מאמר שיטה

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57061

⸱

9 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

במאמר זה

סיכום

הרחבת הקוד הגנטי מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל חלבון acetylation. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול נתיישב לנצל בטכניקה זו ליצירת homogeneously acetylated חלבונים באתרים ספציפיים בתאים Escherichia coli .

תקציר

Post-translational שינויים שמתרחשים עמדות מסוימות של חלבונים הוכחו תפקיד חשוב במגוון רחב של תהליכים תאיים. ביניהם, ליזין הפיך acetylation הוא אחד הנפוצים ביותר מבוזר בכל התחומים של החיים. למרות acetylome מסה ספקטרומטר המבוסס על מחקרים רבים שנעשו, נוספות אפיון של מטרות אלה בשם acetylation הוגבלה. סיבה אפשרית אחת היא כי קשה לייצר חלבונים acetylated גרידא-עמדות הרצוי על-ידי רוב הגישות הביוכימי קלאסי. כדי להתגבר על האתגר הזה, הטכניקה הרחבת הקוד הגנטי הוחל להשתמש הזוג של variant המעביר pyrrolysyl הנדסה-tRNA, שלה tRNA cognate ממינים Methanosarcinaceae , לכוון שיתוף cotranslational של acetyllysine באתר ספציפי בהחלבון של עניין. לאחר היישום הראשון במחקר של acetylation היסטון, גישה זו הנחתה את acetylation מחקרים על מגוון רחב של חלבונים. בעבודה זאת, הפגנו פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים site-specifically acetylated באמצעות החיידק דגם Escherichia coli כמארח. בנויים דהידרוגנאז שימש דוגמה הפגנה בעבודה זו.

מבוא

שינויים post-translational (PTMs) של חלבונים להתרחש לאחר תהליך התרגום, נובעים קוולנטיות תוספת של קבוצות פונקציונליות כדי שאריות חומצה אמינית, משחק תפקידים חשובים כמעט כל התהליכים הביולוגיים, כולל גנים תמלול תגובת המתח, התמיינות, חילוף החומרים1,2,3. נכון להיום, כ 400 ייחודי PTMs היה מזוהה4. הפרטים. של הגנום, את פרוטאום מוגבר במידה רבה על ידי חלבון PTMs, כפי שהם לווסת את פעילות החלבון ולוקליזציה, משפיע על האינטראקציה עם מולקולות אחרות כגון חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, cofactors5.

חלבון acetylation כבר בחוד החנית של מחקרים PTMs האחרון שני עשורים6,7,8,9,10,11,12. ליזין acetylation התגלה לראשונה בשינויים היסטוניים לפני יותר מ 50 שנה13,14, בחן היטב, וידוע להתקיים יותר מ-80 גורמי שעתוק regulators, חלבונים שונים15, 16,17. מחקרים על חלבון acetylation יש לא רק סיפק לנו הבנה עמוקה יותר של מנגנוני רגולציה שלה, אלא מונחה גם טיפולים עבור מספר מחלות שנגרמות על ידי לקוי acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. האמינו ליזין acetylation מסרטים פרוקריוטים, אך מחקרים שנעשו לאחרונה הראו acetylation חלבון זה גם ממלא את תפקידי המפתח בפיזיולוגיה חיידקיים, כולל כימוטקסיס, התנגדות חומצה, הפעלה של ייצוב פתוגניות ואיי התקפה אלימה אחרים הקשורים חלבונים24,25,26,27,28,29.

