגובה RdRP9.

טיפול MNase של טרט מכלולים חיסוניים על חרוזים הוא שלב קריטי להשגת התוצאות הרצויות. אם הטיפול MNase מתבצע זמן רב מדי או ייבוש אינטנסיבי, המוצרים RdRP יופחת במידה ניכרת. כדי למנוע בעיות של כאלה, אנו ממליצים לפעול אך ורק לפי התקנון בקפידה. פתרון HMD הוא גורם קריטי נוסף להצלחה. אם אתה מוצא האותות חלשים מאוד, החלף את הפתרון HMD אחד מוכן לאחרונה.

לאורך כל הפרוטוקול, אחד צריך לקחת כדי למנוע זיהום RNase. Ribonuclease הטיפול צריכה להתבצע עם ציוד ייעודי. לאחר הדחת את Ribonuclease, אחד צריך לבטל עצות, צינורות עם RNase באופן מיידי, לחסל RNase עם פתרון מיוחדים (למשל RNase שקט) ושנה מטעי.

טרט אינטראקציה עם לא רק TERC אלא גם סוגים רבים של RNAs אנדוגני, דיווחנו חלק מהם7. שינוי ב- IP-RdRP וזמינותו, כגון וזמינותו IP-RdRP ללא טיפול MNase, יספקו רשימה מלאה של תבניות RNA אנדוגני עבור פעילות הקשורים טרט RdRP מדריך bioinformatic על תכונות רצף שלהם. אנחנו בהצלחה החלת פרוטוקול זה רקמות lysate. כי טרט מתבטאת במגוון של רקמות רגיל, הגידול, וזמינותו זה עשוי להיות שימושי לחקור קאנונית הפונקציה אנזימטי של טרט בן אנוש

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי הפרויקט עבור פיתוח מחקר חדשני על ותרופות לסרטן (P-ישירות) (15cm0106102h0002, והספקה) לבין הפרוייקט לחקר הסרטן ואבולוציה טיפולית (P-צור) (16 ס"מ 01061150001, והספקה) מן הסוכנות היפנית מחקר רפואי ופיתוח, AMED; קרן המדע טקדה (עיון); מענק של הקרן לחקר סרטן הנסיכה Takamatsu (13-24520, עיון); ו JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16K07133 (עיון).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דולבקו s שונה Eagle' s medium (DMEM)Wako044-29765
סרום בקר עוברי (FBS)CORNING35-010-CV
תמיסה מעורבת פניצילין-סטרפטומיציןnacalai tesque26253-84
תמיסת חומצה טריפסין-אתילנדיאמנטטראצטית (EDTA)nacalai tesque32777-44
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS(-))Wako166-23555
ת'ימידיןנקלאי טסק07147-61
NocodazoleSigmaM1404
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)נקלאי טסק08904-85
נתרן כלורינקלאי טסק31333-45
Tris(hydroxymethyl)aminomethanenacalai tesque35434-21
חומצההידרוכלוריתנקלאי טסק18321-05
Nonidet P-40 (NP-40)נקלאי טסק25223-04
פירס חלבון A פלוס אגרוזתרמו סיינטיפיק22812
2-[4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיניל] חומצה אתנסולפונית (HEPES)נקלאי טסק17514-15
אשלגן הידרוקסידוואקו168-21815
אשלגן אצטטנקלאי טסק28405-05
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2• 6H2O)Wako135-00165
גליצרולנקלאי טסק17045-65
פוליאוקסיאתילן (10) אתר אוקטילפניל (טריטון X-100)Wako169-21105
cOmplete, ללא EDTARoche Applied Science11 873 580 001
סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2• 2H2O)נקלאי טסק06731-05
מיקרוקוק נוקלאז (MNase)Takara Bio2910A
אתילן גליקול ביס (b-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)nacalai tesque15214-92
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)nacalai tesque07957-64
Dithiothreitol (DTT)nacalai tesque14128-91
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100 מ"מ כל אחדPromegaE6000
[a-32P]UTP (3,000 ci/mmol)PerkinElmerNEG507Hהשתמש ב-RI טרי לבדיקת
מעכב RNaseTOYOBOSIN-201
Proteinase KTakara9033
חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 ( עם IAA, 125:24:1)Life TechnologiesAM9720
3 M נתרן אצטטNIPPON GENE316-90081
אתנול (99.5)Nacalai tesque14713-95
Dr. GenTLE Precipitation CarrierTakara Bio9094
RNase One RibonucleasePromegaM4265
נתרן דודציל סולפט (SDS)nacalai טסק02873-75
טק נקלאינטול יונים16345-65
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית דיסודיום מלח דיהידראט (EDTA)נקלאי טסק15130-95
אורנג' Gנקלאי טסק25401-22
אינקובטור CO2למשל, צנטריפוגה ASTECSCA-325DRS
למשל, TOMYEX-135לשלב ב')
צנטריפוגה מיקרו בקירורלמשל, KUBOTA3740לשלב 6.2
סוניקטורQsonicaQ125הגדר מיקרו-טיפ (#4422) על הסוניקטור, לשלב 6.4
צנטריפוגה מיקרו בקירורלמשל, TOMYMX-305לשלב 6.5
חממה מקוררתלמשל, PanasonicMIR-154-PJהגדר שייקר סיבובי בפנים
שייקר סיבובילמשל, TAITECRT-5
אינקובטור מקורר למשל, TAITECBR-43FLהגדר שייקר " מיני גל" בפנים, לשלב 7.7
מיני גלכאחדWEV-03שייקר לשלבים 7.7, 8.5 ו-8.6
אינקובטורלמשל, TAITECHB-80הגדר שייקר " מיני גל" בפנים, עבור שלב 8.5 ו-8.6
חממת בלוקיםלמשל, ASTECBI-516S
פורממיד,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).">Martinez, P., Blasco, M. A. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).
  2. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).">Nakamura, T. M., et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Science. 277 (5328), 955-959 (1997).
  3. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).">Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT. Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).
  4. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).">Salgado, P. S., et al. The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription. PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).
  5. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).">Castel, S. E., Martienssen, R. A. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond. Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).
  6. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).">Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).
  7. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).">Maida, Y., et al. An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).
  8. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).">Maida, Y., et al. Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance. Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).
  9. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).">Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase. Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).
  10. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).">Okamoto, N., et al. Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).
  11. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).">van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization. J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA dependent RNA Polymerase ActivityHuman Telomerase Reverse TranscriptaseRdRP AssayTERT Immune Complex IsolationPolyacrylamide Gel ElectrophoresisAutoradiography DetectionRNase I TreatmentRadioactive rNTP IncubationProtein A agarose BeadsAnti human TERT Antibody

Related Articles