שיטה נפוץ לאפיין מבחינה ביוכימית ליזין acetylation משתמש מוטגנזה. גלוטמין משמש חיקוי של acetyllysine בשל גודל דומה קוטביות. ארגינין הוא מנוצל כמו חיקוי ליזין שאינם acetylated, מאז זה משמר את מטען חיובי בתנאים פיזיולוגיים אבל לא יכול להיות acetylated. עם זאת, שניהם מחקה אינם isosteres האמיתי, לא תמיד יניבו את התוצאות הצפויות30. הגישה קפדני ביותר היא לייצר חלבונים homogeneously acetylated-שאריות ליזין ספציפי, וזה קשה או בלתי אפשרי עבור שיטות הכי קלאסי בשל סטויכיומטריה נמוכה של ליזין acetylation הטבע7,11. האתגר הזה יש כבר נפתר על ידי האסטרטגיה הרחבת הקוד הגנטי, אשר מעסיקה של המעביר pyrrolysyl הנדסה-tRNA variant ממינים Methanosarcinaceae לחייב tRNAPyl עם acetyllysine, מנצל את המארח מכונות translational לדכא את UAG קודון סיום ב- mRNA, ומביאה שילוב של acetyllysine במצב מעוצב של חלבון המטרה31. לאחרונה, אנו יש אופטימיזציה מערכת זו של tRNA EF-Tu-איגוד משופרת32 , של acetyllysyl משודרג-סינתזת המעביר33. יתר על כן, אנו החלת מערכת זו התאגדות משופרת במחקרים acetylation של בנויים דהידרוגנאז34 / tyrosyl-סינתזת המעביר35. במסמך זה, נדגים את הפרוטוקול ליצירת חלבונים acetylated גרידא של שיבוט מולקולרי כדי זיהוי הביוכימי באמצעות בנויים דהידרוגנאז (MDH), אשר אנו חקרו בהרחבה כדוגמה כינוי רמז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מוטגנזה של הגן היעד

הערה: MDH מבוטא תחת T7 יזם ב וקטור pCDF-1 עם המקור CloDF13 ומספר עותק של 20-4034.

  1. להציג את אמבר stop codon במיקום 140 בגן מאת תחל (קדימה פריימר: GGTGTTTATGACתגAACAAACTGTTCGGCG הפוכה פריימר: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), בעקבות ההוראה של ערכת מוטגנזה.
  2. להגביר את פלסמיד תבנית המכילה את הגן של dehydratase פראי-סוג בנויים והוסף את המוטציה stop codon מאת התגובה פולימראז תגובת שרשרת (PCR). בתערובת התגובה, כוללים µL 12.5 של 2 X DNA פולימראז אנזים מיקס, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר לפנים, µL 1.25 של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, µL 1 של תבנית ה-DNA (20 ng/µL) (המכילים את הגן של פראי-סוג MDH פלסמידpCDF-1 ), ו- µL 9 של נוקלאז ללא מים.
    1. השתמש בפרמטרים התגובה PCR כדלקמן: Îàé דנטורציה ב 98 ° C ל 30 s; 25 מחזורי 10 s ב 98 ° C, 30 s-55 ° C ו- 3 דקות ב-72 מעלות; הרחבה הסופי ב-72 מעלות למשך 3 דקות. לאחר PCR, הוסף את החומר מוגבר ישירות לתערובת אנזימים קינאז-ליגאז-DpnI הערכה לשעה בטמפרטורת החדר במשך circularization והסרת תבנית.
      הערה: תערובת התגובה מכילה 1 µL של PCR המוצר, 5 µL 2 X תגובת מאגר, µL 1 של 10 מיקס אנזים X קינאז-ליגאז-DpnI 3 µL של נוקלאז ללא מים.
  3. להוסיף 5 µL של המיקס התגובה על הצינור של 25 µL הקרת המוסמכת e. coli DH5α תאים הערכה. בזהירות קפיצי צינור כדי לערבב, מניחים את התערובת על קרח דק 30 הלם חום התערובת ב 42 ° C s 30, ואת המקום על קרח במשך 5 דקות נוספות.
    1. פיפטה 600 µL של טמפרטורת החדר מרק סופר אופטימלית עם Catabolite מדיה הדיכוי (SOC) הערכה לתוך התערובת, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ברעידות-250 סל"ד, להפיץ µL 100 על צלחת אגר lysogeny מרק (ליברות) עם האנטיביוטיקה המתאימה , דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
  4. לבחור 4-6 מושבות יחיד לתוך המדיה LB טרי 6 מ עם האנטיביוטיקה המתאימה, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ברעידות-250 סל"ד. לחלץ פלסמידים מתרבות כל לילה על-ידי ערכת טיהור פלסמיד, בעקבות המדריך של היצרן ולאחר מכן שלח פלסמידים עבור רצפי DNA לפי הפרוטוקול של ספק השירות כדי לאשר את המוטציה stop codon על העמדות הנכונות.
  5. לאחסן את המתח עם הרצף הנכון ב-80 מעלות צלזיוס על ידי ערבוב µL 300-100% דימתיל סולפוקסיד ותרבות לילה 1 מ"ל.

2. הביטוי של החלבון Acetylated

  1. הוסף את הגנים של acetyllysyl אופטימיזציה-סינתזת המעביר33 וממוטב tRNAPyl 32 לתוך פלסמיד pTech . למקם את הגן המעביר tRNA תחת האמרגן מכוננת ל"י/נ . למקם את הגן tRNA תחת יזם קונסטיטוטיביות proK 34.
    1. שיתוף להפוך את וקטור ביטוי34 המכיל גן המכיל תגית מוטציה בנויים דהידרוגנאז, ו פלסמיד מחסה מערכת ההתאגדות acetyllysine ממוטבת, לתוך 25 µL המוסמכת המופשרים e. coli BL21(DE3) תאים על-ידי הלם החום 42 ° C s 10, ואת המקום על קרח במשך 5 דקות נוספות.
    2. פיפטה 600 µL של טמפרטורת החדר SOC מדיה לתוך התערובת דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ברעידות-סל ד 275, להפיץ µL 100 לצלחת עם סטרפטומיצין µg/mL 100 ו- 50 µg/mL כלורמפניקול, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-275 סל ד.
  2. לאסוף את מושבה בודדת מהצלחת, לחסן לתוך המדיה LB טריים 15 מ"ל עם 100 סטרפטומיצין µg/mL ו µg 50/mL כלורמפניקול 50 מ ל צינור לילה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות במהירות של 250 סל"ד. העברת התרבות לילה 15 מ"ל למדיה LB טריים 300 מ עם אנטיביוטיקה בבקבוקון 1 ליטר, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.
  3. להמיס acetyllysine עם מים כדי ליצור פתרון מניות 100 מ מ, לאחסן ב 4 º C. להוסיף acetyllysine 5 מ מ, 20 מ מ nicotinamide (מעכב של deacetylases) למדיה צמיחה ספיגת מגיע ל 0.5 על 600 ננומטר.
    1. לגדל תאים עבור h 1 נוספים 37 ° C, רועדת-250 סל"ד, ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ מ IPTG ביטוי חלבון, ולגדול תאים 25 ° c בן לילה, ברעידות-180 סל ד.
      הערה: התנאים ביטוי ייתכן שיהיה עליך אופטימיזציה עבור חלבונים שונים.
  4. איסוף תאים על ידי צריך שתוציאו ב x 3000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף תא כדורי עם פוספט באגירה מלוחים (PBS) המאגר (10 מ מ נה2HPO4, מ מ 1.8 ח'2PO4, מ מ 137 NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי). איסוף תאים שטף ב g 10,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ואחסן תא כדורי ב- 80 ° c

3. טיהור של החלבון Acetylated

  1. להפשיר את כדורי תא קפוא בקרח, וכן להשעות מחדש עם 15 מ"ל של מאגר פירוק (50 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 20 מ מ, 20 מ מ nicotinamide), 5 µL של β-mercaptoethanol, µL 1 Benzonase נוקלאז (250 יחידות).
  2. לשבור את התאים על ידי sonication 40 kHz-70% כוח פלט עם 10 מחזורים של 10 צרורות קצרים s, ואחריו במרווחים של 30 s לקירור כדי לחלץ גולמי טופס. צנטריפוגה גולמי לחלץ ב g x 20,000 עבור 25 דקות ב 4 º C. לסנן את תגובת שיקוע במסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר, לטעון לתוך עמודה המכילה 1 מ"ל של ניקל-nitrilotriacetic חומצה (Ni-נ) שרף equilibrated עם 20 מ של מים ו- 20 מ של פירוק מאגר.
    הערה: גם יכול להיות שבור תאים על ידי דטרגנטים קלים, אם sonication אינה זמינה.
  3. לשטוף את העמודה עם 20 מ של מאגר לשטוף (50 מ מ טריס pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 50 מ מ, 20 מ מ nicotinamide) ולאחר מכן elute עם 2 מ"ל • תנאי מאגר (50 מ מ טריס pH 7.8, 300 מ"מ NaCl imidazole 150 מ מ, 20 מ מ nicotinamide).
  4. Desalt השבר • תנאי עם desalting מאגר (25 מ מ טריס pH 7.8 ו-10 מ"מ NaCl) לפי העמודה PD-10, בעקבות המדריך של היצרן. מודדים את ריכוז החלבון eluted על-ידי ביצוע ההוראה מהתרכובת assay חלבון ברדפורד. החלבון desalted מוכן לניסויים נוספים.
    הערה: להפוך את 50% מניות גליצרול של החלבון, ולשמור ב-80 מעלות לאחסון.

4. איפיון ביוכימי של החלבון Acetylated

  1. ניתוחים ספקטרומטר מרחביות-דף והמסה.
    1. Denature חלבונים עם נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) דוגמת המאגר (5 µL חלבון דוגמה עם 2 µL 4 X מרחביות דוגמת המאגר) צינור 2 מ"ל ב 105 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, centrifuge את התערובת ב 2000 g x 10 s, עומס על גבי 4-20% נתרן dodecyl סולפט לזיהוי ג'ל electroph ג'ל oresis (מרחביות-עמוד), ריצה ב- 200 וולט למשך 30 דקות.
    2. לשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים ומנערים בעדינות במשך 5 דקות, חזרה על התהליך 3 פעמים. למחוק את המים, מכתים את הג'ל עם כתם כחול Coomassie עבור h 1 ברעידות עדין. מבטל את מכתים את הג'ל עם מים מזוקקים, ללחוץ בעדינות במשך 30 דקות, ואני חוזר זה מבטל את כתם 3 פעמים.
    3. חותכים את הלהקה kDa 33 על Coomassie blue מוכתמת הג'ל מרחביות-דף, ולשלוח אותו ספקטרומטר מסה מתקנים או חברות כדי לאשר ש-acetyllysine סופחה במיקום מעוצב.
      הערה: הפרוטוקול של ספקטרומטר מסה ניתוח בעקבות הניסוי הקודם34.
  2. סופג המערבי
    1. הפעל את הג'ל מרחביות-דף עם הפרוטוקול באותו שלב 4.1. לאחר הג'ל לרוץ, משרים את הג'ל עם מאגר העברה (25 מ מ טריס, מ מ 192 גליצין, pH 8.3 ו 20% מתנול) למשך 15 דקות.
    2. הפעלה של 0.2 µm, 7 ס"מ 8.5 ס"מ polyvinylidene difluoride (PVDF) קרום עם מתנול עבור 1 דקות, ולשטוף עם מאגר העברה לפני הכנת הכריך העברה.
      הערה: מתנול הוא מסוכן במקרה של מגע עם העור, קשר עין, בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.
    3. להפוך את הכריך העברה מקטודה כדי אנודת (ספוג נייר סינון, עמודים מרחביות ג'ל, PVDF ממברנה, נייר סינון, ספוג). להכניס את המחסנית למיכל העברה, להפעיל זרם קבוע של 350 mA למשך 45 דקות.
      הערה: זמן ההעברה עשוי להזדקק אופטימיזציה.
    4. לשטוף את הקרום PVDF עם 25 מ ל באגירה טריס מלוחים, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 מ מ NaCl, 20 מ מ. טריס, 0.1% Tween-20, pH 7.6) המאגר עבור חמש דקות עם טלטול עדין. לחסום את הקרום עם 5% שור אלבומין (BSA) במאגר TBST לשעה בטמפרטורת החדר.
    5. דגירה הקרום עם נוגדנים acetyllysine מצומדת HRP עם ריכוז סופי של 1 µg/mL מדולל עם 5% BSA ב- TBST ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול עדין.
      הערה: לקבלת תוצאות מהר יותר, שלב זה יכול להתבצע בטמפרטורת החדר מאובטח. הדילול של נוגדן עשוי להזדקק אופטימיזציה.
    6. לשטוף את הקרום עם 20 מ ל מאגר TBST עבור חמש דקות עם טלטולים עדינים, חוזרים על השלב 4 פעמים. להחיל את המצע chemiluminescence על הקרום לפי הוראות היצרן. ללכוד את האות עם imager המצלמה מבוסס תשלום מצמידים מכשיר (CCD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התשואה של חלבון MDH acetylated היה 15 מ ג לכל תרבות 1 ליטר, בזמן זה של פראי-סוג MDH היה 31 מ ג 1 ליטר תרבות. חלבונים מטוהרים נותחו על ידי עמודים מרחביות, כפי שמוצג באיור1. MDH פראי-סוג שימש בקרה חיובית34. חלבון מטוהרים מתאי מסתירים את המערכת ההתאגדות acetyllysine (AcK) ואת הגן המוטנטי mdh , אך ללא אישור בתקשורת צמיחה, שימש פקד שלילי. ליזין acetylation של חלבונים מטוהרים זוהה על-ידי המערב סופג שימוש acetyllysine-הנוגדן כמוצג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שילוב גנטי של חומצות אמינו noncanonical (ncAAs) המבוסס על דיכוי codon שהוקצו, בעיקר אמבר stop codon UAG36,37,38,39, על ידי סינתזת טעון-ncAA המכילה את anticodon המתאים. כידוע, codon UAG מזוהה על-ידי שחרור הפקטור-1 (RF1) של חיידקים, זה ניתן גם לדכא מאת ליד tRNAs cognate ממחשבים מארחים הנגבים על ידי חומצות אמינו קאנוני (cAAs) כגון ליזין וטירוזין40,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (AI119813), על הסטארט-אפ של אוניברסיטת ארקנסו, ופרס ממוסד החיים ארקנסו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בדיקת חלבון ברדפורדBio-Rad5000006ריכוז חלבון
4x Laemmli מאגר דגימהBio-Rad1610747SDS מאגר דגימה
Coomassie G-250 StainBio-Rad1610786SDS-PAGE צביעת ג'ל
4-20% SDS-PAGE ג'ל מוכןBio-Rad4561093קביעת חלבון
Ac-K-100 (HRP מצומד)תא איתות6952נוגדן
IPTGCHEM-IMPEX194משרה ביטוי
Nε -אצטיל-L-ליזיןCHEM-IMPEX5364חומצת אמינו לא קנונית
PD-10 עמודת התפלהGE Healthcare17085101התפלה
Q5 ערכת מוטגנזה מכוונת אתרNEBE0554היכרות עם תאי קודון העצירה
BL21 (DE3)NEBC2527מבטא זן
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106מיצוי פלסמידים
שרף Ni-NTAQIAGEN30210שרף טיהור זיקה
ניקוטינאמידסיגמא-אולדריץ'N3376מעכב דאצטילאז
&בטא;-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M6250חומר מפחית
באגבאסטר מיצוי חלבון מגיבסיגמא-אולדריץ'70584שבירת תאים
בנזונאז נוקלאזSigma-AldrichE1014DNase
ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106Chemiluminescence
Premixed LB BrothVWR97064מדיום גידול תאים
אלבומין בסרום בקרVWR97061-416חסימת כתמים מערביים

מקורות

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42(2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156(2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8(2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Pyrrolysyl tRNA SynthetaseAmberEscherichia coliWestern BlottingBL21 DE3

מאמרים קשורים